本发明涉及水产品运输领域，尤其涉及一种海水鱼的有水保活运输方法。
背景技术：
石斑鱼（epinephelus）隶属于鮨科（serranidae），为暖水性鱼类，栖息于热带、亚热带海域，主要养殖于我国海南、广东、福建及浙江沿海地区。石斑鱼因其蛋白质含量高、脂肪含量低且含有多种必须氨基酸、无机盐和各种维生素，且肉质细嫩、口感佳，而深得消费者青睐，具有较高的市场价值和消费需求，是一种经济上重要的海鱼。
根据中国渔业统计年鉴近年来数据显示，海南、广东和福建是大陆地区主要养殖石斑鱼的省份，其总养殖量占中国养殖量95％，且在2015年占世界石斑鱼总养殖量的80％以上，并呈逐年增长的趋势，不仅仅满足国内消费者的需求，还大量出口满足国外消费者的需求，且消费者越来越注重石斑鱼活鱼品质，因此石斑鱼活体运输技术尤为重要。为保证石斑鱼活体运输到达更多更远的地方，多选择有水活运，期间鲜活石斑鱼常常会因为水体温度、盐度、氨氮、溶解氧含量等因素的变化而发生运输应激，无论是轻度应激还是重度应激均会对鱼体免疫功能、抗氧化功能、存活率产生不同程度的影响。
在鲜活鱼体有水活运过程中，温度和盐度作为基础环境因子，亦是诱发运输应激主要应激源。过高或过低的温度、盐度会引发鱼体应激反应，使鱼体内环境失衡，影响其免疫功能。一般通过测定鱼体血清中皮质醇（cor）、血糖（glu）含量变化来评价鱼体发生应激反应的程度，进而评价鱼类生理机体健康状况。除此以外，热休克蛋白（hsp70）也是反应鱼体受到应激反应程度的重要指标，从基因分子水平角度出发，当鱼体受到应激源刺激时，hsp70的转录表达水平会发生改变，从而修复和降解改变或变性的蛋白，起到指示应激反应的作用。
目前，国内外学者大多从免疫功能、抗氧化功能评价等角度研究了不同鲜活鱼类有水运输的最佳温度、盐度，但还没有研究温度、盐度对鱼类有水活运的交互影响。
技术实现要素：
本发明所要解决技术问题是研究温度和盐度的变化以及两者之间的交互作用对鱼体中的血清、肝中的皮质醇、血糖和热休克蛋白的影响，探索适宜海水鱼有水活运的工艺，降低活运过程中石斑鱼代谢、运输应激反应的温度和盐度组合，为海水鱼有水活运工艺提供理论依据。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术措施来实现：
本发明的特征在于具体操作步骤：
（1）暂养：运输前1~12d暂养，在暂养池中加入维生素c，浓度为20~35mg/l，水温为22~23℃，暂养密度1尾/50l；暂养用水：由经颗粒活性炭过滤后曝气的自来水和海盐配制而成，实验开始前一天配制，连续曝气24h后用于实验；暂养水的水温27℃、盐度10‰～30‰、溶解氧4～6mg/l、ph7.5～8.5；
（2）运输箱的温度调节：运输前按0.1~1℃/h温度改变速率将活鱼运输箱的水温从27℃调节至最适宜的温度15~27℃；
（3）运输：将水族箱放置在低温冷藏运输车上进行运输，运输过程中低温冷藏车的温度保持水族箱要求的温度15~27℃，水族箱中水的盐度为10‰～30‰。
运输箱中的水的温度为16℃，盐度为26‰。
运输前按0.1℃/h温度改变速率将活鱼运输箱的水温从27℃调节至最适宜的温度16℃。
本发明可以降低海鱼的血清皮质醇、血糖浓度、hsp70表达量等，大大降低海鱼运输过程中引发的应激反应，极大提高存活率，对于海水鱼的保活运输具有极其重要的意义。
具体实施方式
为使本发明实现的操作流程与创作特征易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
材料与方法
1.1材料
试验所用石斑鱼购自上海市浦东新区芦潮港，选取同一批体质健康无伤病，平均体长为（27.50±1.55）cm，平均体重为（500±120）g，加水充氧运输至实验室，将其暂养于实验室120l的养殖池中，停食暂养7天，其间连续曝气，暂养期间每日50％换水。
1.2仪器与设备
lx-100vtr模拟运输振动台上海鲁轩仪器设备厂；迈瑞bs-200全自动生化分析仪深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；sh-1000lab-全波长酶标仪北京宏昌信科技有限公司；水族箱三合一曝气机；f2640型多点温度采集仪美国fluke公司；5810r高速冷冻离心机上海艾测电子科技有限公司；全自动循环水冷机广东海利集团。
1.3试验方法
1.3.1温度对有水活运过程中石斑鱼运输应激的影响
将石斑鱼购回后，将其停食暂养于实验室水族箱48h，水温为27℃，盐度为20‰，空气泵充氧。暂养后将其分为10℃、15℃、21℃、27℃、30℃共五组，每组试验用鱼为20条，分别置于五个不同的120l水族箱，以2℃/h降温速率进行降温直至试验温度，试验开始后将水族箱放置模拟振动台上弱振，并在运输0、3、10、17、24、48h观察其存活率并取样，取样时采用1次性无菌注射器尾动脉抽血，静置30min，4℃下6000r/min离心15min取其血清，放入-80℃冰箱保存；在无菌操作台内用已消毒的剪刀和镊子取其肝脏组织后放入-80℃冰箱保存，并尽快试验防止rna降解。
1.3.2盐度对有水活运过程中石斑鱼运输应激的影响
将石斑鱼购回后，将其停食暂养于实验室水族箱48h，水温为27℃，盐度为20‰，空气泵充氧。暂养后将其分为5、10、20、30、40‰共五组盐度，每组试验用鱼为20条，分别置于不同的120l水族箱，试验期间控制温度不变，取样方式同1.3.1。
1.3.3皮质醇浓度的测定
采用南京建成生物工程研究所的鱼皮质醇elisa试剂盒。
1.3.4血糖浓度的测定
采用葡萄糖氧化酶法测定。
1.3.5热休克蛋白（hsp70）相对表达量的测定
按照上海捷瑞动物总rna快速提取试剂盒中说明书操作，提取石斑鱼总rna；用takara反转录试剂盒将提取的总rna反转录为cdna；采用premier5.0引物设计软件设计内参基因和目标基因引物，运用sybrpremixextaqtm（takara）试剂盒在荧光定量pcr仪上进行定量实验。荧光定量pcr反应以20μl体系重复2次。
反应程序为：95℃30min；95℃5s，60℃30s，40个循环。做熔解曲线确保目的基因特异性扩增，熔解曲线程序为95℃15s，60℃1min，以每秒0.3℃上升到95℃，95℃15s。本试验所测目的基因和参比基因全长序列由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心提供，所有引物均由上海生物工程研究所合成。
1.3.6响应面试验
在正式实验开始前通过单因素实验筛选出适宜石斑鱼有水活运的温度、盐度范围。本试验采用中心复合法和响应曲面法研究温度和盐度对石斑鱼运输应激的联合效应，其中，将葡萄糖（glu）、皮质醇（cor）和热休克蛋白（hsp70）作为响应指标，试验中温度（t）范围为15~27℃，盐度（s）范围为10~30‰，将每个试验因子进行水平编码分别为-α、-1、0、1、α（|α|=1.414）。试验采用2因素5水平，由系统将温度和盐度随机交叉组合形成13组试验（表3），其中，中心点重复5次，试验平行进行3次。
1.4数据处理
试验数据由originpro2016、spss21.0、dsign-expert8.06等软件进行分析处理。
其中，响应面试验数据结果采用平均值±标准差表示。试验采用ccd设计，自变量为温度和盐度两个因子，因变量为皮质醇（cor）、葡萄糖（glu），建立二次回归方程模型为：
y=b0+b1t+b2s+b3t×s+b4t2+b5s2
式中，y为响应变量（cor、glu和hsp70），t代表温度，s代表盐度，b0为回归常数，b1、b2分别为温度、盐度一次效应系数，b3为温度、盐度互作效应系数，b4、b5为温度、盐度二次效应系数。一次效应是指因变量与自变量间呈线性关系，二次效应是指因变量与自变量间呈非线性关系。
2结果与分析
2.1温度对运输过程中石斑鱼运输应激及存活率的影响
2.1.1温度对运输过程中石斑鱼存活率的影响
温度是石斑鱼有水活运工艺的关键环境因子，严格控制运输水温度是有水保活工艺研究的基础，外界温度的波动会直接影响鱼体生理变化，影响鱼体的代谢速率，从而损伤机体，严重时会导致鱼体死亡，直接影响其存活率。表1显示了石斑鱼在不同温度与保活时间时的存活率。运输温度为10℃时，石斑鱼有水活活运开始后出现死亡，运输时长仅为3h；运输温度为15℃时，石斑鱼有水活运48h内存活率均为100％，48h后个别鱼体开始死亡，当运输72h时，存活率为95％；运输温度为21℃时，石斑鱼有水活运24h内存活率均为100％，其后开始死亡，在运输48h和72h后，其存活率分别为95％和85％；当运输温度为27℃时，石斑鱼有水活运24h内存活率均为100％，其后逐渐死亡，在运输48h和72h后，存活率逐渐降低至75％，其水平整体低于21℃运输环境下的存活率；当运输温度为30℃时，石斑鱼有水活运17h后出现个体死亡现象，且随着保活时间的延长，存活率迅速降低，保活48h时存活率仅为50％，直至保活72h完全死亡，由此可见，有水活运环境温度过高或过低均不利于石斑鱼存活，石斑鱼较适宜的有水活运温度范围为15~27℃。宋志明[17]研究了温度对暖水性鱼类点篮子鱼幼鱼生长和代谢的影响，表明温度在19~31℃范围内，其存活率均达到95％以上，与本研究结论相近。
表1石斑鱼在不同温度与保活时间时的存活率
2.1.2温度对运输过程中石斑鱼血清皮质醇含量的影响
皮质醇是反应鱼体应激的指示性指标，当鱼体发生应激反应时，会引起鱼体内各项激素水平的变化，而皮质醇则是反应链中分泌的最后一种激素，随着应激强度的增大，皮质醇含量也会不同程度上升。15℃、21℃、27℃、30℃组石斑鱼血清皮质醇含量均在运输3h后显著上升（p＜0.05），后随运输时间延长呈下降趋势，在石斑鱼有水活运3h时，30℃组石斑鱼血清皮质醇含量显著高于其余三组（p＜0.05），说明高温使石斑鱼产生了剧烈的应激反应，分泌大量皮质醇；15℃组石斑鱼血清皮质醇含量显著低于其余三组（p＜0.05），低温使石斑鱼处于半休眠状态，其新陈代谢活动、分泌激素能力均比其余组石斑鱼较弱；21℃组与27℃组并无显著性差异；总体而言，随着温度降低，皮质醇含量呈下降的趋势，由此，石斑鱼较适宜的有水活运温度范围为15~27℃。
2.1.3温度对运输过程中石斑鱼血糖浓度的影响
血糖为鱼体生命活动和新陈代谢的能源提供原料，当鱼体受到外界刺激时，产生应激反应，生命活动剧烈、新陈代谢旺盛会使鱼体血糖浓度上升，当应激反应持续时间延长，鱼体不断消耗能量，则鱼体内的血糖则被不断分解用以能量的供给，因而血糖浓度亦是鱼类应激反应的指示性指标。四组不同温度运输组鱼体内血糖浓度均呈先上升后下降的趋势（p＜0.05），并在运输10h时血糖浓度达到最大，15℃组鱼体在运输10h时血糖浓度显著低于其余三组（p＜0.05），且随着运输时间的延长血糖浓度下降，下降速率显著低于其余三组（p＜0.05）；30℃组鱼体在运输10h时血糖浓度显著高于其余三组（p＜0.05），且下降速率显著高于其余三组（p＜0.05），由此说明，随着石斑鱼有水活运水温升高，石斑鱼应激反应愈强烈，不宜进行长途运输，水温在鱼体可耐受范围内越低，使鱼体达到半休眠状态，可减弱其生命活动和新陈代谢，有助于长途运输。
2.1.4温度对运输过程中石斑鱼热休克蛋白（hsp70）表达量的影响
热休克蛋白70是应激时常被研究的指示性指标，它能促进新生多肽链的折叠，并促进变异或变性的蛋白质修复和降解，在鱼类中，当鱼体发生应激反应时会促进hsp70转录，hsp70水平的升高有助于保护细胞免受应激源刺激损伤，从而保护机体免受损伤，提高鱼体存活率。四组不同运输温度组石斑鱼肝脏hsp70转录水平随着运输时间的延长呈先上升后下降的趋势（p＜0.05），且在运输至17h时hsp70转录量达到最大；30℃运输组，石斑鱼肝脏hsp70转录水平显著高于其余三组，且17h后hsp70转录水平逐渐恢复但并未恢复到初始水平，说明该温度组不适宜用于石斑鱼有水活运工艺的温度；15℃运输组，石斑鱼肝脏hsp70转录水平显著低于其余三组（p＜0.05），且变化范围较小并在运输17h后hsp70转录水平逐步恢复至初始状态，说明其应激反应较弱，适宜用于石斑鱼有水活运工艺温度的研究；21℃运输组和27℃运输组石斑鱼肝脏hsp70转录水平均在上升后逐步恢复至初始状态，具备石斑鱼有水活运工艺研究条件，因此选取15~27℃温度范围作为保活工艺研究的温度范围。
2.2盐度对运输过程中石斑鱼运输应激及存活率的影响
2.2.1盐度对运输过程中石斑鱼存活率的影响温度20度
表2石斑鱼在不同盐度与保活时间时的存活率
表2显示了石斑鱼在不同盐度与保活时间的存活率，当石斑鱼活运水盐度为5‰时，开始运输时即出现鱼体死亡现象，运输时间不到3h鱼体全部死亡；当石斑鱼活运水盐度为10‰和20‰时，活运24h内存活率为100％，运输24h后鱼体开始出现死亡现象，运输至48h时存活率均为95％，72h时存活率分别为85％和90％；当石斑鱼活运水盐度为30‰时，运输17h后鱼体开始出现死亡现象，运输至48h，其存活率均在90％以上；当石斑鱼活运水盐度为40‰，运输10h后即开始出现个体死亡现象，运输至48h、72h后，其存活率仅为50％和10％，不推荐作为活运水适宜盐度范围内，综上可见，石斑鱼有水活运的适宜盐度范围为10~30‰。盐度作为有水活运工艺研究中重要的环境因子，应严格控制其变量。
2.2.2盐度对运输过程中石斑鱼血清皮质醇含量的影响
四组不同盐度运输水组的石斑鱼血清皮质醇含量均在运输3h时显著升高（p＜0.05）后随运输时间的延长呈下降趋势；40‰组石斑鱼血清皮质醇整体水平显著高于其余三组石斑鱼血清皮质醇水平（p＜0.05），说明其应激反应强烈，新陈代谢旺盛，该盐度水平不适于石斑鱼有水活运工艺；10‰、20‰、30‰三个不同盐度组石斑鱼的血清皮质醇整体水平随盐度的增高而降低，说明高盐度组的鱼体应激水平显著低于低盐度组鱼体应激水平（p＜0.05），由此可见，石斑鱼有水活运适宜的运输水盐度范围为10~30‰。
2.2.3盐度对运输过程中石斑鱼血糖浓度的影响
适宜的盐度可降低鱼体应激反应，提高其存活率。石斑鱼有水活运过程中鱼体血糖浓度均随运输时间的延长呈先上升后下降的趋势，20‰组鱼体血糖浓度整体显著低于其余三组（p＜0.05），且变化速率缓慢，变化不明显，说明低盐度组石斑鱼应激反应较弱，生命活动、新陈代谢水平较弱，适宜中长途运输；40‰组鱼体血糖浓度整体显著高于其余三组（p＜0.05），且变化速率快，说明过高盐度会刺激石斑鱼引发剧烈应激反应，新陈代谢旺盛，不利于石斑鱼中长途运输；10‰组和30‰组血糖浓度整体水平介于20‰组和40‰组之间，因此选取10‰~30‰作为石斑鱼有水活运工艺盐度研究的范围。
2.2.4盐度对运输过程中石斑鱼热休克蛋白（hsp70）表达量的影响
四组不同盐度处理下的运输组，石斑鱼肝脏hsp70表达量均随运输时间的延长呈先上升后下降的趋势（p＜0.05），且随着盐度的升高，hsp70表达量逐渐降低。40‰运输组整体hsp70表达量显著高于其余三组，且在运输17h后hsp70表达量逐渐下降，并未在运输48h时恢复至初始状态，说明石斑鱼经过低盐度水刺激产生应激反应后受到不可逆的机体损伤，因此不符合石斑鱼有水活运工艺盐度因子研究要求；30‰运输组石斑鱼肝脏hsp70表达量整体显著低于其余三组（p＜0.05），且在有水活运48h内并无显著变化，并在运输17h后肝脏hsp70表达量随运输时间延长逐渐下降并恢复至初始水平，说明石斑鱼在有水活运过程中并未发生明显应激反应，处于半休眠状态有利于活鱼运输；10‰和20‰组石斑鱼肝脏hsp70表达量介于30‰和40‰组之间，且均在运输48h后恢复至初始状态，因此，在研究石斑鱼有水活运工艺中盐度范围选择10~30。由于石斑鱼肝脏hsp70表达量随着盐度的增大呈下降趋势，两者呈线性关系，并不适合在后续实验中作为响应面试验设计的响应值，即可作为单一实验的指示性指标，从该单因素试验可知，30‰盐度更适于石斑鱼有水活运的盐度条件。
2.3响应面优化石斑鱼有水活运的温度、盐度条件
根据单因素试验分析，选取温度15~27℃、盐度10‰~30‰作为响应面试验因素范围，响应值为皮质醇含量、血糖浓度，采用ccd法设计试验，试验方案及结果见表3。
表3温度与盐度的试验设计组合结果
2.3.1温度和盐度对运输过程中石斑鱼血糖浓度的影响
根据designexpert8.0软件对表3试验结果进行多元回归拟合，得到血糖（glu）对温度（t）和盐度（s）的二次多项回归方程为：
glu(mmol·l-1)=4.58+1.45*t-1.95*s-1.20*t*s-0.70*t2+0.098*s2
表4为温度和盐度对石斑鱼血糖浓度的方差分析表，表中显示所建立的模型p＜0.0001极显著（p＜0.001），说明建立的模型有效。失拟项f=6.38，p＞0.05表明拟合方程有效，且该方程的决定系数为0.9766，校正系数为0.9599，说明该方程拟合度极高，所选模型准确。
表4温度和盐度对运输过程中石斑鱼血糖浓度的回归模型方差分析
表5为回归方程系数显著性检验，其置信下限95％为4.11，置信上线95％为5.04。一次项s、t回归系数均极显著，说明温度、盐度均对有水活运过程中石斑鱼血糖浓度有极其显著的影响；交互相st回归系数极显著，说明温度和盐度的交互作用对有水活运过程中石斑鱼血糖浓度有极其显著的影响；二次项t2回归系数极显著，说明温度的二次效应对有水活运过程中石斑鱼血糖浓度影响极其显著；二次项s2回归系数不显著，说明盐度的二次效应对有水活运过程中石斑鱼浓度基本无影响。
表5温度和盐度回归方程系数显著性检验
根据所绘制的温度和盐度对有水活运过程中石斑鱼血糖浓度影响的响应曲面图可知：温度和盐度对血糖浓度的交互作用明显，当盐度一定时，石斑鱼血糖浓度随温度升高呈先下降后上升的趋势；当温度一定时，随着盐度的升高呈上升趋势。温度为16.76℃、盐度为26.50时，血糖浓度最低为1.82852mmol/l，其可靠性为0.936。
2.3.2温度和盐度对运输过程中石斑鱼皮质醇含量的影响
根据designexpert8.0软件对表3试验结果进行多元回归拟合，得到皮质醇（cor）对温度（t）和盐度（s）的二次多项回归方程为：
皮质醇(ng·l-1)=41.06+12.87*t-17.67*s-10.88*t*s-5.90*t2+0.95*s2
表6为温度和盐度对石斑鱼皮质醇含量的方差分析表，表中显示所建立的模型p＜0.0001极显著（p＜0.001），说明其建立的模型有效。失拟项f=5.39，p＞0.05表明拟合方程有效，且该方程的决定系数为0.9755，校正系数为0.9580，说明该方程拟合度极高，所选模型准确。
表6温度和盐度对运输过程中石斑鱼皮质醇含量的回归模型方差分析
表7为回归方程系数显著性检验，其置信下限95％为36.78，置信上线95％为45.33。一次项s、t回归系数均极显著，说明温度、盐度均对有水活运过程中石斑鱼血清皮质醇含量有极其显著的影响；交互相st回归系数极显著，说明温度和盐度的交互作用对有水活运过程中石斑鱼血清皮质醇含量有极其显著的影响；二次项t2回归系数极显著，说明温度的二次效应对有水活运过程中石斑鱼血清皮质醇含量影响极其显著；二次项s2回归系数不显著，说明盐度的二次效应对有水活运过程中石斑鱼血清皮质醇含量基本无影响。
表7温度和盐度回归方程系数显著性检验
温度和盐度对有水活运过程中石斑鱼血清皮质醇含量影响的响应曲面图，且该曲面较陡，说明温度和盐度对血清皮质醇含量的交互作用明显，当盐度一定时，石斑鱼血清皮质醇含量随温度升高呈上升的趋势；当温度一定时，石斑鱼血清皮质醇含量随着盐度的升高呈下降趋势。温度为16.76℃、盐度为26.74时，血清皮质醇含量最低为16.442ng/l，其可靠性为0.928。
2.4优化工艺的确定和验证试验
综上可知，石斑鱼有水活运工艺最优温度条件为16.76℃、盐度条件为26，在该试验条件下石斑鱼血清皮质醇含量为16.442ng/l，血糖浓度为1.82852mmol/l。根据实际可操作性，将其修正为：温度16℃、盐度26。在修正的优化条件下进行试验验证，试验平行3次，得到的石斑鱼血清皮质醇为（15.834±1.065）ng/l，血糖浓度为（1.934±0.165）mmol/l，与预测值比较接近，说明响应面法对石斑鱼有水活运工艺优化是稳定可行的。
经本发明的保活工艺处理后，可以显著降低血清皮质醇、血糖浓度、hsp70表达量，降低在运输过程中引发的应激反应，提高成活几率。本发明运输后成活率高，可以大幅降低运输成本。因此对于保活运输具有积极的意义。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。