一种选育花瓣含有高含量绿原酸和木犀草苷的两色金鸡菊的方法与流程

本发明属于植物选育领域，具体涉及一种选育花瓣含有高含量绿原酸和木犀草苷的两色金鸡菊的方法。
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：两色金鸡菊(coreopsistinctorianutt.)又叫雪菊，为菊科(compositae)金鸡菊属(coreopsisl.)。据考证，两色金鸡菊包含的有效成分有20余类300多种天然成分；其中包括黄酮类物质、人体必需的矿物元素、氨基酸和芳香族化合物等分别有二三十种之多，这些有效成分包括有机酸、萜烯类、维生素、木脂体、酶类、多糖等具有生物活性和免疫调节功能天然物质(木合布力·阿布力孜,张燕,景兆均,等.新疆两色金鸡菊化学成分的初步定性研究.新疆医科大学学报,2010,33(6):628-630.)。两色金鸡菊包含的这些物质是研究降低血压、降低血脂、调节血糖、抗肿瘤与抗衰老等相关药物中重要的组成成分(王艳,张彦丽,阿依吐伦·斯马义.分光光度法测定新疆两色金鸡菊中总黄酮的含量.新疆医科大学学报,2011,34(8):817-819)。现代药理研究证实，两色金鸡菊中的总皂苷、氨基酸和黄酮类物质具有抵抗病原体，增强毛细血管抵抗力的作用。在两色金鸡菊中总黄酮含量超过10％，居于菊科植物的首位，远高于市面上销售的其他菊类茶品。黄酮类是一类具有很强的氧化性的物质，可以作为一种强氧化剂，有效地清除人体内的代谢产物氧自由基，这种阻止氧化的能力是维生素e的10倍以上，可以阻止细胞膜系统的损伤，阻止细胞的退化、衰老及癌变，防止人类疾病的病原体。两色金鸡菊中黄酮类物质的大量存在，有组成丰富的酚类化合物，是降血压、降血脂、调节血糖、抗肿瘤与抗衰老良药。因此，两色金鸡菊具有很高的药用价值，研究和开发的意义尤其深远(沈维治,邹宇晓,刘凡,等.雪菊与市售菊花活性成分的比较研究.热带作物学报,2012,33(12):2284-2287.)。根据长期实验研究说明：坚持饮用两色金鸡菊茶，有较好的降低血清中的甘油三脂和胆固醇的作用，能够明显降低患者的高血压使其恢复正常的作用(吴钉红,杨立伟,苏薇薇.野菊花化学成分及药理研究进展.中药材,2004,27(2):142-144)。两色金鸡菊还具有美容的功效；据《本草纲目》记载，野生雪菊具有天然美容作用，是淡斑祛痘佳品，甚至效果超越了其他天然美容的植物材料(李时珍著,吴兆基,武春华.本草纲目(上册)[m].时代文艺出版社,2005.)。氨基酸具有很强的抗氧化活性，可以有效地清除人体中的自由基。据相关研究证明氨基酸清除对人肌体有害的过量自由基的效能相当于超氧化物歧化酶作用的9倍，远远高于其它同类物质。两色金鸡菊因其氨基酸成分丰富，具有美白养颜、滋润肌肤的作用，能够清除肌肤毛孔中的毒素和垃圾；两色金鸡菊中的氨基酸成分还可以阻断脂质的过氧化反应，清除活性酶；有实验证实，氨基酸的润肤效果要比维生素e强18倍，因此两色金鸡菊的美容功效可见一斑。两色金鸡菊由于具有众多有效成分，因此具有广泛的药用功能，主要分四大类：(1)降低血清中的甘油三脂，胆固醇，雪菊可降低血压，治疗失眠头痛、缓解心绞痛；(2)抗衰老、提高机体免疫力，两色金鸡菊中的黄酮类物质具有抗衰老、延缓身体机能萎缩退化、促进代谢、提高免疫力的作用；(3)抗肿瘤作用，已从两色金鸡菊花中分离得到了能抑制肿瘤作用的物质(沙爱龙,吴瑛,盛海燕,等.昆仑雪菊黄酮对衰老模型小鼠脑及脏器指数的影响[j].动物医学进展,2013,34(7):66-68)；另外从雪菊花中分离得到的一些物质对由抗凝血药物诱发产生的早期抗原均具有明显的抑制作用。其中有6种化合物对常见的60种人类肿瘤细胞有抑制作用(kiyam,akihisat,tokudah,etal.constituentsofcompositaeplantsiii.anti-tumorpromotingeffectsandcytotoxicactivityagainsthumancancercelllinesoftriterpenediolsandtriolsfromediblechrysanthemumflowers[j].cancerletters,2002,177(1):7)。(4)抗糖尿病，张淑鹏等实验证实两色金鸡菊含有的多种提取物对α-葡萄糖苷酶的活性具有较高的抑制作用，表明两色金鸡菊中可以提取出抗糖尿病的药物。综上，两色金鸡菊在药用产品开发方面具有很好的应用前景(张燕,李琳琳,木合布力·阿布力孜,等.新疆昆仑雪菊5种提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响[j].中国实验方剂学杂志,2011,17(7):166-169.)。两色金鸡菊因其具有清热解毒、活血化瘀、胃健脾的功效和重要的药用价值(梁巧玲.昆仑雪菊的研究进展[j].安徽农业科学,2014,8(8):2305-2306)，被愈来愈多的人们当做治病、养生的花茶饮品饮用，越来越受到关注和欢迎。两色金鸡菊兼具观赏、药用、茶饮以及美容的功效，具有广阔的经济市场和药用研究的价值。目前，两色金鸡菊的活性成分的研究是热点，已经有了众多的研究成果。例如，cn201310555104.4公开了一种两色金鸡菊中花黄素的提取工艺及其提取物的应用；cn201710156606.8公开了两色金鸡菊提取物在制备治疗血栓形成性疾病药物中的应用；cn201711115582.8公开了含马里苷双色金鸡菊有效部位在制备治疗血管性痴呆药物中的用途等。绿原酸(chlorogenicacid，ca；casno.327-97-9，分子式c16h18o9，分子量为354.31)是金银花的主要抗菌、抗病毒有效药理成分之一，具有较广泛的抗菌作用，但在体内能被蛋白质灭活。绿原酸主要来源于杜仲科植物杜仲的叶，忍冬科植物忍冬、红腺忍冬、山银花或毛花柱忍冬的干燥花蕾或带初开的花，蔷薇科植物英国山楂的果实，千屈菜科植物千屈菜花，无患子科植物坡柳，水龙骨科植物欧亚水龙骨根茎，马鞭草科植物假败酱，十字花科植物卷心菜茎、叶，蓼科植物扁蓄全草，茜草科植物篷子菜全草，忍冬科植物蒴翟.全草。旋花科植物红薯的叶。茜草科植物小果咖啡、中果咖啡及大果咖啡的种子。菊科植物牛蒡的叶和根据说也含有绿原酸。目前关于两色金鸡菊的绿原酸的研究不多。例如，cn201410319567.5公开了雪菊片及其制备方法，其中提及到了绿原酸，其中提到采用该发明所述的雪菊片的制备方法得到的干燥雪菊中的绿原酸的含量为8.5毫克/克至8.8毫克/克，相对于目前干燥方法获得的雪菊中的绿原酸含量有所提高；cn201610681171.4公开了一种南京地区昆仑雪菊高产优质栽培方法，该方法仅涉及田间管理措施的改进，并没有采取任何育种手段，其中声称通过该发明方法栽培的昆仑雪菊，产量高且其活性物质总黄酮、绿原酸、茶多酚、总糖、总氨基酸都很高，但是并没有测量绿原酸的含量。cn201810947767.3公开了一种改善糖尿病肾病的雪菊提取物的制备方法，该方法仅仅涉及提取方法，并没有涉及到育种手段，其中提及该方法得到的提取物含有较高浓度的绿原酸。cn201810908915.0公开了一种雪菊总黄酮提取物及其制备方法和在化妆品中的应用，该发明仅提交所述方法制得的提取物中含有绿原酸，但是该方法仅仅涉及提取物的提取，并没有采取任何育种手段。木犀草苷(casno.：5373-11-5)具有较强的呼吸道杀菌作用，是新疆特有药材青兰中治疗气管炎的主要有效成分，能够降低胆固醇在动脉粥样硬化中的作用，增强毛细血管的舒张作用；实验发现，木犀草苷还可以缓解苯巴比妥的麻醉作用。我国传统中药材金银花的标志性成分是绿原酸和木犀草苷，是否含有木犀草苷是区别正品金银花和同科的山银花、忍冬藤的主要化学指标，也是正品金银花与山银花等同科植物在疗效上的差异的主要原因。但是，两色金鸡菊中的木犀草苷的研究还未见报道。技术实现要素：本发明人对采用等离子体辐照的诱变育种技术对两色金鸡菊的种子处理，意外发现这种诱变育种手段能够诱变产生一种花瓣管状化的株系，这种株系相对于未进行等离子体辐照的株系，其花瓣含有显著较高的绿原酸和木犀草苷，从而完成了本发明。于是，本发明提供了一种选育花瓣含有高含量绿原酸和木犀草苷的两色金鸡菊的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)获取两色金鸡菊的种子；(2)对所述种子进行等离子体辐照，得到辐照种子；(3)使辐照种子萌芽并让其生长至开花；(4)挑选花瓣管状化的株系。优选的是，步骤(2)中的种子为吸胀了水的吸胀种子。在该步骤中，本发明对吸胀用水没有特别的限制，优选采用干净的水例如蒸馏水等。吸胀时间可以为例如6小时，以胚根突破种皮为佳。在一些优选的实施方式中，所述等离子体辐照为常压室温等离子体(artp，atmosphericandroomtemperatureplasma)辐照。更优选的是，所述等离子体辐照采用artp-ⅱs型诱变育种仪(可以从天木生物科技有限公司商购获得)进行，因为这种artp-ⅱs型诱变育种仪构造精巧，操作简便，更适合于植物的辐照操作。常压室温等离子体(artp，atmosphericandroomtemperatureplasma)是在常压下产生的一种温度可以控制在25～40℃之间具有高活性粒子的等离子体射流，过去曾将其第一代产品用于辐射细菌、放线菌、藻类、酵母、霉菌和大型真菌等微生物领域。本发明人发现，适当的artp辐照可以使两色金鸡菊的花瓣管状化，从而诱变获得具有花瓣管状化性状的株系，这种性状的诱变率可以高达6.67％以上，更重要的是，这种株系的绿原酸和木犀草苷花瓣含量得到显著地提高。在一些优选的实施方式中，所述等离子体辐照的辐照条件如下：工作气体为99.99％的高纯氦气；工作气流量为12升/每分钟，额定功率为120w；等离子体距被辐照种子的距离为2至5mm，优选为3mm。在一些优选的实施方式中，所述等离子体辐照的辐照时间为15～37.5分钟，更优选为22.5分钟。在另外一些优选的实施方式中，所述花瓣管状化的株系的花瓣中的绿原酸增加30质量％以上；优选增加35质量％以上；更优选增加38.80质量％。在另外一些优选的实施方式中，所述花瓣管状化的株系的花瓣中的木犀草苷增加8质量％以上，优选增加10质量％以上，更优选增加10.68质量％。优选的是，步骤(3)中，在种子生长至幼苗之后，将幼苗移入装有体积比为1:1的由蛭石：营养土混合得到的混合基质的营养钵中。进一步优选的是，在将所述幼苗移入所述营养钵之后，让幼苗在温度为22℃，光照度为36.00μmol·m-2·s-1，照光时间14h的环境下生长约40天(8～12片叶)，然后移入大田(例如网室)，进行常规田间管理，直至开花。根据权利要求1至3所述的方法，其特征在于，步骤(4)得到的株系相对于未进行等离子体辐照的株系，发芽势和发芽率得到提高、叶片和/或植株的生长得到促进、花形和/或花色发生变化。本发明方法相比具有如下优势：(1)artp辐照可以具有花瓣管状化性状的株系，这种性状的诱变率可以高达6.67％以上。(2)本发明方法可以得到绿原酸和木犀草苷花瓣含量得到显著地提高。(3)本发明方法步骤简单，操作简便。(3)本发明方法对环境无污染，对人员无伤害。(4)本发明方法还可以提高种子发芽率和/或发芽势、促进叶片生长、提高植株冠幅，改变花形和/或花色等。附图说明图1显示了实施例3中得到的没有发生诱变的花瓣(t0)和花瓣发生管状化的诱变花瓣(tt)的比较图。具体实施方式以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。实施例如下所有实例中使用的供试材料均为取自昆仑山的‘两色金鸡菊’种子(购自洛阳耕源农业开发有限公司)，并且artp辐照都使用artp-ⅱs型诱变育种仪(购自天木生物科技有限公司)进行。预备例1首先，经过前期实验得知种子先在蒸馏水中吸胀处理后再用artp辐照，处理效果较好。于是，利用常压室温等离子体育种仪辐照前先将两色金鸡菊种子用蒸馏水进行0h、6h、12h、18h、24h、36h和48h的吸胀吸水处理，每个处理的种子数是20粒，然后拍照并统计吸胀处理后第4天的萌发率，以确定种子发芽效果最好的吸胀时间。结果发现，在吸胀处理6小时的处理组的萌发率最大(三次独立试验的萌发率分别为73％、65％、70％，平均为69.3％)。对种子进行吸胀吸水实验分析表明，随着吸胀时间的增加，6h的吸胀时间是两色金鸡菊种子的胚根处于将要冲破种皮和未冲破种皮的临界，在这个时间点对两色金鸡菊种子进行artp诱变能达到较好的诱变效果。实施例1在artp辐照诱变前，先将雪菊种子在蒸馏水中进行吸胀处理6小时。然后，使用artp-ⅱs型诱变育种仪，以工作气体为99.99％高纯氦气，工作气流量为12l·min-1，额定功率为120w，等离子体辐照距离3mm；辐照雪菊种子，辐照时间为7.50分钟。每个辐照三次重复，每个重复30粒种子。把经过辐照的两色金鸡菊种子放在铺有双层滤纸(保持滤纸湿润)的培养皿上萌发，统计第2天和第4天萌发种子数，按照如下公式计算发芽势和发芽率：发芽势＝(培养2天正常出芽的种子数/每组实验种子数)×100％；发芽率＝(培养4天正常出芽的种子数/每组实验种子数)×100％。将上述两色金鸡菊种子在湿润的滤纸上萌发7天后，将已发芽的苗移入蛭石：营养土＝1:1(v/v)的营养钵内，在温度为22℃，光照度为36.00μmol·m-2·s-1，照光时间14小时的环境下进行培养40天。随机选取15株植株，设置3个重复，用游标卡尺和直尺测量每株幼苗上最大叶片的叶片长度、叶片宽度，测量每株幼苗的冠辐，计算出平均值。叶面积按照如下公式计算：叶面积＝2/3×(叶宽×叶长)。选取15株进行花朵特征的分析，设置3个重复，以每个单株为样本，将花朵全部采收，进行生殖生长时期性状特征的分析。每个株系选10朵花用游标卡尺对花的直径大小、基部红褐色区域直径大小进行测量，分析其花形变化情况。数据分析使用excel和spss统计软件，采用lsd法进行检验，不同小写字母代表在p≤0.05上达到显著差异。实施例2采用与实施例1基本相同的方式进行，不同之处在于，辐照时间为15.00分钟。实施例3采用与实施例1基本相同的方式进行，不同之处在于，辐照时间为22.50分钟。实施例4采用与实施例1基本相同的方式进行，不同之处在于，辐照时间为30.00分钟。实施例5采用与实施例1基本相同的方式进行，不同之处在于，辐照时间为37.50分钟。对比例1采用与实施例1基本相同的方式进行，不同之处在于，不进行等离子辐照。结果参加下表和附图。表1.artp辐照对两色金鸡菊种子的发芽势和发芽率的影响发芽势/％发芽率/％实施例180.00±6.67a86.70±6.87a实施例273.30±8.92ab73.30±8.82c实施例380.00±5.77a86.70±3.43a实施例460.00±3.33b70.00±5.86c实施例570.00±6.78b83.30±8.60ab对比例160.00±8.82bc76.60±3.33bc注：每个实施例使用30粒种子，数据来自3次独立的实验。同一列数据后不同小写字母表示表示在p≤0.05水平上达到显著差异。表2.artp辐照对两色金鸡菊幼苗叶片长度、叶片宽度和叶面积等的影响(40天)注：同一列数据后不同小写字母表示表示在p≤0.05水平上达到显著差异。表3.artp辐照对两色金鸡菊花形的影响辐照时间/min总植株数/株tm/％ts/％tt/％实施例34513.336.676.67对比例1450.000.000.00注：tm：多瓣化的变异植株；ts：雄蕊瓣化的变异植株；tt：管状化的变异植株。表4.artp辐照对两色金鸡菊花中活性成分含量的影响注：dw表示干重(dryweight)。同一列数据后不同小写字母表示表示在p≤0.05水平上达到显著差异。由表1可知，不同时间的artp辐照对两色金鸡菊种子的萌发有不同的促进作用。其中实施例1和3的发芽势和发芽率较高。由表2可知，不同时间的artp辐照不同程度地增加了两色金鸡菊幼苗的冠幅、叶片数量和叶面积等，以实施例3的辐照效果最好。由表3和图1可以看出，实施例3在处理的植株中出现了花径变大、舌状花红褐色区域普遍增大(tr)的情况，并发现了3种花形变异，分别是多瓣化(tm)、雄蕊瓣化(ts)、管状化(tt)。其中tm出现比率占13.33％，ts出现比率为6.67％、tt出现比率6.67％(参见表3和图1)。由表4可以看出，在实施例3中，artp辐照后，两色金鸡菊花中活性成分均发生了变化。特别令人惊奇的是，tt变异株系的变化最为显著。tt变异株系的绿原酸和木犀草苷含量分别高于对照38.80％和10.68％，达到显著水平，总黄酮也比对比例1的高11.86质量％。检验例1采用与实施例3基本相同的方式进行，不同的是，每次使用50粒种子进行，独立地重复5次实验，以相同的方法测量tt诱变率、绿原酸和木犀草苷的含量，结果如下表5所示。由表5的结果可以看出，tt诱变率基本能够达到8％以上，绿原酸含量不低于2.80mg/g干重，，木犀草苷不低于170mg/g干重。表5.artp辐照22.50分钟后花瓣管状化诱变率以及诱变株系的绿原酸和木犀草苷含量次数tt诱变率/％绿原酸/(mg·g-1dw)木犀草苷/(mg·g-1dw)第一次143.12±0.22176.68±7.26第二次82.97±0.14179.77±5.31第三次122.87±0.19170.94±9.12第四次122.99±0.23183.42±6.03第五次103.02±0.26180.25±5.76最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12