一种条斑紫菜贝壳丝状体溶壳剂的应用的制作方法

本发明涉及紫菜养殖的发育学及病害学领域，具体涉及一种紫菜贝壳丝状体的观察方法。

背景技术：

紫菜养殖是我国水产养殖的重要组成部分，养殖产量和面积居世界第一。因其具有极高的营养价值，深受各国人民喜爱。紫菜生长在潮间带，能够吸收海水中大量的氮、磷，具有十分重要的生态意义。紫菜生活史分为二倍体的丝状体时期和单倍体的叶状体时期。其中丝状体能够溶解钙质，钻入表面富含钙质的贝壳中，形成贝壳丝状体渡过夏季高温。贝壳丝状体在秋季成熟膨大并释放壳孢子，其放散量和附着程度直接影响紫菜海区栽培生产的顺利进行。紫菜贝壳丝状体病害常发生于育苗中期，特别是高温天气，其传播速度快、影响范围广，对紫菜的育苗造成巨大损失。要观察患病贝壳丝状体组织病理情况，需将藻体尽可能无损伤、完整的从贝壳上刮下。

柏兰尼液(perenyi’ssolution)和醋酸海水是经常用于观察紫菜种苗培育的贝壳丝状体发育状态的试剂，对于判断壳孢子采苗时间、保证海区栽培生产的顺利进行具有重要意义。柏兰尼液能够溶解贝壳珍珠层，使藻丝层轻易刮下。本研究以条斑紫菜自由丝状体和贝壳丝状体为研究对象，以柏兰尼液作为溶壳试剂，观察不同浸泡时间对藻体的损伤情况，筛选最佳的浸泡时间，为贝壳丝状体病害组织病理观察提供技术支持。

将丝状体从贝壳中刮下是能对条斑紫菜贝壳丝状体组织病理观察的关键。一方面，柏兰尼液呈现强酸性，能够使贝壳表面的珍珠层变薄，也会引起碳酸钙晶体构型发生变化，导致丝状体附着不紧密[11]。另一方面，柏兰尼液能够引起细胞膜通透性发生变化[12-14]，可溶性糖类增加[15]，导致丝状体液泡内容物溶出，液泡消失，丝状体体积减小，与贝壳珍珠层间隙增大,使藻丝更易从贝壳上刮取。

光合作用是植物重要的基础生理过程，利用叶片将吸收的太阳能转化为自身生长发育所需的化学能，影响植物的生长发育。光系统ii(psii)是光合作用中吸收、转换及光合电子传递的重要部分。许多因素如重金属、干旱、盐胁迫及病原侵染等都会引起psii活性和功能降低。光系统ii最大光量子产量化效率(fv/fm)是一个物种恒定值，非胁迫条件下变化极小，不受物种和生长条件影响，胁迫条件下参数明显下降。为植物生长状态下产生的光量子，受实际生长环境影响。非光化学淬灭反映的是psⅱ天线色素吸收的过量光能而以热的形式耗散掉的部分。如不能及时地耗散这部分光能，将会产生大量活性氧对光合机构造成失活或破坏，所以非光化学淬灭是一种自我保护机制，对光合机构起一定的保护作用。在严重胁迫条件下fv/fm、和npq下降，说明类囊体功能丧失，光合活性显著降低。这与柏兰尼浸泡后的变化趋势一致，说明柏兰尼液能破坏条斑紫菜贝壳丝状体光合系统，且浓度越高、浸泡时间越长，对丝状体的损伤越严重。

技术实现要素：

为了解决现有紫菜贝壳丝状体观察困难的问题，我们提出了一种条斑紫菜贝壳丝状体溶壳剂的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

为实现上述目的，本发明提供一种条斑紫菜贝壳丝状体溶壳剂的应用，采用柏兰尼液作为溶壳剂，通过柏兰尼液浸泡条斑紫菜贝壳丝状体后进行病害组织病理观察；其中柏兰尼液配方如下：

10％硝酸100-300ml，

95％酒精100-200ml，

0.5％铬酸100-200ml；

柏兰尼液的应用方法如下：

(1)条斑紫菜丝状体养殖条件：温度20℃，盐度28‰，光强20μmol/m2s，光周期l:d＝12:12，每3天换1次pes海水；

(2)将紫菜贝壳丝状体敲碎后，挑取大小相似的碎片(小于1cm×1cm)，分别将其表面水分吸干后完全浸入柏兰尼液；

(3)柏兰尼液浸泡时间为60-300秒，浸泡后立即用海水清洗3次后刮取紫菜贝壳丝状体进行观察。

优选地，上述柏兰尼液的配方如下：

10％硝酸200ml，

95％酒精150ml，

0.5％铬酸150ml。

优选地，上述柏兰尼液浸泡时间为90秒。

优选地，上述紫菜贝壳丝状体观察包括显微镜直接观察、光化学测定、扫描电镜观察等。

优选地，上述光化学测定包括使用叶绿素成像仪测定紫菜贝壳丝状体浸泡溶壳剂前后光系统ii最大光量子产量化效率(fv/fm)、光系统ii光化学量子产量和稳态非光化荧光淬灭(npq)变化。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)确定柏兰尼液为最佳溶壳剂，浸泡柏兰尼液90s后刮取丝状体损伤较小，观察效果较好，为最佳作用时间。

附图说明

图1为本发明不同溶壳剂不同浸泡时间刮取条斑紫菜贝壳丝状体效果比较；其中a-e柏兰尼液中浸泡60s、75s、90s、105s和120s；f-i2倍稀释柏兰尼液浸泡2min、3min、4min和5min；j4倍稀释柏兰尼液浸泡5min；k-l7％醋酸海水浸泡8min和16min；m-n10％醋酸海水浸泡8min和16min；o-p15％醋酸海水浸泡8min和16min；q-r20％醋酸海水浸泡8min和16min；

图2为本发明不同溶壳剂不同浸泡时间刮取条斑紫菜贝壳丝状体显微镜观察；其中a-h柏兰尼液中浸泡60、75s、90s、105s、2min、3min、4min和5min；i-l2倍稀释柏兰尼液浸泡2min、3min、4min和5min；m4倍稀释柏兰尼液浸泡5min；n-o7％醋酸海水浸泡8min和16min；p-q10％醋酸海水浸泡8min和16min；r-s15％醋酸海水浸泡8min和16min；t-u20％醋酸海水浸泡8min和16min；

图3为本发明不同溶壳剂浸泡条斑紫菜自由丝状体不同时间显微镜观察；其中a未浸泡；b-l柏兰尼液浸泡15s、30s、45s、60s、75s、90s、105s、2min、3min、4min和5min；m-p2倍稀释柏兰尼液浸泡2min、3min、4min和5min；q4倍稀释柏兰尼液浸泡5min；r-s7％醋酸海水浸泡8min和16min；t-u10％醋酸海水浸泡8min和16min；v-w15％醋酸海水浸泡8min和16min；x-y20％醋酸海水浸泡8min和16min；

图4为本发明条斑紫菜贝壳丝状体浸泡不同浓度柏兰尼液不同时间状态变化；其中a浸泡前；b浸泡后，1-12：柏兰尼液浸泡0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s、105s、2min、3min、4min和5min；13-16：2倍稀释柏兰尼液浸泡2min、3min、4min和5min；17：4倍稀释柏兰尼液浸泡5min；

图5为本发明条斑紫菜贝壳丝状体浸泡不同浓度柏兰尼液不同时间后可变叶绿素荧光参数；其中a光系统ii最大光量子产量化效率(fv/fm)；b光系统ii光化学量子产量c稳态非光化荧光淬灭(npq)*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns无显著性差异；

图6为本发明条斑紫菜自由丝状体浸泡柏兰尼液90s后扫描电镜观察；其中a-b未浸泡；c-d浸泡柏兰尼液90s。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：

柏兰尼液配制：

10％硝酸200ml，95％酒精150ml，0.5％铬酸150ml。

条斑紫菜丝状体养殖条件：

温度20℃，盐度28‰，光强20μmol/m2s，光周期l:d＝12:12，每3天换1次pes海水。

条斑紫菜贝壳丝状体浸泡溶壳剂不同时间对刮取效果影响：

将紫菜贝壳丝状体敲碎后，挑取大小相似的碎片(小于1cm×1cm)，分别将其表面水分吸干后完全浸入柏兰尼液60s、75s、90s、105s、2min、3min、4min和5min；2倍稀释柏兰尼液2min、3min、4min和5min；4倍稀释柏兰尼液5min；7％、10％、15％和20％的醋酸海水8min和16min，立即用海水清洗3次，用刮刀轻轻刮取表面藻丝，观察其完整情况，将丝状体平铺于载玻片上，盖上盖玻片后轻轻敲打使丝状体自然散开，显微镜观察贝壳丝状体形态，重复3次。

参照图1和图2，不同溶壳剂作用下条斑紫菜贝壳丝状体刮取效果有较大差异。总体上溶壳剂浓度越高，作用时间越长，刮取贝壳丝状体越容易。柏兰尼液浸泡柏兰尼液60和75s虽然能将藻丝刮下，但刮取的藻丝较为破碎(图1a-b)；浸泡90s以上时藻丝能轻易、完整的从贝壳上刮取(图1c-e)。将柏兰尼液稀释2倍后作用贝壳丝状体发现其气泡冒出速度明显小于原液，浸泡4min才能将藻丝从贝壳上完整刮取(图1h)。稀释4倍后，浸泡5min仍然不能将丝状体从贝壳上完整刮取(图1j)。醋酸海水作为溶壳剂浸泡时间较长且效果明显不如柏兰尼液。较低浓度(7-10％)醋酸海水浸泡贝壳丝状体8min后刮取可见明显的藻红素溶出现象，对丝状体造成损伤，延长浸泡时间为16min后，藻红素溶出现象仍未减少且不能将丝状体贝壳上完整刮取(图1k-n)。提高醋酸海水浓度(15-20％)浸泡贝壳丝状体8min后刮取藻丝未见明显的藻红素溶出，但有大量的藻丝未被刮取，延长浸泡时间至16min仍不能将藻丝完整刮取(图1o-r)。

对刮取后的贝壳丝状体进行显微镜观察发现柏兰尼液作用贝壳丝状体少于90s时会出现大量的钙质，浸泡60s刮取后对细胞有部分损伤，呈现绿色(图2a)，说明溶解贝壳钙质不完全，部分丝状体没有完全与贝壳分离就被刮取，细胞出现损伤；浸泡75s时虽然对细胞无明显损伤，但仍存在大量钙质，影响观察(图2b)。随着浸泡时间的增加，贝壳丝状体形态无明显的差异，但颜色出现明显变化，浸泡90s-3min时，丝状体颜色呈现棕红或棕黄色(图2c-f)，浸泡4-5min时部分区域的细胞呈现黄色(图2g-h)，说明随着浸泡时间的增加，贝壳丝状体形态无明显差异，但胞质内成分变质程度愈发严重。2倍稀释柏兰尼液浸泡2min和4倍稀释柏兰尼液浸泡5min虽然能将丝状体刮下，但观察时有大量钙质存在，影响观察(图2i、m)；2倍稀释柏兰尼液作用4-5min时，丝状体变黄(图3-2k-l)，作用3min效果较好(图2j)。低浓度醋酸海水(7％-10％)作用贝壳丝状体作用贝壳丝状体刮取后观察，可发现丝状体细胞呈现绿色(图2n-q)，说明细胞损伤，藻红素溶出，这与宏观观察的结果一致；增加醋酸海水浓度(15％-20％)，丝状体颜色为正常的棕黄色，说明丝状体与贝壳之间结合松散，刮取不会引起细胞损伤，但刮取时会将钙质一同刮下，使得丝状体聚集在钙质中，成团不分散，影响观察(图2r-u)。综上所述，柏兰尼液溶壳效果明显好于醋酸海水。

条斑紫菜自由丝状体浸泡溶壳剂不同时间后形态变化：

选取大小相似的条斑紫菜自由丝状体小球，将表面水分吸干后完全浸入柏兰尼液0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s、105s、2min、3min、4min和5min；2倍稀释柏兰尼液2min、3min、4min和5min；4倍稀释柏兰尼液5min；7％、10％、15％和20％的醋酸海水8min和16min，，将丝状体平铺于载玻片上，盖上盖玻片后轻轻敲打使丝状体自然散开，显微镜观察自由丝状体形态变化，重复3次。

参阅图3，对条斑紫菜自由丝状体浸泡不同溶壳剂不同时间后形态进行显微镜观察，发现丝状体损伤随着浸泡时间的增加愈发严重，最为明显的就是细胞体积的变化，浸泡溶壳剂时间越长，丝状体细胞体积越小，浸泡后的自由丝状体均出现质壁分离的现象，但程度与浸泡时间无明显相关性。浸泡柏兰尼液1min以内时，部分丝状体细胞还存在液泡，但体积已经缩小(图3b-d)，浸泡1min及以上时，液泡消失(图3e-l)。另一明显的现象是浸泡时间为2min以内时，细胞颜色呈现棕黄色，超过2min后，呈现粉红色(图3i-l)，说明细胞内藻红蛋白变质程度随着浸泡柏兰尼液时间的能进而愈发严重。稀释后的柏兰尼液浸泡自由丝状体后均出现质壁分离、液泡消失的现象，颜色随着浸泡时间的增加有棕红色转变为橙黄色，未见其他明显的差异(图3m-q)。醋酸浸泡后的自由丝状体可发现明显的质壁分离，无液泡存在，与柏兰尼液结果一致，说明质膜有一定程度的损伤，随着醋酸浓度的提高(20％)，有部分丝状体细胞呈现粉红色，说明藻红素变性程度提高(图3w-y)，其他浓度丝状体细胞无明显差异。

条斑紫菜贝壳丝状体浸泡不同浓度柏兰尼液不同时间损伤情况测定：

将紫菜贝壳丝状体敲碎后，挑取大小相似的碎片平铺于玻璃平皿中，加入少量的海水使贝壳丝状体保持湿润，将紫菜贝壳丝状体表面水分吸干后完全浸入柏兰尼液0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s、105s、2min、3min、4min和5min；2倍稀释柏兰尼液2min、3min、4min和5min；4倍稀释柏兰尼液5min，使用fluorcam800mf叶绿素成像仪(psi，捷克)测定紫菜贝壳丝状体浸泡溶壳剂前后光系统ii最大光量子产量化效率(fv/fm)、光系统ii光化学量子产量和稳态非光化荧光淬灭(npq)变化，以此判断条斑紫菜贝壳丝状体损伤情况，重复3次。

参阅图4和图5，从叶绿素荧光动力学参数可以看出柏兰尼液对条斑紫菜贝壳丝状体光系统ii的损伤情况随其浓度和浸泡时间的变化而不同。整体上看，柏兰尼液浓度越高，浸泡时间越长对丝状体光系统ii损伤越大(图4)。条斑紫菜贝壳丝状体浸泡柏兰尼液后，fv/fm值有极显著减小，浸泡1-2min及2min-4min间无显著性差异；2倍稀释柏兰尼液浸泡2-3min、3-4min及4-5min间无显著性差异，且浸泡2-3min与柏兰尼原液浸泡60-105s间无显著性差异，浸泡3-4min与原液浸泡1-2min间无显著性差异；4倍稀释柏兰尼液浸泡5min与原液浸泡30-45s及2倍稀释柏兰尼液浸泡2min间无显著性差异(图5a)。值有类似的趋势，柏兰尼液浸泡30-60s、45-75s、60-90s、105s-4min间无显著性差异；2倍稀释柏兰尼液浸泡3-5min间无显著性差异，浸泡2min与原液浸泡30-45s间无显著性差异，浸泡3-4min与原液浸泡1-2min间无显著性差异，浸泡5min与原液浸泡90s-5min间无显著性差异；4倍稀释柏兰尼液浸泡5min与原液浸泡30-75s及2倍稀释柏兰尼液浸泡2min间无显著性差异(图5b)。npq值向较fv/fm及趋势不明显，整体上看浸泡柏兰尼液后比浸泡前数值显著降低，但不同浓度柏兰尼液及不同浸泡时间对npq影响无显著性差异(图5c)。综上所述，柏兰尼液浸泡条斑紫菜贝壳丝状体90s后刮取观察效果好，且对丝状体的损伤相对较小，为最佳的溶壳剂及溶壳时间。

扫描电镜样品处理：

将样品置于电镜固定液(0.1m磷酸缓冲液(pbs)，2.5％戊二醛和2％多聚甲醛)中4℃固定4h，随后用pbs洗涤3次。样品经乙醇梯度脱水(30％、50％、70％、85％、90％乙醇脱水各1次，100％乙醇脱水2次，每次15min)后，进行后续干燥、粘拖、镀膜及观察。

参阅图6，正常自由丝状体表面光滑，有较少的分泌物质(图6a-b)。浸泡柏兰尼液90s后，丝状体大量失水造成表面可见明显皱缩，体积减小，质膜损伤，胞内部分物质溶出，聚集在丝状体表面或成团分布，这与显微镜观察的结果一致，说明柏兰尼液能影响丝状体细胞膜通透性，且为高渗溶液，使液泡内贮存水分大量溶出，并伴随大量胞内的物质溶出，细胞失去膨胀液泡的支撑，造成体积减小，表面皱缩，但未见明显的细胞破损(图6c-d)。

综上，通过不同溶壳剂浸泡不同时间观察刮取样品的完整性及形态变化，通过扫描电子显微镜观察及叶绿素荧光参数的变化判断丝状体的损伤情况。确定柏兰尼液为最佳溶壳剂，浸泡柏兰尼液90s后刮取丝状体损伤较小，观察效果较好，为最佳作用时间。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。