一种塔黄的野外种群恢复方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物的种苗繁育方法，更具体地，涉及了一种濒危的极具观赏价值和药用价值的大黄属植物——塔黄的野外种群恢复方法。

背景技术：

塔黄(rheumnobile)是蓼科大黄属植物，因其在开花时会发育形成大而艳丽的乳黄色苞片层层重叠将整个头状花序包裹起来，高达1.5～2.0m，形似一座宝塔，极具观赏价值，是喜马拉雅-横断山高山冰缘带的“明星植物”；同时，该植物的根茎入药，具有泻热、导滞、散瘀和消肿之功效，是具有重要药用价值的藏药植物，因而，备受植物学家和植物化学家的关注。在全球变暖与人类活动加剧的背景下，该植物受到极大威胁，主要体现在以下几个方面：首先，塔黄依赖一种啃食种子的蕈蚊为其传粉，自然条件下高达30％左右的种子被啃食，导致种群更新受到种子数量不足的限制；第二，塔黄的种子较重(30mg)，且被苞片包裹，限制了种子的远距离扩散，大多数种子落在距母株50cm的范围内，密度效应导致大多数幼苗不能存活；第三，全球变暖正引起低海拔植被向高海拔迁移，占据最适宜塔黄生长的裸露生境，种群维持受到生境丧失的威胁；第四，高山冰缘带环境恶劣，强辐射、强降雨、大风和冰雹等对刚出土的幼苗具有致命的威胁；第五，塔黄生长周期长，需经过约15～45年的营养生长才能开花，之后便死去；最后，游客采集正在开花的个体与当地藏民采挖药材加剧了塔黄种群的减小。因此，采取科学合理的措施恢复该植物的野生种群迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种濒危的极具观赏价值和药用价值的大黄属植物——塔黄的野外种群恢复方法。提供一种操作简单、方便易行的塔黄野外种群恢复技术，管理方便，省工省力，为该种藏药植物资源的保护与可持续利用提供了技术支撑。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种大黄的野外种群恢复方法，该方法包括人工异花授粉增加种子产量，利用数字化x光样品成像系统对种子的发育情况进行科学检测，选择或创造适宜的播种地提高出苗率，苗期科学管理提高幼苗存活率步骤。

根据所述的一种大黄的野外种群恢复方法，

(1)所述的人工异花授粉步骤是在6月中旬，选择即将开花的塔黄植株，套袋去雄，用间隔50m以上的植株的花粉进行人工授粉，授粉后，再套袋，并挂牌标记，待开花结束后，去袋，保证果实在自然条件下发育，果实成熟时，采收种子；

(2)所述的利用数字化x光样品成像系统对种子的发育情况进行科学检测步骤是将采收的种子放置在x光机下进行检测，挑选发育正常的种子；对挑选好的种子进行灭菌，灭菌过程为：种子在流动的自来水中冲洗10min后，用滤纸吸干表面水分，然后用0.1％甲基托布津浸种30min，取出再用无菌水浸种2-3h，浸入0.1％升汞中消毒10min，取出，用无菌水冲洗3-5遍，充分晾干后供野外播种；

(3)所述的选择或创造适宜的播种地步骤是在10月中旬，在海拔4000～4800m之间的裸露流石滩生境中进行人工播种；或在塔黄现有居群附近的草甸上人为去除地被，创造适宜塔黄出苗与生长的裸地后再进行播种，播种株行距：100cm×100cm；

(4)所述的苗期科学管理步骤是在第二年6月初，架设简易荫棚罩在刚出土的幼苗上，每棵幼苗单独一个简易荫棚，荫棚高5～10cm，荫棚框架用铁丝，再覆盖遮阳网，并扎紧。

根据所述的一种大黄的野外种群恢复方法，其中所述的人工异花授粉步骤中的套袋是将整个植株进行套袋，袋口填充棉花，人工授粉时机为柱头分裂成三叉且出现粘液时。

根据所述的一种大黄的野外种群恢复方法，其中所述的利用数字化x光样品成像系统对种子的发育情况进行科学检测步骤中的检测方法为：种子通过数字化x光样品成像系统的x射线照射，然后照相，选择发育正常且饱满的种子用于后续繁育。

更具体地步骤可以概括如下：

1.在6月中旬，选择将要开花的塔黄植株，以植株为单位进行整体套袋(80目尼龙网袋，40cm×100cm(直径×高))，在收紧口的位置填充棉花；在花即将开放前，用镊子去雄；雌蕊成熟后(即柱头呈现三叉并具粘液时)，用间隔50m以上的其它塔黄植株上的花粉对其进行人工授粉。授粉后，再套袋，并挂牌标记。待花凋落时，去袋，保证果实在自然条件下发育。果实成熟时(9月初)，采收果实(种子)。

2.将人工授粉得到的果实通过数字化x光样品成像系统(mx-20-dc12,faxitron,usa)的x射线照射，然后照相，检测种子的发育情况，挑选发育正常的种子。

3.对发育正常的种子进行灭菌，灭菌过程为：种子在流动的自来水中冲洗10min后，用滤纸吸干表面水分，然后用0.1％甲基托布津浸种30min，取出再用无菌水浸种2～3h，浸入0.1％升汞中消毒10min，取出，用无菌水冲洗3～5遍，充分晾干后供野外播种。

4.10月中旬，在海拔4000～4800m之间的裸露的流石滩生境中进行人工播种；或在塔黄自然居群附近的草甸上人为去除地被(每个供播种的小生境为10cm×10cm)，创造适宜塔黄出苗与生长的裸地后再行播种。最优播种株行距：100cm×100cm。

5.第二年6月初，在刚出土的幼苗上架设简易荫棚，每棵幼苗单独一个简易荫棚。荫棚高：5～10cm，用铁丝作荫棚框架，再覆盖遮阳网，并扎紧。90天后成活率可达85％以上。

6.第二年的7月份以及第三年的7月份，去除塔黄幼苗附近的新长出的其它植物。

步骤1中在花开放前套袋和异花授粉后套袋均是为避免塔黄的传粉蕈蚊将卵产入小花的子房内，阻止幼虫取食种子。采用整个植株套袋，而不是通常用的单个花序或单朵小花套袋，主要是因为塔黄的小花生长密集，单个花序或单朵小花套袋会影响小花的发育；而采用棉花填充袋口位置，既可以阻止蕈蚊进入花序内，也可以避免系太紧妨碍植株的正常生长与发育。步骤2中的种子检测是每次处理30粒果实，种子的完好与败育的标准是：种子经过照射后，若黑暗说明种子空瘪，若中间部分发亮说明胚完好，且发亮部分越大，说明种子发育越好。最后，本发明所用的x射线成像系统为美国生产的mx-20-dc12,faxitron系列。步骤4中在裸露的流石滩上播种，是因为塔黄的种子在成熟时仍被苞片包裹，加上种子的重量较大，不利于种子的长距离扩散(大多数种子掉落在距母株0.5m范围内，导致大量幼苗聚集在一起，密度效应限制幼苗存活)。步骤4中在附近的草甸上人为去除地被后再进行播种，是因为地被能显著抑制塔黄种子的胚根到达土壤层影响出苗，并且通过遮光抑制幼苗的存活与生长；而每个小生境只去除10cm×10cm的面积，是因为该面积足够单粒种子的萌发与幼苗生长所需，又减少了对植被的破坏。步骤5中将简易荫棚罩在幼苗上，是因为塔黄在幼苗期不耐干旱和强降雨与冰雹的伤害。

本发明相对自然种群更新具有以下优点：

1.塔黄在自然条件下的传粉需要依赖双翅目迟眼蕈蚊属的一种蕈蚊(bradysiasp.)才能完成，但是该种蕈蚊在传粉的过程中会将卵产在一部分小花的子房内，孵化的幼虫以种子作为食物，导致30％左右的种子被啃食。因此，自然种群更新受到种子数量不足的限制。本申请采用套袋隔离并人工异花授粉，相对于自然授粉条件下大量种子被啃食，显著增加了可供种群更新的种子数量。

2.套袋时，采用棉花填充袋口位置，既可以阻止蕈蚊进入花序内，也可以避免袋口系太紧妨碍植株的正常生长与发育。

3.考虑到种子在授粉后，由于资源限制，大量种子败育(30％左右的种子空瘪)的问题，本申请在果实采收完成以后，首先对果实进行检测，选择有发育正常的种子进行下一步的繁育工作。本发明利用数字化x光样品成像系统，所述x射线成像系统为美国生产的mx-20-dc12,faxitron系列。对种子发育情况进行科学的检测，种子经过照射后，若中间部分发亮说明种子完好，若昏暗说明种子败育，利用该方法可以在短时间内挑选出发育正常的种子。

4.考虑到塔黄的种子易受到真菌的感染，出苗后存活率较低，本申请采用先对种子进行消毒。此外，按照常规的灭菌操作后种子易被杀伤，不容易萌发，经反复实验，多次结果的比较，发现本发明采用的灭菌方法，不仅取得了理想的灭菌效果，还保证了用于种群更新的种子数。

5.由于塔黄的种子较大，且在成熟时被苞片包裹，不利于风力的长距离传播，导致种子主要落在距母株0.5m的范围内，密度效应导致该母株产生的后代仅能存活1-5株个体。此外，由于塔黄的萌发特性与苗期对光照和营养等的需求，决定了最适合塔黄生长的生境为裸露的流石滩。而全球变暖的背景下，低海拔的植被向高海拔迁移，大量侵占塔黄的最适生境(祼地)。因此，本申请发明人经过大量比较研究，提出了在远离母株的祼地上进行人工播种或是在现有居群附近的草甸上进行人工去除地被创造祼地后再行播种的方法，克服了塔黄种子扩散距离不足与适宜生长与存活的裸露生境不足的双重限制。

6.由于塔黄在自然条件下的种群更新受到种子数量不足(被蕈蚊啃食与败育)、扩散限制(种子主要落在母株附近)以及生境限制(适宜的裸地遭到低海拔植被的侵占)等多方面因素的限制，本发明采用上述方法可以有效恢复塔黄的种群，既能快速扩大野生居群，保护遗传多样性，也能为药材生产提供大量的原材料，本发明的种群恢复方法易于实施，成本低廉，效果显著。

附图说明：

图1塔黄开花个体(a)、套袋(b)以及小花柱头可授状态(c)和塔黄果实经过x射线照射后种子的典型特征(d)，中间部分发亮表明种子发育完好，若黑暗表明种子发育不正常。

图2不同阶段不同处理的繁殖适合度比较。

具体实施方式：

以下结合附图，通过实施例形式对本发明的内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：

于2015年6月10日选择即将开花的塔黄10株，以整个植株为单位进行套袋，以开展人工异花授粉处理；

人工授粉：柱头可授前，用镊子去雄，防止自花授粉；雌蕊成熟后，用间隔50m以上的其它塔黄植株上的花粉对其进行人工授粉，由于塔黄居群开花比较集中，花粉可以即取即用，采集提供花粉的整朵小花，用正在散粉的花药擦拭柱头即可；判断柱头可授性的标准是柱头是否分成三叉且具有粘液；操作时动作要轻，避免柱头受到伤害。授粉后，再套袋，并挂牌标记。授粉5天以后(花调落)，去袋，保证果实在自然条件下发育。9月10日左右，采收果实。

种子检测：将人工授粉处理得到的种子进行通过数字化x光样品成像系统(mx-20-dc12,faxitron,usa)的x射线照射，然后照相，检测种子的败育情况。结果表明，由于资源限制，无论是人工异花授粉，还是自然授粉，均有高达30％以上的种子败育(空瘪)，因而有必要通过x光机进行挑选。

种子灭菌：通过x光机检测后，挑选发育正常的种子灭菌，灭菌过程为：种子在流动的自来水中冲洗10min后，用滤纸吸干表面水分，然后用0.1％甲基托布津浸种30min，取出再用无菌水浸种2～3h，浸入0.1％升汞中消毒10min，取出，用无菌水冲洗3～5遍，充分晾干后供野外播种。

野外播种：10月20日，在塔黄居群附近的裸露的流石滩上进行人工播种，并用木桩作好标记，便于在空旷的流石滩上找到出土的幼苗。最优播种株行距：100cm×100cm。

苗期管理：第二年6月初，待塔黄的种子出苗后，架设简易荫棚，罩在幼苗之上。荫棚高：8～15cm，用铁丝作荫棚框架，再覆盖遮阳网，并扎紧。第二年的6月中旬以及第三年的6月中旬，去除塔黄幼苗附近的新长出的其它植物。

实施例2：

于2015年6月中旬(盛花期)选择即将开花的塔黄10株，以整个植株为单位进行套袋，以开展人工异花授粉处理；

人工授粉：柱头可授前，用镊子去雄，防止自花授粉；雌蕊成熟后，用间隔50m以上的其它塔黄植株上的花粉对其进行人工授粉，采集提供花粉的整朵小花，用正在散粉的花药擦拭柱头即可；判断柱头可授性的标准是柱头是否分成三叉且具有粘液；操作时动作要轻，避免柱头受到伤害。授粉后，再套袋，并挂牌标记。授粉5天以后(花调落)，去袋，保证果实在自然条件下发育。9月15日左右，采收果实。

种子检测：将人工授粉处理得到的种子进行通过数字化x光样品成像系统(mx-20-dc12,faxitron,usa)的x射线照射，然后照相，检测种子的败育情况。

种子灭菌：通过x光机检测后，挑选发育正常的种子灭菌，灭菌过程为：种子在流动的自来水中冲洗10min后，用滤纸吸干表面水分，然后用0.1％甲基托布津浸种30min，取出再用无菌水浸种2～3h，浸入0.1％升汞中消毒10min，取出，用无菌水冲洗3～5遍，充分晾干后供野外播种。

野外播种：10月初，在塔黄居群附近的草甸上去除地被，之后在祼地上进行人工播种，用木桩作好标记。最优播种株行距：100cm×100cm。

苗期管理：第二年6月初，待塔黄的种子出苗后，架设简易荫棚，罩在幼苗之上。荫棚高：5～10cm，用铁丝作荫棚框架，再覆盖遮阳网，并扎紧。第二年的7月初以及第三年的7月初，去除塔黄幼苗附近的新长出的其它植物。

虽然，上面的实施例中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

为了表明本发明的效果，下面通过实验例加以验证。

试验设计、主要数据及结果：

为探索塔黄的野外种群恢复技术，本试验设置不同的处理方式，以期找出塔黄种苗繁育的最佳方式。具体试验设计如下：

试验地点：云南省香格里拉县翁水村葫芦海，该处为塔黄的自然居群，海拔4500m。

试验设计：本试验设计主要在不同实施阶段采用处理与对照同时进行，最后统计累计的幼苗建成率(繁殖适合度)。

图2给出了不同处理的繁殖适合度。可以看出与自然恢复相比，通过人工异花授粉、x光机检测、种子灭菌、人工野外播种(人工扩散或去除地被)和苗期管理等措施，获得的最终幼苗建成率提高了71-73％。