利用外生菌根真菌辅助黑松改良重金属污染土壤的方法与流程

本发明属于重金属污染土壤改良和生物技术领域，具体涉及一种利用外生菌根真菌辅助黑松改良重金属污染土壤的方法。

背景技术：

随着人类活动的日益频繁，大量的矿产资源被开发利用，工业生产迅速发展，各种化学产品、农药化肥被广泛施用甚至滥施滥用，含有重金属的污染物通过各种途径（如采矿及冶炼、废水浇灌、化肥及农药的施用等）进入到土壤环境中。而由于重金属会对植物、土壤动物等产生毒害，导致含有重金属的土壤又不利于植物生长，因此进一步导致了这些土壤上无植被覆盖，进而导致绿化缺失和水土流失。

在园林绿化过程中，为了复绿这些含重金属的土壤，一般有两种做法：一是客土覆盖，将含重金属的土壤移走，换上不含重金属的土壤，但是这种方法会将污染带到其他的地方；另一种方法是使用土壤改良剂，但会带来二次污染，破坏土壤理化性质，只能在一定程度上改善土壤。因此找到一种安全有效的改良重金属污染土壤的方法变得尤为重要。外生菌根真菌是一类土壤中普遍存在的真菌，能与木本植物形成互惠共生的菌根结构，促进宿主植物的水分及营养吸收，提高宿主植物对干旱、病虫害、重金属胁迫等不良环境的抗性。

文献1“外生菌根真菌与重金属相互作用研究现状，江苏林业科技2004年”根据国内外的菌根文献资料，综述了外生菌根真菌与重金属相互作用，外生菌根真菌与重金属的作用是相互的，同时阐述了外生菌根真菌对重金属的抵抗机理，及其在森林土壤污染治理中的应用前景。文献2“外生茵根真菌对油松幼苗生长的影响，四川林业科技2011年”用红蜡蘑、美味牛肝菌、铆钉菇、厚环乳牛肝菌、褐环乳牛肝菌株等5种外生菌根真茵的固体培养物对油松幼苗进行接种实验，研究外生菌根真菌对其生长的影响，结果表明部分外生菌根真菌能明显提高苗木的茵根化程度，对幼苗的生长有促进作用，提高了植株对养分npk的吸收；通过上述方法筛选获得促进油松根化育苗的优良菌。文献3“外生菌根真菌菌株耐盐碱性筛选以及黑松(pinusthunbergiiparl．)菌根苗合成、耐盐碱性研究，学位论文”，检测了18种外生菌根真菌对黑松生长以及处理盐碱地的影响，其中，仅仅有两种外生菌根真菌能够促进黑松生长以及处理盐碱地，分别是彩色豆马勃和紫晶蜡蘑。通过上述研究可以说明，只有少量外生菌根真菌与重金属能够存在相互作用，而且外生菌根真菌与特定植物之间存在寄生关系，选择合适的外生菌根真菌较为关键。

技术实现要素：

本发明的目的在于利用外生菌根真菌辅助植物对重金属污染土壤进行改良，从而获得一种安全有效的改良重金属污染土壤的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种利用外生菌根真菌辅助黑松改良重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1）培育黑松幼苗，步骤2）制备外生菌根真菌菌剂，步骤3）培育菌根化黑松，步骤4）重金属污染土壤改良。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

步骤1）培育黑松幼苗：采集当年黑松种子，于4℃种子培养箱中保存；称取10克种子，自来水冲洗后，双氧水消毒，洗净后用清水浸泡24小时，然后35℃黑暗培养箱中放置24小时进行催芽；再播种于装有灭菌蛭石的方筛中，方筛下套一个不透水的周转箱，均匀播种，并在种子上盖一层灭菌蛭石，浇透水后，用保鲜膜包裹整个育苗装置，并在上部戳透气孔；将整套装置放置于30℃黑暗培养箱中培养，按需浇水，保持蛭石表面湿润；待种子长出侧根后进行接种；

步骤2）制备外生菌根真菌菌剂：将混合基质a与液体培养基a按照体积比1:1混合均匀，装于广口罐头瓶中，封口膜封口后，121℃灭菌20分钟；在无菌环境下，将外生菌根真菌于固体培养基b平板上扩繁15天，将菌丝体用无菌打孔器分割成直径1cm的菌块，均匀接种于罐头瓶中的灭菌基质中，每瓶接种10块，接种后封口膜封口，将罐头瓶放置于25℃黑暗培养箱中培养1个月，得到外生菌根真菌菌剂；

步骤3）培育菌根化黑松：将外生菌根真菌菌剂和灭菌混合基质c混合均匀，挑选长势良好侧根发达的松树苗，清洗幼苗根系并减掉主根后移栽于盆钵内，每盆钵移栽20棵幼苗，每隔3-4天浇水一次；接种40-60天后，检查黑松菌根化率；

步骤4）重金属污染土壤改良：将重金属污染土壤装入塑料花盆中，将菌根化黑松种入装有重金属污染土壤的花盆中，种植6个月后，统计植株存活率、土壤理化性质，评价改良效果。

优选地，所述外生菌根真菌为酒红褶粘滑菇或红蜡蘑。

优选地，所述外生菌根真菌为酒红褶粘滑菇。

优选地，所述混合基质a的组分为：草炭和蛭石按体积比1:1均匀混合。

优选地，所述液体培养基a配方为：glucose10g/l,maltextract3g/l,kh2po40.5g/l,(nh4)2hpo40.25g/l,mgso4·7h2o0.15g/l,fecl3·6h2o0.03g/l,cacl20.05g/l,nacl0.025g/l,vitaminb10.1mg/l,去离子水1l,ph5.6-5.8。

优选地，所述固体培养基b配方为：glucose10g/l,maltextract3g/l,kh2po40.5g/l,(nh4)2hpo40.25g/l,mgso4·7h2o0.15g/l,fecl3·6h2o0.03g/l,cacl20.05g/l,nacl0.025g/l,vitaminb10.1mg/l,agar13g/l,去离子水1l,ph5.6-5.8。

优选地，所述混合基质c组分为：鹿沼土+蛭石按1:1体积比混合。

优选地，所述步骤2）中，外生菌根真菌菌剂和灭菌混合基质c按1:1体积比混合均匀。

优选地，所述双氧水消毒为：用10%的双氧水浸泡消毒30分钟。

本发明相比现有技术具有但是并不限于如下优点：

在现有技术的基础上，本发明通过大量试验筛选菌株，包括彩色豆马勃、紫晶蜡蘑、红蜡蘑、美味牛肝菌、铆钉菇、酒红褶粘滑菇等菌株，发现只有红蜡蘑、酒红褶粘滑菇能够在高浓度重金属污染的土壤中促进黑松生长，并且降低重金属有效态含量，酒红褶粘滑菇菌根化苗要明显优于红蜡蘑菌根化苗，其余几种菌株难以在重金属土壤中和黑松共生；

本发明获得适合黑松在重金属污染土壤中的外生菌根真菌酒红褶粘滑菇，克服了黑松在重金属土壤中生长缓慢的技术壁垒，属本领域首创，实际应用意义非常重大，黑松经侵染后根系数目增加，生长良好，将黑松种植在重金属污染土壤中后，成活率有显著提高，并且土壤重金属有效态含量显著降低，土壤质量显著提高；

本发明方法简单环保，不会带来二次污染，并且所使用微生物广泛存在于土壤中，不会引入生物安全问题。

附图说明

图1：黑松苗接种60天后根系外生菌根形态（体视显微镜下拍摄菌根形态照片）；

图2：黑松苗在重金属污染土壤中种植6个月后生长情况。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的原料，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

以黑松为材料，采用红蜡蘑和酒红褶粘滑菇两种外生菌根真菌制作菌剂，分别接种于黑松幼苗根系，于接种后40天测定幼苗生长状况，并用体视显微镜观察幼苗根系菌根率。树苗接种60天后移栽于装有重金属污染土壤的盆钵中，移栽6个月后观察植株的生长情况，分析土壤理化性质。

1.培育黑松幼苗：采集当年黑松种子，于4℃种子培养箱中保存。称取10克种子，自来水冲洗后，用10%的双氧水浸泡消毒30分钟，洗净后用清水浸泡24小时，然后35℃黑暗培养箱中放置24小时进行催芽。播种于装有灭菌蛭石的方筛（40cm×25cm×10cm）中，方筛下套一个不透水的周转箱（40cm×25cm×15cm）。均匀播种，并在种子上盖一层灭菌蛭石（厚度≤5mm），浇透水后，用保鲜膜包裹整个育苗装置，并在上部戳几个透气孔。将整套装置放置于30℃黑暗培养箱中培养，按需浇水，保持蛭石表面湿润。待种子长出侧根（播种后的2个月左右）后进行接种。

2.制备外生菌根真菌菌剂：将混合基质a与液体培养基a按照体积比1:1混合均匀，分装于500ml的广口罐头瓶中，封口膜（14cm×14cm）封口后，121℃灭菌20分钟。在无菌环境下，将2种外生菌根真菌菌种分别于固体培养基b平板上扩繁15天，将固体培养基b上保存培养的外生菌根真菌（红蜡蘑1#和酒红褶粘滑菇2#）菌丝体用无菌打孔器（直径1cm）分割成直径1cm的菌块，均匀接种于罐头瓶中的灭菌基质中，每瓶接种约10块左右，接种后封口膜封口，将罐头瓶放置于25℃黑暗培养箱中培养1个月左右。

所述的方法在于步骤2）中采用的混合基质a组分为：草炭和蛭石按体积比1:1均匀混合；液体培养基a配方为：glucose10g/l,maltextract3g/l,kh2po40.5g/l,(nh4)2hpo40.25g/l,mgso4·7h2o0.15g/l,fecl3·6h2o0.03g/l,cacl20.05g/l,nacl0.025g/l,vitaminb10.1mg/l,去离子水1l,ph5.6-5.8；固体培养基b配方为：glucose10g/l,maltextract3g/l,kh2po40.5g/l,(nh4)2hpo40.25g/l,mgso4·7h2o0.15g/l,fecl3·6h2o0.03g/l,cacl20.05g/l,nacl0.025g/l,vitaminb10.1mg/l,agar13g/l,去离子水1l,ph5.6-5.8。

3.培育菌根化黑松：将外生菌根真菌菌剂和灭菌混合基质c按1:1体积比混合均匀，分装于塑料花盆（外口直径21cm，底部直径12cm，高度10cm）内，挑选长势良好侧根发达的松树苗，清洗幼苗根系并减掉主根后移栽于盆钵内，每盆钵移栽约20棵幼苗，每隔3-4天浇水一次。接种40-60天后，检查黑松菌根化率。同时准备不接种的黑松。

4.重金属污染土壤改良：采集两种重金属污染土壤（ⅰ和ⅱ），分别将其装入塑料花盆中（底径10cm，口径7cm，高度8.5cm），每盆中装入350g风干土。重金属污染土壤ⅰ中重金属浓度分别为：pb（总量：156mg/kg，有效态：11mg/kg），zn（总量：4140mg/kg，有效态：246mg/kg），cd（总量：150mg/kg，有效态：13mg/kg）；所使用的重金属污染土壤ⅱ中重金属浓度分别为：pb（总量：163mg/kg，有效态：17mg/kg），zn（总量：2144mg/kg，有效态：199mg/kg），cd（总量：31mg/kg，有效态：3mg/kg）。

接种60天后，挑选长势相似的两种菌根化黑松及未接种的黑松，分别种入装有重金属污染土壤（ⅰ和ⅱ）的花盆中，每盆中种入3株，每种土壤中每种黑松准备3盆。种植6个月后，统计植株存活率、土壤理化性质，评价改良效果。结果见图1，图2，表1，表2，表3。

表1黑松幼苗移栽6个月后存活数和存活率

表2黑松幼苗种植6个月后土壤中重金属有效态含量

表3黑松种植黑松前后土壤脲酶和酸性磷酸酶的活性

黑松幼苗接种外生菌根真菌60天后，体式显微镜观察发现，所有接种后的幼苗根系均成功与外生菌根真菌形成良好的菌根结构（图1）。在重金属污染土壤中种植6个月后，接种外生菌根真菌的黑松存活率显著高于未接菌黑松，酒红褶粘滑菇根化黑松的存活率为100%，高于红蜡蘑根化黑松的89%（图2，表1），并且土壤中的重金属有效态含量显著降低，土壤酶活显著增加，酒红褶粘滑菇处理组在各方面指标中均明显优于红蜡蘑处理组（表2-3）。

本发明验证了酒红褶粘滑菇根化黑松在改良重金属污染土壤中具有可实施性，具有显著提高黑松生长及存活率的作用，并且能极大改良土壤理化性质，为重金属污染土壤的水土保持及复绿提供了理论和技术支持。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，或在实施案例之外的树种实施本方法，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。