本发明涉及松材线虫，尤其涉及一种制备无菌松材线虫的方法。
背景技术：
松材线虫病是目前世界上最危险的林业病害之一，感病松树在极短的时间内枯萎死亡，一片林地因发病而迅速成为荒山，中国大陆从1982年最初在南京中山陵几棵松树的发病到现在已蔓延到我国的大部分省市，防控形势严峻。
松材线虫病致病机制是揭示病害发生规律和控制病害的重要内容，松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)与伴生细菌的协同致病是近年来的研究热点和焦点，其要点是松材线虫不能单独致病，松材线虫与其携带的伴生细菌被认为通过协同致病而导致树木死亡(张建平，贺芳，金灿等.松材线虫的伴生细菌研究进展[eb/ol].北京：中国科技论文在线[2016-09-02].http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201609-24.)。因此无菌松材线虫是开展松材线虫与其伴生细菌的协同致病机制研究的重要材料。
以往研究认为，伴生细菌只存在于松材线虫的体表，一般认为和实际的做法是通过对虫体的体表消毒可获得无菌松材线虫。张建平首次证明松材线虫无法通过消毒获得真正的无菌松材线虫，首次证明伴生细菌还可存在于松材线虫体内(张建平,赵博光.在低温下消毒剂对松材线虫的选择毒性(英文)[j].南京林业大学学报(自然科学版),2010,34(03):177-178.)，但经除菌处理后的松材线虫带菌量极少。尽管现有技术中报道了一些无菌松材线虫的制备方法，但是仍存在以下问题，如：一次分离的松材线虫数量不同，愈伤组织制备难度相对较高，取卵方法较为复杂，数量有限等问题。
松材线虫与伴生细菌的协同致病是松材线虫病研究的重要方面，，根据松材线虫带菌特点，创制可靠有效的获取无菌松材线虫的方法很有必要。
技术实现要素：
发明目的：为解决现有技术中无法快速、有效、大量获得无菌松材线虫的问题，本发明提供了一种制备无菌松材线虫的方法。
技术方案：一种制备无菌松材线虫的方法，包括：
(1)用微孔滤膜包裹含真菌培养液的多孔基材，得到培养包，其中所述的真菌培养液中含有抑制或杀灭细菌剂，微孔滤膜的膜孔孔径小于1μm；
(2)将培养包灭菌，然后在培养包内接种和培养松材线虫的食料真菌；
(3)将经表面灭菌的松材线虫接入生长有食料真菌的培养包内进行培养；
(4)培养结束后，从培养包内分离松材线虫，进行表面灭菌后得到无菌松材线虫。
所述微孔滤膜需透气、透水，选自聚四氟乙烯微孔滤膜、硝酸纤维素微孔滤膜、醋酸纤维素微孔滤膜、混合纤维素滤膜中的一种。所述微孔滤膜的孔径小于1μm，例如0.22、0.45μm，可防止真菌及松材线虫通过微孔逸出。
所述多孔基材表面亲水，有大的表面积，对生物无毒无害。所述多孔基材选自木屑如松木屑/杨木屑等、珍珠岩、耐高温海绵(防止高温灭菌时多孔结构被破坏)中的一种或几种。
所述抑制或杀灭细菌剂选自孟加拉红、孔雀绿或抗生素中的一种或几种。其中相较于抗生素，孟加拉红、孔雀绿的效果更佳，稳定性好，实验可控性强。
真菌培养液中，抑制或杀灭细菌剂的质量分数为0.1～0.001％。真菌培养液可以为任何培养所述食料真菌的培养液，如pd培养液；用热水或冷水浸提植物获植物浸提液，加入或不加入糖。
所述食料真菌为可供松材线虫食用的真菌如灰孢霉、松枯梢病菌等。
真菌培养液与多孔基材的质量比为1～5：1。
每个培养包重10～25g。
在培养包内接种和培养松材线虫的食料真菌的方法包括：将松材线虫的食料真菌从培养包封口部位的缝隙处无菌操作接入，15～25℃培养。
将经表面灭菌的松材线虫接入培养包内进行培养的方法包括：待培养包微孔滤膜可见霉菌印迹时(当可见菌丝印迹在培养包外的滤膜上约为一半时)，从培养包封口部位的缝隙处无菌操作接入经表面灭菌的松材线虫，每培养包接种松材线虫100～5000条(进一步如500～2000条)，20～25℃培养5～10天。培养5～10天的时间可以保证松材线虫繁殖一代，还可避免时间过长因食物短缺而死亡。
所述的松材线虫分离方法为贝尔曼漏斗法。
所述松材线虫表面灭菌的方法包括：将松材线虫加入杀细菌剂溶液中震荡，然后以无菌水冲洗虫体，其中杀细菌剂溶液可以是过氧化氢、次氯酸钠、升汞等试剂的低浓度溶液(质量分数为0.05～10％)，如过氧化氢质量分数为3～10％，次氯酸钠质量分数为4％，升汞质量分数为0.1％。
原理：松材线虫体表带有大量细菌但能被容易和完全去除，松材线虫体内有极少量的细菌但无法去除，本发明利用常规的对松材线虫的表面灭菌处理方法，去除全部的体表细菌，消除了可经少量进入松材线虫体内的外部细菌的来源，而利用培养包内特殊的结构和成分，抑制和杀死了从松材线虫体内可能释放出的极少量细菌(培养包内的抑制或杀灭细菌剂可以尽可能杀灭培养包存在或释放在培养包内的细菌；多孔基材具备的多孔道结构为松材线虫的活动提供了充分的空间，利于其生长，相较于平整的培养表面，多孔道结构带来的大表面积减少了线虫与细菌的接触概率或接触量)，随着新一代松材线虫的出生和繁殖，经培养后松材线虫无菌，或即使带少量细菌，再经体表除菌处理，可获得完全无菌的松材线虫。
有益效果：
(1)培养包材料广泛，装置简易，制备容易。
(2)全部操作方法没有特殊要求，获得的无菌松材线虫稳定可靠。
(3)无菌松材线虫培养数量多。由常规获得的大量松材线虫经本法再培养和处理后可获大量无菌松材线虫，便于开展对松材线虫与伴生细菌互作关系的研究。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
一种制备无菌松材线虫的方法，包括：
1制作培养包
按照常规pda培养基配方但不加入琼脂，制备pd液，加入孟加拉红，使其在培养基中含0.0033％(w/w)，即得本法的真菌培养液。以真菌培养液：木屑＝3︰1(w/w)的比例，将真菌培养液拌入松树的木屑中混匀，用0.22μm孔径的混合纤维素细菌滤膜(硝酸-醋酸混合纤维素酯微孔滤膜)包裹之，培养包重15g，加压灭菌备用。
2培养松材线虫的食料真菌
用松枯梢病菌(松色二胞菌)从培养包的封口部位的缝隙处接种入培养包，25℃培养4天。
3松材线虫体表除菌
用无菌水配制3％过氧化氢溶液，加入常规培养分离的松材线虫，50转/min轻微震荡10min，立即用无菌水清洗。
4无菌松材线虫培养
当可见菌丝印迹在培养包外的滤膜上约为一半时，从培养包上接种食料真菌的缝隙处，用移液枪加入200μl经3％过氧化氢除菌处理的松材线虫液，每个培养包加入松材线虫1500条，25℃培养8天。
5无菌松材线虫获取
打开和去除培养包外的滤膜，用贝尔曼漏斗法分离出多孔基材内的松材线虫，依照第3步方法对松材线虫做除菌处理，即得无菌松材线虫6000～20000条。
6松材线虫带菌状况验证
取无菌松材线虫1000～2000条，加无菌水无菌研磨，将研磨液涂牛肉膏蛋白胨培养基平板培养或液体培养基震荡培养，20～37℃培养5天，平板上没有菌落或液体培养基清澈，表明该批次松材线虫完全无菌。
实施例2
与实施例1类似，与其不同的是，真菌培养液的植物原料来自红薯(即用红薯代替马铃薯)，采用这一方法可以获得无菌松材线虫6000～20000条。
实施例3
与实施例1类似，与其不同的是，真菌培养液中加入孔雀绿，使其在培养基中含量为0.001％(w/w)，采用这一方法可以获得无菌松材线虫6000～20000条。
实施例4
与实施例1类似，与其不同的是，培养包内的多孔基材为杨树木屑，采用这一方法可以获得无菌松材线虫6000～20000条。
实施例5
与实施例1类似，与其不同的是，培养包内的多孔基材为珍珠岩，采用这一方法可以获得无菌松材线虫6000～20000条。
实施例6
与实施例1类似，与其不同的是，培养包的滤膜为孔径0.45μm的聚四氟乙烯微孔滤膜，采用这一方法可以获得无菌松材线虫6000～20000条。