以幼孢子囊群诱导的GGB途径的华南紫萁组培繁殖方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种以幼孢子囊群诱导的ggb途径的华南紫萁组培繁殖方法。

背景技术：

华南紫萁（osmundavachelliihook.），真蕨目紫萁科紫萁属蕨类植物，产于亚洲亚热带湿润地区,常野生于山地、草丛或溪边。该种兼具厚囊蕨纲和薄囊蕨纲的特点，是薄囊蕨类中最原始的类群，也是现存的厚囊蕨纲和薄囊蕨纲之间过度类型的少数种类之一。

华南紫萁为陆生蕨类，植株高1-2m，根状茎粗壮，形成圆柱形主轴。叶簇生顶部，厚纸质，两面无毛，呈黄绿色，略有光泽；叶柄长15-35厘米，坚硬；叶片长圆形，长30-80cm，宽15-30cm；羽片具短柄，着生于叶轴上，披针形或线状披针形，长15-20cm，宽1.5cm，顶端长渐尖，基部狭楔形，近全缘。株型美观，形似苏铁，叶姿态优雅，颇具观赏价值。其嫩苗、根茎、叶柄残基等可入药，具有清热解毒、止血生肌，健脾利湿，舒筋活络等功效。

随着生态文明建设的不断深入，观赏蕨类植物作为一种优新园林植物资源，已逐渐成为当今风景园林建设中的新宠儿。华南紫萁树形美观，作为现存少有的木本蕨类之一，在蕨类植物造景和生态绿化中的作用举足轻重，可供庭园、绿化带栽植或室内盆栽观赏，终冬不凋。但是，它们的自然繁殖能力差，且伴随着生态环境的恶化和采挖现象时有发生，野生种群面临大威胁。该物种的濒危性及其野生繁育的局限性是制约其深入开发和利用的重要因素。积极开展华南紫萁的人工快速繁殖研究，不但可以减少野外乱采滥挖现象，保护野生种质资源，而且可以扩大其园林绿化应用范围，提高观赏蕨类植物在园林中的比重，丰富园林绿地的生态内涵。

华南紫萁的人工繁育主要以孢子繁殖为主。该方法对繁殖环境条件要求高，周期长，且孢子获得受季节限制，成苗率有限。利用组织培养技术可以有效地解决上述问题。但目前，蕨类植物组培研究的瓶颈主要集中在以下两个方面：一是多数蕨类植物直接从地栽的活体植株上很难获得合适的外植体，诱导难度极大；二是以绿色球状体（简称绿球体，greenglobularbody，ggb）途径进行组培繁殖（外植体一绿色球状体一植株）时，绿球体的诱导是关键技术。蕨类植物绿色球状体是指由蕨类植物外植体诱导得到的由众多绿色颗粒组成的球状体，其本质是分生组织集合体，接种于分化培养基上可以获得大量蕨类植物幼苗。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术之不足，提供一种以幼孢子囊群成功诱导绿色球状体，获得大量华南紫萁种苗的方法，为其快速繁殖和规模化生产奠定基础，以满足生态及市场需求。

本发明是以如下技术方案实现的：以幼孢子囊群诱导的ggb途径的华南紫萁组培繁殖方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择及表面消毒：选取带有幼孢子囊群的华南紫萁未完全展开叶片，轻轻去除表面污垢，经流水冲洗干净后转入75％乙醇浸泡20s，再用0.1％氯化汞振荡清洗2-4min，无菌水冲洗5-7次，得华南紫萁无菌幼叶孢子囊外植体；

（2）绿色球状体的诱导：将步骤（1）获得的华南紫萁无菌幼叶孢子囊外植体首尾切除，剪成2cm小段，按照极性方向小心接种到ggb诱导培养基中；将接种好的材料置于光照培养架上进行培养；培养7-10天，在培养基表面可以观察到很多从孢子囊群中散落下来的绿色孢子，继续培养2周，孢子逐渐膨大形成华南紫萁绿色球状体；

（3）绿色球状体的增殖：步骤（2）中获得的绿色球状体分割成直径为3-5mm大小的绿球体小块，接种于绿色球状体增殖培养基上，培养时间为30天，得到增殖的华南紫萁绿色球状体；培养条件同步骤（2）；

（4）绿色球状体的分化：将步骤（3）增殖得到的华南紫萁绿色球状体切割成5mm大小的绿球体小块，接种于绿色球状体分化培养基上，培养时间为30天，得到分化幼苗；培养条件同步骤（2）；

（5）分化幼苗的壮苗及生根培养：将步骤（4）获得的华南紫萁分化幼苗接种于壮苗及生根培养基上培养60天，每30天更换一次新的壮苗生根培养基，得到植株高度为2-3cm的生根组培苗；培养条件同步骤（2）；

（6）华南紫萁组培苗的炼苗移栽：待步骤（5）所述组培苗高度达到3-4cm时，将其放在温度为20-25°c、光照强度2000lx，每日光照12h的条件下进行炼苗；之后将组培苗小心取出，去除根部培养基，并用质量分数为0.125%多菌灵溶液清洗根部，种植于育苗钵内，放置于温室大棚内，控制温度为20-25°c，在自然光照下生长20天左右，即得到华南紫萁商品种苗。

其进一步是：步骤（1）中用软毛刷蘸1%体积分数的洗洁精水轻轻去除表面污垢。

步骤（2）中培养基配方为b5+0-1.0mg/l6-ba+0-0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph为5.8。

步骤（2）中光照培养控制温度为23-27℃，湿度为75％-85％，光照强度为2000-3000lx，每日光照14h。

步骤（3）中增殖培养基配方为b5+0.2-1.0mg/l6-ba+0.1-0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph为5.8。

步骤（4）中绿色球状体分化培养基为1/2ms+0.2-1.0mg/l6-ba+0.1-0.5mg/lnaa+0-1.5g/l活性炭+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph为5.8。

步骤（5）中壮苗及生根培养基为：1/2ms+0.1-0.5mg/lnaa+0-1.5g/l活性炭+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph为5.8。

步骤（6）中育苗钵内的基质为消过毒的泥炭和火山岩的混合基质，泥炭和火山岩的体积比为3:1。

本发明具有以下优点：本发明的以幼孢子囊群诱导的ggb途径的华南紫萁组培繁殖方法，为通过组培途径繁育优质华南紫萁商品种苗提供了方法和途径，成功建立了以华南紫萁未完全展开叶上的幼孢子囊为外植体的组培繁殖方法，通过诱导绿色球状体进而分化出试管苗，解决了外植体诱导难、幼苗分化难等问题，通过ggb途径诱导获得华南紫萁种苗，诱导时间短，诱导率高，且可周年生产，不受季节限制，解决了常规的孢子繁殖对环境要求高，且收集孢子受限等的问题。

附图说明

图1是本发明的带有幼孢子囊群的华南紫萁未完全展开叶片（呈黄褐色）的图片；

图2是本发明外植体培养7-10天散落在培养基表面的绿色孢子的图片；

图3是本发明孢子逐渐膨大形成原始绿色球状体的图片；

图4是本发明绿球体进一步膨大的图片；

图5是本发明绿球体增殖的图片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的试验材料均为市售；各培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含量混合后，调节ph制成。

实施例1：

（1）外植体的选择及表面消毒：以在学校基地引种栽培成功的优质华南紫萁种苗为材料，于2018年4月20日，剪取健康的带有幼孢子囊群的未完全展开叶片，用软毛刷轻轻去除表面污垢，经流水冲洗干净后转入75％乙醇浸泡20s，再用0.1％氯化汞振荡清洗4min，无菌水冲洗7次，得华南紫萁无菌幼叶孢子囊外植体；

（2）绿色球状体的诱导：将步骤（1）获得的华南紫萁无菌幼叶孢子囊外植体首尾切除，剪成2cm小段，按照极性方向小心接种到ggb诱导培养基中。培养基为b5基本培养基，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，ph为5.8。接种数量为30瓶，每瓶1个外植体。将接种好的材料置于光照培养架上进行培养；温度为23-27℃，湿度为75％-85％，光照强度为2000-3000lx，每日光照14h。

（3）绿色球状体的增殖：于2018年4月29日观察到培养基表面有很多从孢子囊群中散落下来的绿色孢子，5月12日观察发现孢子逐渐膨大形成华南紫萁绿色球状体，平均诱导率为48.75%。将这些绿色球状体切割成直径为3-5mm大小的绿球体小块，接种于增殖培养基上。培养基成分为b5+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，ph为5.8。接种数量为30瓶，每瓶5个绿球体。于接种后30天即6月12日统计增殖率为54.8%。

（4）绿色球状体的分化：将步骤（3）增殖得到的华南紫萁绿色球状体切割成5mm大小的绿球体小块，接种于绿色球状体分化培养基上，

培养基成分为1/2ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，ph为5.8。培养30天得到2-3cm高分化幼苗，分化率为38.8%。

（5）分化幼苗的壮苗及生根培养：增殖培养阶段，大量激素被用于促进不定芽的萌发。但同时植株的生长发育和顶端优势也受到了一定影响。因此，壮苗培养十分必要。将步骤（4）获得的华南紫萁分化幼苗接种于壮苗及生根培养基上培养。培养基成分为1/2ms+0.1mg/lnaa，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，ph为5.8。每30天更换一次新的培养基，9月10日观察得到高2-3cm，带4-5条根的组培试管苗，生根率为74.7%。

（6）炼苗移栽：待步骤（5）所述组培苗高度达到3-4cm时，将其放在温度为20-25℃、光照强度2000lx，每日光照12h的条件下进行炼苗；之后将组培苗小心取出，去除根部培养基，并用质量分数为0.125%多菌灵溶液清洗根部，种植于育苗钵内，所用基质为消过毒的泥炭：火山岩体积比为3:1的混合基质，放置于温室大棚内，控制温度为20-25℃，在自然光照下生长20天，即得到华南紫萁商品种苗，成活率为91.8%

实施例2：

（1）外植体的选择及表面消毒：于2018年6月7日，以在学校基地引种栽培成功的优质华南紫萁种苗为材料，剪取健康的带有幼孢子囊群的未完全展开叶片，用软毛刷轻轻去除表面污垢，经流水冲洗干净后转入75％乙醇浸泡20s，再用0.1％氯化汞振荡清洗3min，无菌水冲洗5-7次，得华南紫萁无菌幼叶孢子囊外植体；

（2）绿色球状体的诱导：将步骤（1）获得的华南紫萁无菌幼叶孢子囊外植体首尾切除，剪成2cm小段，按照极性方向小心接种到ggb诱导培养基中。培养基为成分为b5+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，ph为5.8。接种数量及培养条件同实施例1，不再赘述。

（3）绿色球状体的增殖：于2018年6月13日观察到培养基表面有很多从孢子囊群中散落下来的绿色孢子，6月25日观察发现孢子逐渐膨大形成华南紫萁绿色球状体，平均诱导率为63.2%。将这些绿色球状体切割成直径为3-5mm大小的绿球体小块，接种于增殖培养基上。培养基成分为b5+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，ph为5.8。接种数量为30瓶，每瓶5个绿球体。于接种后30天即7月25日统计增殖率为71.2%。

（4）绿色球状体的分化：将步骤（3）增殖得到的华南紫萁绿色球状体切割成5mm大小的绿球体小块，接种于绿色球状体分化培养基上，

培养基成分为1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，活性炭1.5g/l，ph为5.8。培养30天得到2-3cm高分化幼苗，分化率为54.9%。

（5）分化幼苗的壮苗及生根培养：将步骤（4）获得的华南紫萁分化幼苗接种于壮苗及生根培养基上培养。培养基成分为1/2ms+0.5mg/lnaa，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，活性炭1.5g/l，ph为5.8。每30天更换一次新的培养基，10月25日观察得到生根试管苗试管苗，生根率为80.3%。观察发现1.5g/l活性炭的添加对试管苗的分化与生根都有明显的促进作用。

（6）炼苗移栽：炼苗及移栽方法同实施例1。移栽后20天统计成活率为75.4%。

实施例3：

（1）外植体的选择及表面消毒：于2018年7月4日，以在学校基地引种栽培成功的优质华南紫萁种苗为材料，剪取健康的带有幼孢子囊群的未完全展开叶片，用软毛刷轻轻去除表面污垢，经流水冲洗干净后转入75％乙醇浸泡20s，再用0.1％氯化汞振荡清洗2min，无菌水冲洗5-7次，得华南紫萁无菌幼叶孢子囊外植体；

（2）绿色球状体的诱导：接种方法、培养基、接种数量及培养条件同实施例2，不再赘述。

（3）绿色球状体的增殖：于2018年7月10日观察到培养基表面有很多从孢子囊群中散落下来的绿色孢子，7月22日观察发现孢子逐渐膨大形成华南紫萁绿色球状体，统计平均诱导率为66.5%。将这些绿色球状体切割成直径为3-5mm大小的绿球体小块，接种于增殖培养基上。培养基成分为b5+1.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，ph为5.8。接种数量为30瓶，每瓶5个绿球体。于接种后30d即8月22日统计增殖率为79.8%。

（4）绿色球状体的分化：将步骤（3）增殖得到的华南紫萁绿色球状体切割成5mm大小的绿球体小块，接种于绿色球状体分化培养基上，

培养基成分为1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，活性炭1.5g/l，ph为5.8。培养30d得到2-3cm高分化幼苗，分化率为58.2%。

（5）分化幼苗的壮苗及生根培养：将步骤（4）获得的华南紫萁分化幼苗接种于壮苗及生根培养基上培养。培养基成分为1/2ms+0.1mg/lnaa，添加蔗糖30g/l、琼脂7g/l，活性炭1.5g/l，ph为5.8。每30d更换一次新的培养基，11月22日观察得到生根试管苗试管苗，生根率为87.4%。

（6）炼苗移栽：炼苗及移栽方法同实施例1。移栽后20d统计成活率为56.3%。综合瓶苗诱导和移栽情况，气温的下降可能是导致实施例2和实施例3中移栽成活率下降的主要原因。