本实用新型涉及植物育种技术领域，具体涉及一种用于EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的装置。
背景技术：
土壤盐渍化问题在世界范围内广泛存在，是农业生产面临的最严重的非生物逆境之一，严重影响作物生长发育；同时盐碱地具有光热资源充沛等自然禀赋，亟待开发和利用。
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为豆科多年生草本植物，具有适应性强、产草量高、适口性好等优点，是世界上栽培面积最大的牧草，被誉为“牧草之王”，具有一定的耐盐性；但盐害仍是限制和决定苜蓿广泛种植的重要因素之一，在盐碱地区进一步提高苜蓿耐盐性十分必要。培育耐盐性更强的苜蓿品种，是苜蓿在盐碱地利用的物质基础。
对于耐盐性强的紫花苜蓿新品种的选育，目前主要采用传统的杂交育种或基因工程育种。但传统的杂交育种选育周期性长、耗时费力。基因工程育种仍是基于人工模拟的环境，缺少相应的品种区域特性试验研究；另外，由于植物的耐盐性是一个受多基因控制的数量性状，而目前的研究报道大多只涉及单基因的转化，这可能是限制基因工程耐盐育种发展的原因之一；再者，目前的研究报道多是在转基因品系(种)的生长早期进行的耐盐性评析，而其耐盐性是否可以维持并稳定遗传尚有待证实，且某个发育阶段的耐盐性尚不能代表植物的耐盐性。
化学诱变育种具有使用方便、突变率高、后代较易稳定遗传等特点，是目前农作物育种较常用的有效手段之一。在众多化学诱变剂中，甲基磺酸乙酯(EMS)是常用的高效化学诱变剂，具有突变类型广、突变频率高、突变效率高等特点。但是EMS诱变具有多方向性，其诱变性状无法定向与预测。因此，目前尚未有关于EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的报道。
技术实现要素：
针对上述现有技术的不足，本实用新型的目的是提供一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法。
本实用新型的另一目的是提供用于EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的装置。
为实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：
本实用新型的第一方面，提供一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法，包括以下步骤：
(1)用含盐EMS-磷酸缓冲液处理紫花苜蓿种子；
(2)将步骤(1)处理后的紫花苜蓿种子置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发；
(3)将步骤(2)萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置中，并逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；
(4)将步骤(3)筛选的苗期耐盐单株移栽入大田，生长期间加强肥水管理，并进行性状观察；
(5)挑选出优良变异单株，收取紫花苜蓿种子；
(6)将步骤(5)的紫花苜蓿种子置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发；
(7)将步骤(6)萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置中，并逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；
(8)将步骤(7)筛选的苗期耐盐单株在大田间分单株进行播种，即获得紫花苜蓿EMS定向耐盐诱变种质。
优选的，步骤(1)中，所述含盐EMS-磷酸缓冲液中，EMS的质量百分含量为1.0％，NaCl浓度为50mmol/L。
优选的，步骤(1)中，紫花苜蓿种子的处理方法为：先将紫花苜蓿种子用10％的H2O2消毒处理，消毒处理后用蒸馏水冲洗，再在室温下浸种至吸胀状态，除去种子表层水分，然后用含盐EMS-磷酸缓冲液在4℃下处理3-5h，室温下处理3-5h；处理结束后，倒掉含盐EMS-磷酸缓冲液，将处理后的紫花苜蓿种子用流水冲洗1h以上。
优选的，步骤(2)和步骤(6)中，采用100mmol/L的NaCl溶液进行胁迫处理。
优选的，步骤(2)和步骤(6)中，在光照培养箱中保持白昼25℃，夜间20℃，进行变温培养至种子萌发。
优选的，步骤(3)和步骤(7)中，所述苗期筛选装置包括：培育装置和支撑装置；所述支撑装置包括水培盒和矩形塑料支架，所述矩形塑料支架通过铁钩和连接绳可拆卸的固定于所述水培盒上；所述培育装置为72孔穴盘，所述72孔穴盘通过矩形塑料支架固定于水培盒之上，穴盘底部与水培盒内所盛液体的液面距离可通过连接绳进行调节。
优选的，步骤(3)和步骤(7)中，筛选苗期耐盐单株采用的方法为：将萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置的穴盘中，每个穴移一株，播种深度为0.5-1厘米，逐株编号，育苗期间保证水分充足；通过控制苗期筛选装置的水培盒内NaCl的浓度和液面高度进行苗期耐盐筛选；先用清水培养7天，然后更换为营养液培养至30天，之后逐步在营养液中加入NaCl至50、100、150和200mmol/L，在盐溶液中共培养30天左右，至穴盘内苜蓿成活率在45-55％。
通过调节液面的高度来模拟田间水盐运动规律，其中，用液面淹没过基质1h，模拟浇灌过程；用液面淹没过反滤层，模拟刚浇灌后田间高水位环境，用穴盘离开液面模拟水分减少供应环境。
优选的，步骤(4)中，所述性状观察包括：白化、矮化、黄化、畸形苗、畸形叶、株高、分枝数、复叶数、叶片大小、生长势和生长速度。
优选的，步骤(5)中，优良变异单株标准：颜色浓绿，生长势强，叶片肥大，茎叶比小，分枝多，生长速度较快，没有白化、黄化、畸形苗、畸形叶等不良性状。
本实用新型的第二方面，提供一种用于EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的装置，所述装置包括：培育装置和支撑装置；所述支撑装置包括水培盒和矩形塑料支架，所述矩形塑料支架通过铁钩和连接绳可拆卸的固定于所述水培盒上；所述培育装置为72孔穴盘，所述72孔穴盘通过矩形塑料支架固定于水培盒之上，穴盘底部与水培盒内所盛液体的液面距离可通过连接绳进行调节。
优选的，所述72孔穴盘的每个穴盘底部放置海绵作为反滤层，反滤层上方为基质层。
本实用新型的有益效果：
(1)本实用新型的EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法操作简便、高效稳定、成本低廉。生产中可以利用该方法，结合简单农艺性状的鉴定，可以定向创制并筛选出耐盐紫花苜蓿变异个体和群体，为紫花苜蓿的遗传、育种提供丰富的种质材料。
(2)本实用新型所设计的用于EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的装置，可以模拟田间水盐运动规律，为耐盐紫花苜蓿的筛选提供仿真的田间水盐运动模拟环境，提高了耐盐紫花苜蓿定向诱变筛选的成功率。
附图说明
图1：本实用新型的苗期筛选装置结构示意图；其中，1-水培盒，2-铁钩，3-矩形塑料支架，4-72孔穴盘，5-连接绳。
图2：穴盘结构示意图；其中，6-基质层，7-反滤层。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术中所介绍的，由于EMS诱变具有多方向性，其诱变性状无法定向与预测。为了解决这一技术难题，本实用新型经创造性的劳动，首次提出了一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法。
在本实用新型的一种实施方案中，所给出的EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法包括以下步骤：
(1)种子准备与含盐EMS-磷酸缓冲液制备：选取籽粒饱满紫花苜蓿种子，并按设定量称取该种子，配制磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)，并将甲基磺酸乙酯(EMS)和NaCl溶于该磷酸缓冲液中，制得含盐EMS-磷酸缓冲液；所述含盐EMS-磷酸缓冲液中，EMS的质量百分含量为1.0％，NaCl浓度为50mmol/L；
(2)种子处理：用含盐的EMS-磷酸缓冲液处理定向诱变紫花苜蓿种子，获得M1代；
(3)萌发期一次耐盐筛选：将经EMS处理的获得的紫花苜蓿种子(M1)置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发(露白)；
(4)苗期一次耐盐筛选：对萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置的穴盘中，分别编号，在设计的苗期筛选装置中逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；
(5)大田种植与性状观察：将经穴盘筛选的紫花苜蓿移入大田，生长期间加强肥水管理；主要从以下方面进行性状观察：白化，矮化，黄化，畸形苗，畸形叶，株高，分枝数，复叶数，叶片大小，生长势，生长速度等。
(6)收种：挑选出优良变异单株，优良变异单株标准：颜色浓绿，生长势强，叶片肥大，茎叶比小，分枝多，生长速度较快，没有白化、黄化、畸形苗、畸形叶等不良性状，收取优良变异单株紫花苜蓿种子(M2)，并保留优良无性系备用；
(7)萌发期二次耐盐筛选：将紫花苜蓿种子(M2)置于发芽盒内，用NaCl溶液对种子进行处理，并在光照培养箱中培养至种子萌发(露白)。
(8)苗期二次耐盐筛选：对萌发的紫花苜蓿种子(M2)播种于苗期筛选装置的穴盘中，分别编号，在设计的苗期筛选装置中逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；
(9)将M2代经筛选的紫花苜蓿幼苗在大田间分单株进行播种。
为了进行苗期一次耐盐筛选和苗期二次耐盐筛选，本实用新型还专门设计了苗期筛选装置，如图1所示，包括培育装置和支撑装置；所述支撑装置包括水培盒1和矩形塑料支架3；所述水培盒1为长方体形，上方开口，水培盒1内放置有营养液或清水，营养液的盐浓度可以进行调节；所述矩形塑料支架3位于所述水培盒1内盛放的液体的液面之上，通过铁钩2和连接绳5可拆卸的固定于所述水培盒1上；其中，铁钩2设置在水培盒1相对应的两条长边框上，可根据需要设置合适数目的铁钩，例如4个或6个；铁钩2与矩形塑料支架3之间通过连接绳5连接，连接绳5的长度可以进行调节，另外，矩形塑料支架3的截面积小于水培盒1的截面积，从而使矩形塑料支架3可以深入至水培盒1内，并且与水培盒1内盛放液体的液面之间的距离可以进行调节。
所述培育装置优选为72孔穴盘4，所述72孔穴盘4通过矩形塑料支架3固定于水培盒1之上；72孔穴盘4的底部与水培盒1内营养液的液面距离可通过调节连接绳5的长度进行调节。
72孔穴盘的每个穴孔底部放置一圆形海绵作为反滤层7，反滤层上放置基质，作为基质层6(图2)。
其中，水培盒1内放置的营养液的成分组成优选为：
四水硝酸钙945mg/L，硝酸钾506mg/L，硝酸铵80mg/L，磷酸二氢钾136mg/L，硫酸镁493mg/L，铁盐溶液2.5ml/L，微量元素液5ml/L，pH＝6.0；
所述铁盐溶液的成分组成优选为：
七水硫酸亚铁2.78g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na)3.73g，蒸馏水500ml，pH＝5.5；
所述微量元素液的成分组成优选为：
碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L。
将上述溶液稀释10倍后使用。
穴盘4内放置的基质由草炭、蛭石和珍珠岩按质量比1:1:1组成。
上述EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法中，各步骤相辅相成，协同促进，是一个有机的整体。由于育种是一个长期的过程，通过加压选择能够更加快捷的选育到目标性状，本实用新型采用含盐EMS-磷酸缓冲液处理诱变紫花苜蓿种子，一方面种子在浸种12小时后萌发相关基因大量表达，此时用盐溶液处理可以刺激耐盐相关基因的表达，并与EMS诱变相耦合，获得较好的定向诱变结果；另一方面，低浓度(50mmol/L)的盐处理对苜蓿种子萌发有促进作用，可以部分抵消因EMS处理导致的发芽率快速下降，更容易获得诱变材料。在耐盐紫花苜蓿的定向诱变、筛选的过程中，萌发期和苗期是两个耐盐的关键选择时期，所以本实用新型采用这两个时期、不同世代的多次筛选方法，使诱变育种的后代性状稳定。在植物诱变育种中，半致死浓度是比较合适的处理浓度，高于此浓度时成活率较低，优良单株少，低于此浓度则诱变效果不佳；本实用新型将半致死浓度的理论拓展到耐盐紫花苜蓿的定向诱变中，因此将苜蓿的成活率定为45-55％。为满足紫花苜蓿生长所需的适宜温度，在冬季等低温季节实施本实用新型时，应采用温室等设施，以提供苜蓿生长所需的温度条件。
更为关键的是，为配合苗期一次耐盐筛选和苗期二次耐盐筛选的过程，本实用新型还特别设计了苗期筛选装置，通过控制苗期筛选装置的水培盒内NaCl的浓度和液面高度进行苗期耐盐筛选。其中，通过调节液面的高度来模拟田间水盐运动规律。其中，用液面淹没过基质1h，模拟浇灌过程；用液面淹没过反滤层，模拟刚浇灌后田间高水位环境；用穴盘离开液面模拟水分减少供应环境，液面高度可通过控制连接绳长短来调节。当在水中和无盐营养液中培育时，每7天一个周期，其中前4天液面高度应略高于反滤层或持平，后3天穴盘离开液面，共培育约1月。之后逐步在营养液中加入NaCl，浓度以50、100、150和200mmol/L浓度梯度递增。每当在营养液中加入不同浓度NaCl之后，须将液面上升至与基质持平的位置，时间为1h。1h后将液面重新恢复到与反滤层持平的位置，模拟田间盐水灌溉过程。每7天一个周期，其中4天液面高度应略高于反滤层或与反滤层持平，3天穴盘离开液面，共大约培育30天左右，直至穴盘内苜蓿成活率在45-55％时停止培育。因此，本实用新型的苗期筛选装置可以为耐盐紫花苜蓿的筛选提供仿真的田间水盐运动模拟环境，提高了耐盐紫花苜蓿定向诱变筛选的成功率。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本实用新型实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：
(1)种子准备与含盐EMS-磷酸缓冲液制备：选取籽粒饱满紫花苜蓿种子，并按设定量称取该种子，配制0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)，并将NaCl和甲基磺酸乙酯(EMS)溶于该磷酸缓冲液中，制得含盐EMS-磷酸缓冲液，其中EMS质量百分比计为1.0％，NaCl浓度为50mmol/L。pH＝7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液的配制方法是：母液A为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液；母液B为0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液。取61ml母液A和39ml母液B混合并定容至200ml。
(2)种子处理：用含盐EMS-磷酸缓冲液处理诱变紫花苜蓿种子，获得M1代。处理种子的方法是：先将紫花苜蓿种子用10％的H2O2溶液消毒处理10min，蒸馏水冲洗2次，室温下浸种12小时达吸胀状态。用滤纸除去表层水分，然后用含盐EMS溶液在4℃下处理4小时，室温下处理4小时，处理期间期间轻摇震荡；EMS溶液处理结束后，倒掉EMS溶液，将处理后的种子用流水冲洗1h以上。用含盐EMS-磷酸缓冲液处理诱变紫花苜蓿种子的原因，一是种子在浸种12小时后萌发相关基因大量表达，此时用盐溶液处理可以刺激耐盐相关基因的表达，并与EMS诱变相耦合，获得较好的定向诱变结果；二是低浓度(50mmol/L)的盐处理对苜蓿种子萌发有促进作用，可以部分抵消因EMS处理导致的发芽率快速下降，更容易获得诱变材料。
(3)萌发期一次耐盐筛选：将经EMS处理的获得的紫花苜蓿种子(M1)置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发(露白)。具体方法是：将处理好的种子用100mmol/L NaCl溶液进行胁迫处理，进行定向选择；将处理后的种子置于发芽盒内并在培养箱中进行变温(昼25℃/夜20℃)培养至种子萌动，期间每天保证滤纸湿润。
(4)苗期一次耐盐筛选：设计苗期筛选装置，用于苗期的耐盐筛选，苗期筛选装置包括培育装置和支撑装置，所述支撑装置包括水培盒1和矩形塑料支架3，所述矩形塑料支架3位于所述水培盒内的营养液的液面之上，通过铁钩2和连接绳5可拆卸的固定于所述水培盒1上，水培盒1内放置营养液或清水，营养液盐浓度可调；所述培育装置为72孔的穴盘4，所述穴盘4通过矩形塑料支架3固定于水培盒1之上。穴盘4底部与水培盒1内营养液的液面距离可通过连接绳5进行调节。每个穴孔底部放置一圆形海绵作为反滤层7，反滤层上放置基质，作为基质层6。
苗期筛选方法是：将萌动的幼苗移植到苗期筛选装置的穴盘中，每个穴移一株，播种深度为0.5-1厘米，逐株编号，育苗期间保证水分充足。通过控制苗期筛选装置的水培盒内NaCl的浓度和液面高度进行苗期耐盐筛选，先用清水培养7天，然后更换为全营养液培养至30天，之后逐步在营养液中加入NaCl至50、100、150和200mmol/L，在盐溶液中共培养30天左右，至穴盘内苜蓿成活率在45-55％。具体为：通过调节液面的高度来模拟田间水盐运动规律。其中，用液面淹没过基质1h，模拟浇灌过程；用液面淹没过反滤层，模拟刚浇灌后田间高水位环境；用穴盘离开液面模拟水分减少供应环境。液面高度可通过控制连接绳长短来调节。当在水中和营养液中培育时，每7天一个周期，其中前4天液面高度应略高于反滤层或持平，后3天穴盘离开液面，共培育约1月。之后逐步在营养液中加入NaCl，浓度以50、100、150和200mmol/L浓度梯度递增。每当在营养液中加入不同浓度NaCl之后，须将液面上升至与基质持平的位置，时间为1h。1h后将液面重新恢复到与反滤层持平的位置，模拟田间盐水灌溉过程。每7天一个周期，其中4天液面高度应略高于反滤层或持平，3天穴盘离开液面，共大约培育30天左右，直至穴盘内苜蓿成活率在45-55％时停止培育。
(5)大田种植与性状观察：将经穴盘筛选的紫花苜蓿移入大田，生长期间加强肥水管理；性状观察，主要从以下方面进行：白化，矮化，黄化，畸形苗，畸形叶，株高，分枝数，复叶数，叶片大小，生长势，生长速度等。
(6)收种：挑选出优良变异单株，优良变异单株标准：颜色浓绿，生长势强，叶片肥大，茎叶比小，分枝多，生长速度较快，没有白化、黄化、畸形苗、畸形叶等不良性状，收取紫花苜蓿种子(M2)，并保留优良无性系备用；
(7)萌发期二次耐盐筛选：将紫花苜蓿种子(M2)置于发芽盒内，用NaCl溶液对种子进行处理，并在光照培养箱中培养至种子萌发(露白)。具体方法同(3)。
(8)苗期二次耐盐筛选：对萌发的紫花苜蓿种子(M2)播种于含基质的穴盘中，分别编号，在设计的专用装置中逐步提高盐胁迫浓度，筛选紫花苜蓿EMS定向耐盐诱变种质。具体方法同(4)。
(9)将M2代经筛选的紫花苜蓿幼苗在大田间分单株进行播种。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。