一种利用分子标记辅助选择高抗性淀粉水稻的选育方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用分子标记辅助选择高抗性淀粉水稻的选育方法。

背景技术：

糖尿病是当前最常见的都市病之一。据2013年权威部门发布的调查报告显示：中国成年人糖尿病患病率为11.6％，处于糖尿病前期的人占总人口的50.1％。也就是说，不到10个成年人中，就有一个糖尿病患者；每两个成年人中，就有一个属于糖尿病前期。糖尿病人须严格控制糖份的摄入量。

淀粉为人类食物和能量的主要来源，几乎占人类消费食品的30％和能量的60％～70％。其中抗性淀粉(resistantstarch，rs)是指“在健康个体的小肠中不能被吸收的淀粉或淀粉降解产物”，有着重要的生理功能。研究表明，人体在摄入抗性淀粉后可延缓餐后血糖上升，因此高抗性淀粉含量的食物能够有效控制糖尿病病情的发展；并且抗性淀粉能够降低餐后血糖和胰岛素应答，提高机体对胰岛素的敏感性，预防便秘和结肠癌的发生，降低血清中胆固醇和甘油三酯含量，降低和控制体重，促进矿物质吸收。高抗性淀粉饮食者与低抗性淀粉饮食者相比，具有较少的胰岛素反应，这对糖尿病患者控制餐后血糖值有很大影响，尤其对于非胰岛素依赖型病人，摄食高抗性淀粉食物，可延缓餐后血糖上升，有效控制糖尿病病情。它的发现及其研究进展，被fao和who认为是近年来碳水化合物与健康关系的研究中一项最重要的成果。正因为如此，抗性淀粉受到了营养学家和生理学家的普遍关注，成为功能性食品的研究热点。

在我国，水稻为传统主食，食用部分含有70％～80％的淀粉。但稻米中抗性淀粉的含量很低，热米饭中抗性淀粉的含量一般低于1％，冷米饭中抗性淀粉的含量也仅为l％～2.1％。高抗性淀粉水稻尤其适合习惯以大米为主食的糖尿病人群。但目前市面上糖尿病人专用的高抗性淀粉稻米比较少，价格昂贵，究其原因，一方面是因为缺乏相应的亲本来源，另一方面是传统的育种方法耗时耗力，导致该类新品种的培育难度大、周期长，从而使成本上升。通过对高抗性淀粉水稻的选育方法的改进，提高选育的效率，具有重要的意义。

中国专利cn102816778b公开了一种筛选高抗性淀粉含量的水稻品种的方法，定位了控制水稻rs含量的主效基因sbe-rs，该突变基因在对应于水稻淀粉分支酶sbe3基因第16外显子的第105位出具由t→c的碱剂突变，并且针对该位点开发了一个caps功能分子标记，为通过分子标记辅助选择技术或转基因手段培育高rs含量的高产水稻新品种提供理论了技术指导。但是由于caps分子标记设计及操作过程存在步骤繁琐，费用昂贵等一系列弊端，并且育种效率低。并且获得的水稻抗性淀粉含量较低。所以，研究一种操作方法简单有效，并且可以降低研发成本的育种方法是目前亟待解决的问题。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用分子标记辅助选择高抗性淀粉水稻的选育方法。本发明的选育方法得到的水稻，抗性淀粉含量显著高于已有的水稻品种，性状稳定；并且本发明提供的水稻选育方法操作简单，减少了抗性淀粉含量测定的规模和频率，降低了研发成本，缩短了育种的进程，提高了育种效率，节省了大量的人力物力，进一步提高了经济效益。

研究表明，水稻的抗性淀粉含量与直链淀粉含量存在明显的正相关关系。本发明收集了不同直链淀粉含量的水稻种质资源，测定其抗性淀粉含量，结果发现一些直链淀粉含量≥20％的品种，其抗性淀粉含量能达到高抗性淀粉的标准，因此本发明以直链淀粉含量为间接指标筛选高抗性淀粉水稻是可行的。同时，在第8染色体的ssr标记rm547附近存在一个影响抗性淀粉含量的位点。根据这个原理，本发明设计了以下技术方案：

一种利用分子标记辅助选择高抗性淀粉水稻的选育方法，包括以下步骤：

s1选取抗性淀粉淀粉含量高但农艺性状较差的水稻为母本，选取产量高、农艺性状好的水稻品种桂朝2号为父本，进行杂交，得f1代水稻植株；

s2通过对步骤s1所得f1代水稻植株与父本桂朝2号回交，得到bc1f1水稻植株；

s3将步骤s2所得bc1f1水稻植株通过ssr分子标记辅助选择，结合农艺性状以及抗性淀粉含量测定，筛选出抗性淀粉含量高的水稻，自交；重复以上筛选过程，自交5～6代，即培育出高抗性淀粉水稻gdrs1620。

进一步地，所述步骤s1中选取作为母本的水稻抗性淀粉含量≥5％。

进一步地，所述步骤s3中所述ssr分子标记辅助选择的步骤为：提取待检测植株的全基因组dna，以rm547为ssr分子标记辅助选择的引物进行pcr扩增，所得产物经8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，扩增出对应大小的分子标记片段。

进一步地，所述ssr分子标记辅助选择过程中的pcr扩增产物的分子标记片段的大小为235bp。

进一步地，所述ssr分子标记rm547所示的引物为：

rm547：f：taggttggcagaccttttcg

r：gtcaagatcatcctcgtagcg

进一步地，所述的pcr扩增的反应体系为：20μl反应体系包括0.15μmol/l引物，200μmol/ldntp0.4μl，1×pcr反应缓冲液2μl，50～100ng的dna模板2μl，1utaq酶0.1μl，双蒸水14.9μl；所述1×pcr反应缓冲液包括50mmol/lkcl水溶液，10mmol/ltris-hcl，ph8.3，1.5mmol/lmgcl2水溶液，0.01％明胶。

进一步地，所述的pcr扩增的反应程序为：dna95℃预变性5min后；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明提供的一种利用分子标记辅助选择高抗性淀粉水稻的选育方法，具有以下优势：

(1)本发明提供的一种利用分子标记辅助选择高抗性淀粉水稻的选育方法培育出的水稻品种，优质和高抗性淀粉兼顾，可以满足糖尿病人对高抗性淀粉含量稻米的需求，并且具有较强的实用性，能从膳食源头预防糖尿病的发生。

(2)本发明提供的一种利用分子标记辅助选择高抗性淀粉水稻的选育方法，通过ssr分子标记辅助选择，结合农艺性状以及抗性淀粉含量测定等多种结合的筛选方式，减少了抗性淀粉含量测定的规模和频率，降低了研发成本，缩短了育种的进程，提高了育种效率，并且培育的高抗性淀粉水稻综合农艺性状好，产量较原有亲本品种了大大提升，有较高的生产应用价值。

附图说明

图1为分子标记辅助选择rm547的电泳图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。

rm547的引物序列和dna模板合成于上海生工生物工程有限公司；taq酶购自北京杰辉博高生物技术有限公司；1×pcr反应缓冲液购自北京百奥莱博科技有限公司；dntp购自上海古朵生物科技有限公司。

实施例1一种利用分子标记辅助选择高抗性淀粉水稻的选育方法

所述利用分子标记辅助选择高抗性淀粉水稻的选育方法，包括以下步骤：

s12013年晚季，选取抗性淀粉含量≥5％但农艺性状较差的水稻gdrs1120-3为母本，以高产且农艺性状优良的水稻品种桂朝2号为父本进行杂交，得f1代水稻植株；

s22013年晚季，f1代水稻植株与桂朝2号回交，得到bc1f1水稻植株；

s32014早季，种植bc1f1代水稻植株，bc1f1代单株进行ssr分子标记辅助选择(本发明使用的ssr标记引物rm547的序列见表1)，筛选出含高抗性淀粉基因的杂合体植株自交得bc1f2代；

s42014年晚季，种植bc1f2代水稻植株，继续进行结合农艺性状选择和ssr分子标记检测，筛选出抗性淀粉含量高的水稻，自交，得bc1f3；

s52015年早季，种植bc1f3代30个单株，继续进行结合农艺性状选择和ssr分子标记检测，选择基因纯合株系，自交得bc1f4代；

s62015年晚季，种植bc1f4代水稻植株，继续进行ssr分子检测基因纯合单株并进行抗性淀粉测定，选择农艺性状稳定的优良株系，自交得bc1f5代，即培育出高抗性淀粉水稻，2016年早季种植大区进行生产试验，命名为gdrs1620。

表1ssr标记引物rm547的序列

进一步测量本实施例培育所得的gdrs1620品种的农艺性状，结果为：株高106.4cm，穗长21.4cm，每穗粒数130，结实率87.7％，千粒重21.9g，有效穗214万/hm²。说明本发明的育种方法得到的gdrs1620农艺性状优良，结实率高。

实施例2ssr分子标记辅助选择和pcr检测电泳分析

(1)ssr分子标记辅助选择

提取待检测植株的全基因组dna，以rm547为ssr分子标记辅助选择的引物进行pcr扩增。

pcr扩增反应体系为：20μl反应体系包括0.15μmol/l上下游引物各0.3μl，200μmol/ldntp0.4μl，1×pcr反应缓冲液2μl，80ng的dna模板2μl，1utaq酶0.1μl，双蒸水14.9μl；所述1×pcr反应缓冲液包括50mmol/lkcl水溶液，10mmol/ltris-hcl，ph8.3，1.5mmol/lmgcl2水溶液，0.01％明胶。

pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min后；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸10min。

(2)pcr检测电泳分析

将pcr扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电压为110v，时间为120min，最后在紫外凝胶成像仪上观察。

(3)检测结果

引物rm547的分子标记辅助选择的电泳图的部分结果如图1所示。其中，1～5，8～10，12～14为含有所需目标位点的电泳带。

实施例3抗性淀粉测定方法

(1)样品制备：准确称量100mg样品置于带盖的试管中，加入4.0ml胰α-淀粉酶(10mg/ml)液(含amg3u/ml)，充分混合后，在37℃的水浴中振荡16h。加入4.0ml无水乙醇，充分混匀，3000r/min离心10min，弃上清液，加入4.0ml无水乙醇，充分混匀，再加入6.0ml50％的ims，3000r/min离心10min，弃上清液(可多次重复上述醇洗步骤以达到最佳效果)。倒置离心管，用吸水纸除去多余的脂肪。

(2)测定：在试管分别加入2mlkoh溶液(2m/l)，待沉淀完全溶解(注意避免乳化)后置于冰浴中约20min，加入8mlph＝3.8的乙酸钠缓冲液(1.2m/l)，立即加入0.1mlamg溶液(3300u/ml)，混匀后放在50℃的水浴中反应30min，间隔要多次充分混匀。冷却至室温后在3000r/min下离心10min。取0.1ml上清液加入3mlgopod酶试剂，在50℃水浴中保温显色20min，用分光光度计在510nm波长下测定样品的吸光度以及葡萄糖标准样吸光度f。

(3)rs含量计算：rs含量(g/100g)＝e×f×10.3/0.1×100/w×162/180×10^-3，其中e为样品吸光度与空白的差值，f为0.1mg标准葡萄糖的吸光度，10.3/0.1为体积校正系数，100/w为样品质量转换系数，162/180为游离葡萄糖与脱水葡萄糖之间的换算系数。

实验例一、后代株系抗性淀粉含量测定

1.实验材料：杂交亲本及其各子代植株。

2.实验方法：与实施例3的测定方法类似。

3.实验结果

实验结果如表2所示。

表2后代株系抗性淀粉含量测定(％)

由表2可知，杂交五代后培育的gdrs1620水稻品种，精米粉煮沸20分钟冷却到室温测定其抗性淀粉含量为7.630％，精米粉煮沸20分钟冷却到室温放4℃冰箱24h后其抗性淀粉含量为9.029％，说明本发明的选育方法培育的高抗性淀粉水稻中抗性淀粉含量高。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。