一种辣椒离体再生方法及所用的培养基与流程

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及辣椒的离体再生体系及其所用的培养基。

背景技术：

辣椒(capsicumannuuml.)属茄科，是一种深受人们喜爱的重要的蔬菜作物和调味品，在世界范围内广泛栽培。由于生物和非生物胁迫，以及辣椒自身基因的易损性大大限制了辣椒的发展。以离体再生和遗传转化技术作为关键的植物生物技术，是当前弥补作物常规育种不足和促进作物育种进程的有效手段。

自gunay于1978年首次开展辣椒组培工作至今四十余年，相继有关于探索辣椒离体再生体系建立的文献报道。据统计，以幼苗子叶、茎尖和胚轴为外植体的离体再生，是辣椒离体再生系统研究最多的一个领域，然而这些辣椒离体再生技术主要停留在芽诱导阶段，仍然存在芽难以伸长、生根困难等问题。在辣椒离体再生芽的诱导过程中，通常采用的培养基的激素配方为6-ba与iaa的配比，其诱导再生效率为90％以上。为了探索辣椒离体再生过程中不定芽的伸长，研究者们侧重于激素配比优化，认为ga是诱导不定芽伸长的一个重要因素。例如中国专利文献cn109258469a，所用的不定芽诱导培养基为ms+3.0mg/l6-ba+0.1mg/liaa，芽伸长培养基在不定芽诱导培养基的基础上添加ga3这一激素；在中国专利文献cn108338073a中的芽伸长诱导培养也同样采用了添加ga3。然而，ga诱导辣椒离体再生不定芽伸长的效果并不如意，芽的伸长效率低，且存在基因型依赖等问题。另外，杨博智等(分子植物育种，2018年，第16卷，第4期，第1244-1249页)报道用6-ba浸泡预处理辣椒子叶外植体，获得最佳不定芽诱导培养基为ms+4.0mg/l6-ba和最佳不定芽伸长培养基为ms+6.0mg/l6-ba+0.1mg/liaa，其重点似乎是在浸泡预处理，激素配方并不理想，芽伸长效率仅为23.21％。

到目前为止，辣椒通过组织培养获得再生体系的技术一直未得到突破，利用dna重组技术进行辣椒遗传转化的进展也非常缓慢。有研究者在辣椒中尝试了一些遗传转化方法，如以胚性愈伤、原胚和成熟体细胞胚等为受体进行遗传转化、或者利用原生质体融合、花粉管及基因枪转化法等方法，或者直接进行改良的水培育苗+外界环境下农杆菌介导获取辣椒转化苗，但这些方法存在转化效率低、再生频率低、周期长、不定芽伸长困难、或者实验成本高、操作相对复杂等问题。

建立高效的离体再生和遗传转化体系，是作物利用基因工程技术进行有效的遗传改良基础。然而，辣椒的离体再生体系建立一直未获得重大突破，从而限制了辣椒遗传转化体系的建立和基因工程在辣椒遗传改良上的应用，亟待建立高效、稳定的辣椒离体再生体系。

技术实现要素：

本发明首先提供一种辣椒外植体诱导分化不定芽的方法，以辣椒无菌苗带柄子叶为外植体，再生芽诱导分化培养基激素配方为3.0-9.0mg/lzt+5.0-9.0mg/l6-ba+0.04-0.06mg/liaa。

已处于分化状态的辣椒子叶回复到分裂状态并开始快速的分裂分化需要适宜的外源激素，细胞分裂素和生长素搭配对芽的分化具有促进作用。本发明人在研发时无意中发现zt和6-ba的浓度在相对较高的情况下，效果更佳，生长素iaa与细胞分裂素6-ba和/或zt搭配可100％诱导子叶再生形成叶状体。但叶状体的状态与细胞分裂素的类型及其浓度密切相关：6-ba主要诱导离体子叶叶柄端切口玫瑰花瓣状叶状体形成，zt诱导再生的叶状体包括玫瑰花瓣状和长条形，而切口端愈伤组织的形成与6-ba密切相关。愈伤组织的快速生长有利于从培养基中获得包括植物激素在内的营养物质供给叶状体的生长。因此在深入研究和大量实验的基础上，在iaa浓度合适的情况下，3.0-9.0mg/lzt和5.0-9.0mg/l6-ba组合均能使子叶离体再生许多的叶状体，大部分叶状体呈玫瑰花瓣状，少部分呈长条形，且叶状体生长快，因此该浓度组合适宜于子叶离体再生的诱导。

在一个实施方式中，再生芽诱导分化培养基以mb为基本培养基，优选地zt的浓度为5.0-7.0mg/lzt，6-ba浓度为6.0-8.0mg/l，iaa浓度为0.05mg/l.因而，本发明也提供用于上述诱导分化的再生诱导分化培养基。

进一步，再生芽诱导分化过程无菌苗的获得是常规的方法，例如挑选健康无病菌的辣椒新鲜种子(当年收获)，用纯净水浸种48h后进行消毒，如先用75％酒精消毒60s，然后用0.1％hgcl2消毒10min，接着用无菌水冲洗4次，2min/次，最后将种子接种于添加3％蔗糖和0.5％琼脂粉的mb培养基(ms大量元素+ms微量元素+ms铁盐+b5有机成分，ph＝5.8)，光照培养(温度：25±2℃，光强：2500lx，光周期：14h光照/10h黑暗)，约7d后种子开始萌发形成无菌苗。

其中外植体为带柄子叶，更具体是将辣椒无菌苗的子叶从叶柄端切下获得，优选地带有0.1-0.2cm长的叶柄，在近叶尖1-2cm处切除叶尖。

再生芽诱导分化培养的具体步骤是先经过暗培养，再进行光培养，优选地是暗培养5d至30d，更优选地暗培养10d至25d，最优选暗培养21d；光培养条件为温度：25±2℃，光强：2500lx，光周期：14h光照/10h黑暗。培养时最好将子叶外植体腹面朝上和背面朝下接种于再生芽诱导分化培养基上。

不定芽的伸长也是辣椒离体再生成苗的关键环节之一。虽然可以采用常规的方法进行，但为了达到更好的效果，本发明人研发了一种删减再生芽数量并配合激素方案获得很好的再生芽伸长的效果，构成本发明的另外一个方面。将畸形的玫瑰花瓣状叶状体切除，留1-2个叶片呈对生的长条形的正常不定芽，进行继代培养，继代培养激素配方为0.04-0.06mg/liaa，3.0-7.0mg/lzt与5.0-9.0mg/l6-ba组合，其中iaa优选浓度为0.05mg/l，zt优选浓度为5.0-7.0mg/l，更优选为6.0mg/l，6-ba优选浓度为6.0-8.0mg/l，更优选为7.0mg/l。进一步地，继代培养基以mb为基本培养基，ph5.8。

因此，本发明还提供一种外植体上不定芽伸长的继代培养方法。所述方法是基于本发明人发现辣椒离体子叶在再生分化培养基上诱导再生形成的叶状体数量多且大部分为畸形的玫瑰花瓣状，少数为长条形，它们在分化培养基上继续生长未见茎的伸长。而现有研究认为在不定芽伸长阶段添加ga3是必需的。本发明经试验结果显示，ga3对不同状态叶状体的茎伸长的影响存在差异：ga3对离体子叶再生形成的数量少呈长条形对生的叶状体的茎伸长具有明显的促进作用，对玫瑰花瓣状叶状体及非对生状叶状体的茎伸长的作用不明显。适宜的ga3浓度为1.0-2.0mg/l，ga3浓度为3.0mg/l时易使叶状体呈水渍状。此外，ga3使叶状体黄化变薄，即使诱导再生芽的茎伸长了，也难以生根。因为，辣椒离体子叶再生不定芽的生根与不定芽的状态密切相关。经ga3诱导伸长的不定芽纤瘦、叶黄化变薄，生根困难，而通过删减叶状体的方法诱导茎伸长的不定芽健壮、叶碧绿，极易生根。

而采用本发明中的继代培养方法，发现进行继代培养，2周后再生芽明显伸长，叶片碧绿呈长椭圆形，茎粗壮。继代培养基中不同浓度配比的zt和6-ba对不定芽伸长的影响方面可以看出：1.0mg/lzt与1.0-9.0mg/l6-ba组合能使再生芽的茎伸长率≤40％；随着zt浓度的增加，叶状体茎的伸长率明显升高，3.0-7.0mg/lzt与5.0-9.0mg/l6-ba组合能使再生芽伸长率高于67％。5.0-7.0mg/lzt与7.0mg/l6-ba组合的再生芽伸长率最高，为88％-90％，显著高于其它组合，即为适宜于再生芽伸长的继代培养基中的激素组合。经删减仅剩1-2个正常的不定芽(叶片呈对生的长条形)在适宜的继代培养基上生长约15d后，芽伸长4-5cm左右，为3-4叶1心的生长阶段，其效果是非常明显的。

进而，本发明还提供上述不定芽伸长的继代培养基。

对于生根步骤可以采取常规步聚，但优选采取下述步骤:将经删减叶状体使茎伸长的再生芽自茎基部切下，转接至生根培养基上进行光照培养，其中优选地采用培养基为1/2mb培养，其中添加0.5-0.7mg/liba，进一步可添加0.1％活性炭。基于研究发现通过删减叶状体的方法诱导茎伸长的不定芽健壮、叶碧绿，极易生根，在1/2mb培养中添加0.5-0.7mg/liba+0.1％活性炭的生根培养基中生长约30d形成发达根系，且苗生长健壮，经炼苗移栽后，成活率高达100％。本发明人也对不同浓度配比的iba对再生芽生根的影响进行了研究，iba对再生芽生根存在浓度效应，低浓度和较高浓度iba均不利于再生芽的生根，其生根率显著低于中等浓度的iba，且开始生根时间长，生根系数低和平均根长均短。结果表明适宜于再生芽生根的iba浓度为0.5-0.7mg/l，生根率高达100％，约10d开始生根，生根系数为3.5-3.8，平均根长达9.8-10.5cm，根呈现出有活力的白色，侧根非常发达。

对于炼苗和移栽步骤可采用常规步骤，但优选采取下述步骤:将生根培养约30d的根系发达的无菌苗先在光照培养室逐渐开盖炼苗4-6d，然后用清水洗净根部培养基，最后移栽至草炭∶蛭石∶园土＝1∶1∶1(体积比)的基质中遮阴保温10-20d，优选为15d。实验结果表明移栽后苗的成活率高达100％，且再生苗生长健壮，叶色碧绿有光泽。

对于上述各方面，本发明也提供一种辣椒子叶离体再生方法，以带柄子叶作为外植体，其中诱导分化不定芽的步骤，继代培养步聚，生根步骤，炼苗和移载步骤分别采取前述介绍的方法进行。通过本发明的这一完整的再生体系，不仅芽诱导分化及其伸长效果很好，而且生根和移载后成活率都很高，这构成本发明最优选的辣椒子叶离体再生的方法。其中上述各步优选参数构成再生方法的优选步骤，因而其中最为优选的是：以带柄子叶外植体在5.0mg/lzt+7.0mg/l6-ba+0.05mg/liaa激素组合的分化培养基中暗培养，再在相同激素组合的分化培养基上光照培养，然后对再生芽进行删减，剩一至二对对生的长条形叶状体在激素组合为5.0mg/lzt+7.0mg/l6-ba+0.05mg/liaa的继代培养基中继续光照培养，接着在1/2ms+0.7mg/liba+0.1％活性炭的生根培养基中光照培养，生根后再炼苗5d后移栽至基质中遮阴保湿继续生长，最终在常规条件下生长。

上述就本发明的各个方面进行了说明，其中有益效果已经分别进行了相应地说明，并在具体实施方式和实施例中有验证。因此，本发明提供了适合于辣椒的不定芽的诱导，继代培养以及完整的再生方法及其所采用的培养基配方，为进一步建立辣椒遗传转化体系的建立奠定了坚实基础。

附图说明

图1∶在5.0mg/lzt+7.0mg/l6-ba+0.05mg/liaa激素组合的分化培养基中暗培养21d的离体子叶。

图2∶在5.0mg/lzt+7.0mg/l6-ba+0.05mg/liaa激素组合的分化培养基中暗培养21d后再在相同激素组合的分化培养基上光照培养7d的离体子叶。

图3∶在激素组合为5.0mg/lzt+7.0mg/l6-ba+0.05mg/liaa的基础上添加2.0mg/lga3的继代培养基中光照培养1周后的叶状体，茎未见伸长。

图4∶在激素组合为5.0mg/lzt+7.0mg/l6-ba+0.05mg/liaa的基础上添加2.0mg/lga3的继代培养基中光照培养1周后的叶状体，茎明显伸长。

图5∶未经删减的叶状体在激素组合为5.0mg/lzt+7.0mg/l6-ba+0.05mg/liaa的继代培养基中继续光照培养2周后，茎未见伸长。

图6∶经删减仅剩一对对生的长条形叶状体在激素组合为5.0mg/lzt+7.0mg/l6-ba+0.05mg/liaa的继代培养基中继续光照培养2周后，茎明显伸长。

图7∶在1/2ms+0.7mg/liba+0.1％活性炭生根培养基中光照培养4周后的辣椒瓶苗。

图8∶在1/2ms+0.7mg/liba+0.1％活性炭生根培养基中光照培养4周后的辣椒生根苗。

图9∶在光照培养室中开盖炼苗5d后移栽至基质中遮阴保湿继续生长15d的辣椒再生苗。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1无菌苗的获得

挑选健康无病菌的辣椒新鲜种子(当年收获)，用纯净水浸种48h，转入超净工作台。先用75％酒精消毒60s，然后用0.1％hgcl2消毒10min，接着用无菌水冲洗4次，2min/次，最后将种子接种于添加3％蔗糖和0.5％琼脂粉的mb培养基(ms大量元素+ms微量元素+ms铁盐+b5有机成分，下同，ph＝5.8)，光照培养(温度：25±2℃，光强：2500lx，光周期：14h光照/10h黑暗，下同)，约7d后种子开始萌发形成无菌苗。

实施例2再生芽的诱导

选取即将展开或刚展开的无菌苗子叶为外植体，用锋利的无菌刀片将子叶从叶柄端切下(带有0.1-0.2cm长的叶柄)，在近叶尖1-2cm处切除叶尖。将两端各有切口的子叶腹面朝上和背面朝下接种于分化培养基上，先暗培养(温度：25±2℃)21d，然后光照培养7d，观察再生芽的分化和生长情况，统计再生芽分化率。再生芽诱导分化培养基以mb为基本培养基，添加iaa(0.05mg/l)与不同浓度配比的6-ba(0、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mg/l)和/或zt(0、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mg/l)组合(ph＝5.8)，每个组合接种10对子叶外植体，设3次重复。

再生芽分化率％＝诱导出再生芽的外植体数/接种的总外植体数×100，下同。

实验结果:

离体子叶先进行暗培养：暗培养3d可见子叶由碧绿转为黄绿，暗培养5d子叶增大增厚，切口处开始形成白色愈伤组织，暗培养10d子叶体积进一步增大，在子叶叶柄端切口表面可见浅黄色透明状愈伤组织，暗培养21d子叶叶柄端切口处分化出黄色叶状体(图1)。离体子叶暗培养21d后见光培养7d，其颜色由浅黄色转为绿色，在子叶背面形成白色愈伤组织，叶柄端切口处再生的叶状体转为绿色，且体积明显增大(图2)。

在iaa为0.05mg/l的基础上，细胞分裂素6-ba和zt不同浓度对辣椒离体子叶再生诱导的效果见表1。从表1中可看出，带柄子叶是一种很容易诱导再生的外植体，单独添加6-ba和zt或者不同浓度ba和zt的组合均能100％诱导带柄子叶叶柄端切口的再生，其再生形成的叶状体的状态存在差异，但未见能正常伸长的再生芽的形成。单独添加1.0-9.0mg/l6-ba，带柄子叶的叶柄端切口分化的叶状体呈玫瑰花瓣状，且数量较多；1.0-4.0mg/l6-ba条件下子叶形成的愈伤组织相对少，叶状体生长缓慢，而5.0-9.0mg/l6-ba条件下子叶形成的愈伤组织较多，叶状体生长较快。单独添加不同浓度zt诱导子叶再生的叶状体形态存在明显差异：低浓度zt(1.0-3.0mg/l)条件下形成的叶状体短小呈玫瑰花瓣状，其数量也少；zt浓度增加至5.0-9.0mg/l时，子叶叶柄端切口处形成的叶状体较大，大部分叶状体呈玫瑰花瓣状，少部分呈长条形。然而，由于zt诱导子叶形成的愈伤组织少，叶状体生长缓慢。不同浓度6-ba和zt组合能100％诱导子叶叶柄端切口分化形成叶状体，且数量较多，但是不同浓度组合诱导再生的叶状体状态及其生长存在差异：低浓度6-ba和低浓度zt组合诱导的叶状体的体积小呈玫瑰花瓣状，数量较少，生长缓慢，随着6-ba和zt浓度的增加，诱导的叶状体体积较大和数量多，当6-ba≥5.0mg/l时，由于子叶形成较多的愈伤组织，叶状体生长较快。3.0-9.0mg/lzt和5.0-9.0mg/l6-ba组合均能使子叶离体再生许多的叶状体，大部分叶状体呈玫瑰花瓣状，少部分呈长条形，且叶状体生长快，因此该浓度组合适宜于子叶离体再生的诱导。

表1不同浓度zt和/或6-ba配比对辣椒离体子叶再生的影响

注:其中每个处理均添加了0.05mg/liaa

实施例3再生芽的伸长

在实施例2的基础上进行再生芽的伸长实验。

1.ga3对再生芽伸长的影响

将叶状体再生芽置于不同浓度ga3配比的伸长培养基上光照培养，10d继代一次，20d后观察再生芽伸长情况，并统计再生芽的伸长频率。诱导再生芽伸长的培养基以mb为基本培养基，在上述获得的适宜的分化培养基的激素组合的基础上添加不同浓度配比的ga3(1.0、2.0、3.0mg/l)，每个组合接种10个带有叶状体再生芽的子叶，1个子叶/瓶，设3次重复。

再生芽伸长率％＝诱导茎伸长的带有再生芽的子叶数/接种的带有再生芽的子叶总数×100，下同。

实验结果:

辣椒离体子叶在分化培养基上可诱导再生形成不同状态的叶状体，约98％的子叶形成的叶状体数量多且大部分呈玫瑰花瓣状，仅有约2％的子叶形成的叶状体数量少且呈长条形。ga3对不同状态叶状体的茎伸长的影响存在浓度差异：当离体子叶再生的叶状体数量多且呈玫瑰花瓣状态时，在1.0-2.0mg/lga3条件下生长1周后的叶状体呈黄色，叶明显伸长且变薄，但是未形成正常伸长的不定芽(图3)，继续生长1周后的离体子叶愈伤组织褐化，叶状体脱落；3.0mg/lga3条件下生长1周后的叶状体明显伸长，但易形成水渍状，也未形成茎伸长的再生芽。当离体子叶再生的叶状体呈长条形和对生状态，且叶状体的数量少(为1-3对)时，1.0-2.0mg/lga3条件下生长1周后，茎明显伸长，叶柄及叶片也伸长，叶黄化变薄(图4)；3.0mg/lga3条件下的叶状体茎也能明显伸长，但是苗易形成水渍状。因此，1.0-2.0mg/lga3对离体子叶再生形成的数量少呈长条形对生的叶状体的茎伸长具有明显的促进作用，对玫瑰花瓣状叶状体及非对生状叶状体茎的伸长的作用不明显。

2.删减再生芽数量对再生芽伸长的影响

辣椒离体子叶在适宜的分化培养基上诱导再生形成的叶状体数量多且大部分为畸形的玫瑰花瓣状，少数为长条形，它们在分化培养基上继续生长未见茎的伸长(图5)。将叶状体再生芽用锋利的无菌刀片切除畸形的玫瑰花瓣状叶状体，只留1-2个正常的不定芽(叶片呈对生的长条形)在继代培养基中进行光照培养，7d继代一次，20d后观察再生芽伸长情况，并统计再生芽的伸长频率。继代培养基配方：mb为基本培养基，添加iaa(0.05mg/l)与不同浓度配比的6-ba(1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mg/l)和/或zt(1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mg/l)组合(ph＝5.8)。

实验结果:

经删减的再生芽继代培养2周后，其茎明显伸长，叶片碧绿呈长椭圆形，茎粗壮(图6)。继代培养基中不同浓度配比的zt和ba对不定芽伸长的影响见表2。从表2中可以看出，在添加iaa(0.05mg/l)的基础上：1.0mg/lzt与1.0-9.0mg/l6-ba组合能使再生芽的茎伸长率≤40％；随着zt浓度的增加，叶状体茎的伸长率明显升高，3.0-7.0mg/lzt与5.0-9.0mg/l6-ba组合能使再生芽伸长率高于67％。5.0-7.0mg/lzt与7.0mg/l6-ba组合的再生芽伸长率最高，为88％-90％，显著高于其它组合，即为适宜于再生芽伸长的继代培养基中的激素组合。经删减仅剩1-2个正常的不定芽(叶片呈对生的长条形)在适宜的继代培养基上生长约15d后，芽伸长约4-5cm，为3-4叶1心的生长阶段。

表2不同浓度配比的zt和ba对再生芽伸长的影响

注：同一列不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异；其中每个处理均添加了iaa0.05mg/l。

实施例4再生芽的生根

选取实施例3中获得的生长健壮高度达4.0-5.0cm的再生芽(3-4叶1心)自基部切下(不带愈伤组织)，转接至生根培养基中进行光照培养，30d后计算生根率、平均生根数和平均根长。生根培养基以1/2mb为基本培养基，添加活性炭(0.1％)和不同浓度配比的iba(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/l)(ph＝5.8)，每个处理接种10个再生芽，1个再生芽/瓶，重复3次。

生根率(％)＝生根的再生芽数/接种的再生芽总数×100

平均生根数＝根的总数/接种的再生芽总数

平均根长(cm)＝根长总长/根的总数

实验结果:

分别将经ga3诱导和删减叶状体使茎伸长的再生芽自茎基部切下，转接至生根培养基上进行光照培养，两者的生根效率存在明显差异。经ga3诱导伸长的不定芽生根困难，叶色发黄难以转绿。

而删减叶状体使茎伸长的再生芽极易生根，在生根培养基中约10d左右开始生根，30d后形成健壮的生根苗，根系发达，茎粗壮，叶碧绿(图7，8)。对不同浓度配比的iba对再生芽生根的影响进行了实验，结果见表3。表3的结果表明，iba对再生芽生根存在浓度效应，低浓度和较高浓度iba均不利于再生芽的生根，其生根率显著低于中等浓度的iba，且开始生根时间长，生根系数低和平均根长均短。适宜于再生芽生根的iba浓度为0.5-0.7mg/l，生根率高达100％，约10天开始生根，生根系数为3.5-3.8，平均根长达9.8-10.5cm，根呈现出有活力的白色，侧根非常发达。

表3.不同浓度iba对再生芽生根的影响

注：同一列不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异

实施例5炼苗和移栽

对实施例4中生根培养后的再生苗进行炼苗移栽。将生根培养约30d的根系发达的无菌苗先在光照培养室逐渐开盖炼苗5d，然后用清水洗净根部培养基，最后移栽至草炭∶蛭石∶园土＝1∶1∶1(体积比)基质中遮阴保温15d，移栽15d后统计成活率。

成活率(％)＝成活的苗数/炼苗总数×100

实验结果:

移栽后15d苗的成活率高达100％，且再生苗生长健壮，叶色碧绿有光泽(图9)。随后就可以在常规条件下生长。