茶树品种耐寒力的鉴定方法与流程

本发明涉及植物冬季耐寒力鉴定的领域，具体地说是涉及一种利用冰箱冷冻茶树新梢，然后测定冷冻前后茶树叶片色差值变化，用以预测茶树冬季田间耐寒力的方法。
背景技术：
：茶树起源于我国西南地区热带雨林，对生长环境具有喜温怕冷的特性。因此茶树引种地区冬季低温胁迫引起冻害是茶树栽培中常见的自然灾害，它可以导致茶树生长受到严重抑制，严重时还会造成茶树伤害甚至死亡，给茶叶生产带来严重的损失。然而，茶树在长期的传播和演化过程中，因分布地区不同而经受了不同的冬季低温环境胁迫，不同品种之间产生了耐寒力强弱的分化，如不同乌龙茶品种耐受的临界低温为-9℃～-12℃，而绿茶品种的半致死温度(lt50)为6.84℃～-11.52℃。选育耐寒茶树品种是减少冬季低温胁迫冻害、实现高产稳产的重要因素。耐寒力鉴定是选育耐寒品种重要手段，现有的茶树耐寒力鉴定的方法有：①“田间自然鉴定法”，即在茶树越冬期间，尤其是在低温冻害发生后进行田间调查，根据茶树叶片受冻害的比例评价茶树耐旱力；②“电导率测定法”，即在越冬期间取茶树成熟新梢上芽下第2～3叶，进行不同温度的冷冻处理，并以被煮沸后茶叶的电导率为参照，计算出相对电导率w％＝(冷冻电导率/煮沸电导率)×100，把相对电导率为50％时的温度定为被测品种能耐受的临界低温；③“扦插苗低温受冻率鉴定”，即将茶树扦插苗放到不同温度的冰箱冷冻3小时，然后切断电源让其自然冷却至室温，以后每隔2～3天观察一次茶树叶片受冻情况，直至冻害症状稳定为止(一般为连续观察10天左右)，以30％的叶片出现冻害症状作为该品种能耐受的临界低温；④“叶片解剖结构评价法”，即取不同品种的成熟叶片进行显微切片观察测定，计算出叶片栅栏组织与海绵组织厚度比(栅/海比)，该比例越大，耐寒力越强。这些茶树耐寒力鉴定方法都存在不足，如“田间自然鉴定法”完全受制于冬季温度，在气温较高的冬季则不能开展鉴定。而“电导率测定法”和“扦插苗低温受冻率鉴定”则需要设定不同低温的冰箱进行系列温度处理，处理后还需要较长时间的繁杂观测才能得到实验数据。“叶片解剖结构评价法”是一种简介评价法，栅/海比高低不能直接评价品种耐受的临界低温。开发快速、准确和直观鉴定茶树品种耐寒力的方法是茶树育种迫切需求。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种茶树耐寒力鉴定新方法，本发明利用冷冻茶树新梢，然后比较冷冻前后茶树叶片色差值变化，鉴定茶树耐寒力。为了解决上述技术问题，本发明提供一种茶树品种耐寒力的鉴定方法，包括以下步骤：1)、剪取耐寒力待鉴定的茶树树冠上的新梢10～16枝并均分成2组(每组5～8枝)，其中一组为测试组，另一组为对照组；所述剪取的新梢的数量为偶数；新梢指茶树上具有≥5张叶片(成熟叶片)的枝条；注：茶树是指成龄茶树，即为树龄≥4年、可以采收茶叶的茶树；新梢是满足以下条件的树梢：在6月-12月剪取枝条时，“新梢”指茶树上当年生且具有5张以上成熟叶片的枝条；在1-5月剪取枝条时，“新梢”指前一年生长的、具有5张以上成熟叶片成熟枝条；剪取的新梢具有5-8张成熟叶片、且长度不超过30cm或者叶片数量不超过8叶；一般在采摘后的1-2小时内进行如下的后续步骤，即，测试组茶树新梢进行步骤2)的冷冻处理，对照组茶树新梢进行步骤3)所述的处理；2)、将测试组茶树新梢先于(-15±1)℃冷冻处理1～2小时；3)、将对照组茶树新梢以及步骤2)所得的冷冻后测试组茶树新梢分别进行如下处理：将茶树新梢的基部按照4～6cm的插入深度插入水中并于室温(20℃～25℃)下放置(2±0.2)小时后，取新梢尾部顶芽下第2叶～第4叶，测定色差值a，分别获得测试组叶片色差值a平均值(a测试)、对照组叶片色差值a平均值(a对照)；注：剪取茶树新梢时形成断口端称为茶树新梢的基部，茶树新梢的另一端则称为尾部；新梢尾部顶芽下第2叶～第4叶，是指从新梢尾部起计数的第2叶～第4叶；4)、计算抗冻指数x：抗冻指数xa＝a测试/a对照；5)、计算冻害指数：以抗冻指数xa为自变量(xa)代入线性回归方程y＝50.789-47.875xa；y为待鉴定茶树品种的冻害指数；6)、判定：冻害指数越低，品种的耐寒力越强；或者，选择至少2个茶树品种作为待测品，将待测品的茶树新梢按照上述步骤1)～步骤5)进行，y值最低的待测品种为所述待测品中耐寒力最强的茶树品种。作为本发明的茶树品种耐寒力的鉴定方法的改进：所述步骤2)中，冷冻处理温度为-15℃，时间为2小时。作为本发明的茶树品种耐寒力的鉴定方法的进一步改进：所述步骤3)中，将茶树新梢的基部按照5～6cm的插入深度插入水；取新梢尾部顶芽下第3叶，测定色差值a。本发明的发明过程如下：作为本发明茶树品种耐寒力评价的参照，提供了2018年2月底对供试茶树品种“田间自然鉴定法”的鉴定结果(2018年1月29日田间最低温度为-5℃)，构建了茶树品种冻害指数预测模型。一、本发明的预测模型构建，依次按照以下步骤进行：1.不同茶树品种田间抗冻指数测定：供试品种的种植地块2018年1月29日出现最低温度-5℃，本调查于2018年2月26-27日进行，每个品种随机调查15株茶树，分别统计植株上受冻叶片数和健康叶片数，根据结果计算冻害指数h％＝[∑(ni×xi)/n/4]×100，其中n为每个品种调查植株数，即15株；ni为各级受冻株数；为各株受冻级数(0级：受冻叶片占总叶片数<5％；1级：5％<受冻叶片占总叶片数<15％；2级：15％<受冻叶片占总叶片数<25％；3级：25％<受冻叶片占总叶片数<50％；4级：受冻叶片占总叶片数>50％)；4是指冻害分级(0-4级)的最高级别数。供调查47个品种，其中45个品种冻害指数h用于构建线性预测模型(表1)，2个品种用于模型的验证(表2)。受冻级数的判定，按照《田间自然鉴定法》进行判定(罗意，董丽娟，段继华，李赛君.福鼎大白茶等20个茶树品种实生苗抗寒性鉴定与评价.茶叶通讯，2013,40(2)：3-5)。表1.对不同茶树品种测定的抗冻指数和冻害指数1：冻害指数h％＝[∑(ni×xi)/n/4]×100，其中n为每个品种调查植株数，即15株；ni为各级受冻株数；为各株受冻级数(0级：受冻叶片占总叶片数<5％；1级：5％<受冻叶片占总叶片数<15％；2级：15％<受冻叶片占总叶片数<25％；3级：25％<受冻叶片占总叶片数<50％；4级：受冻叶片占总叶片数>50％)。2：抗冻指数xl＝6个新梢冷冻处理后叶片色差l值平均数/6个新梢冷冻处理前叶片色差l值平均数。3：抗冻指数xa＝6个新梢冷冻处理后叶片色差a值平均数/6个新梢冷冻处理前叶片色差a值平均数。4：抗冻指数xb＝6个新梢冷冻处理后叶片色差b值平均数/6个新梢冷冻处理前叶片色差b值平均数。表2.茶树品种‘2-49’和‘5-28’冻害指数和抗冻指数**：指数计算方法同表1.2.冷冻处理条件比较研究：取‘浙农113’、‘籔北种’和‘迎霜’3个茶树品种成龄茶树上述一芽六叶以上成熟新梢，每个品种24枝，分成6枝一组。其中一组作为对照，将其基部5-6cm插在清水中，室温(20-25℃)条件下放置；另外3组分别放到温度控制在-5℃、-15℃和-25℃冰箱冷冻处理2小时后，取出将新梢基部5-6cm插在清水中，室温条件下放置4小时，期间分别于第1、2和4小时用色差计测定顶芽下第三叶色差值(l、a、b)。结果发现，在4小时的观察期内，经过-5℃处理的茶叶基本保持绿色，与未经冷冻处理茶叶没有显著差异；而在-25℃下处理的茶叶全部呈现为猪肝色，品种间色差也没有明显差异；只有在-15℃处理的茶叶，在放置1-2小时期间品种间色差存在较明显区别(图1)，而放置4小时后所有品种的叶色都呈现暗红色，色差值也很接近。根据本实验结果，认定最佳处理条件是-15℃冷冻处理2小时，然后将基部插在水里在室温条件下(20-25℃)条件下放置2小时，测定色差值。成龄茶树是指树龄≥4年、可以采收茶叶的茶树；新梢是满足以下条件的树梢：在6月-12月剪取枝条时，“新梢”指茶树上当年生且具有5张以上成熟叶片的枝条；在1-5月剪取枝条时，“新梢”指前一年生长的、具有5张以上成熟叶片成熟枝条；剪取的新梢具有5-8张成熟叶片、且长度不超过30cm或者叶片数量不超过8叶。注：色差参数a值的大小与茶叶的绿色和红色程度有关，a为负值时，呈现绿色，而且负数越大(绝对值越小)，绿色越深；当a值为正数时，茶叶呈现红色，a值得绝对值越大，颜色越红。冷冻后，则因耐寒力不同，叶片颜色出现差异，耐寒力强的品种茶叶颜色变化较小(绿色略有降低，红色程度略有提升)；抗冻指数xa用于预测冻害指数h。3.抗冻指数测定：取表1～2中的茶树品种具有5张叶片以上的成熟新梢，每个品种12枝，分成2组，每组6枝，其中一组为对照组，另一组为测试组。对照组新梢基部5-6cm插在清水中，室温条件下放置；测试组按照上述步骤2冷冻处理条件比较研究的方法将测试组新梢在-15℃冰箱冷冻处理2小时，取出将基部插在清水中温室放置2小时，然后测定对照组和测试组叶片色差值(l、a、b)。按照以下公式计算抗冻指数：抗冻指数xl＝冷冻叶片色差l值平均数/未冷冻叶片色差l值平均数；抗冻指数xa＝冷冻叶片色差a值平均数/未冷冻叶片色差a值平均数；抗冻指数xb＝冷冻叶片色差b值平均数/未冷冻叶片色差b值平均数。测定结果见表1和表2。4.茶树品种冻害指数预测模型构建：首先计算表1中冻害指数h分别于抗冻指数xl、抗冻指数xa和抗冻指数xb之间的线性相关系数，结果如表3。冻害指数h与抗冻指数xa之间存在极显著负相关关系，而冻害指数h与抗冻指数xl和抗冻指数xb之间无显著相关性。以抗冻指数xa为自变量(xa)、田间调查获得的冻害指数h为因变量(y)建立线性回归方程得：y＝50.789-47.875xa(p<0.001)，该模型可以用于预测或者鉴定茶树品种的耐寒力。表3.冻害指数h与抗冻指数之间线性相关性系数参数冻害指数h抗冻指数xl-0.025抗冻指数xa-0.807*抗冻指数xb-0.203*:p<0.01.二、茶树品种耐寒力鉴定方法，依次按照以下步骤进行：1.从待测茶树品种树上剪取具有5张以上叶片的成熟新梢12枝，分成2组，每组6枝，一组为对照组，一组为测试组；将对照组新梢基部5-6cm插在盛有清水的烧杯或者水盘，在室温条件放置；将测试组新梢放入温度设定为-15℃的冷冻箱内冷冻2小时，取出将新梢基部5-6cm插在盛有清水的烧杯或者水盘，在室温条件放置2小时。2.用色差计测定测试组和对照组新梢顶芽下方第三张叶片的色差值a，分别计算出对照组和测试组叶片色差值a的平均数a对照和a测试，根据以下公式计算抗冻指数xa：抗冻指数xa＝a测试/a对照。3.以待测品种抗冻指数xa为自变量(xa)，代入上述冻害指数模型y＝50.789-47.875xa，这样计算出来的y值就是待测品种的冻害指数h预测值。该冻害指数h预测值越小，品种的冻害程度越轻，耐寒力越强；该指数越大，品种的冻害程度越重，耐寒力越差。如果测试中设有对照品种，通过比较待测品种与对照品种y值的大小，就可以知道待测品种的耐寒力是强于或者弱于对照品种。综上所述，本发明开发了一种茶树耐寒力鉴定新方法，即利用冰箱冷冻茶树新梢，然后比较冷冻前后茶树叶片色差值变化，鉴定茶树耐寒力。具有检测结果正确、快速、方便的技术优势。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1为不同品种叶片色差值a随时间变化的对比。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1、一种茶树品种耐寒力的鉴定方法：1.从茶树品种‘2-49’和‘5-28’的6年生成龄茶树分别剪取具有5张以上成熟叶片的新梢12枝，分成2组，每组6枝，一组为对照组，一组为测试组；将对照组新梢基部5-6cm插在盛有清水的烧杯或者水盘，在室温条件(20℃～25℃)放置2小时；将测试组新梢放入温度设定为-15℃的冷冻箱内冷冻2小时，然后取出将新梢基部5-6cm插在盛有清水的烧杯或者水盘(即，新梢插入水中的深度为5-6cm)，在室温条件放置2小时。2.用色差计测定测试组和对照组新梢尾部顶芽下第三张叶片的色差值a，分别计算出对照组和测试组叶片色差值的平均数a测试和a对照，根据公式：抗冻指数xa＝测试组叶片平均色差值a测试/对照叶组叶片平均色差值a对照。计算结果如表2所示，茶树品种‘2-49’的抗冻指数xa＝0.549，品种‘5-28’的抗冻指数xa＝0.723。3.以茶树品种‘2-49’的抗冻指数xa＝0.549和‘5-28’的抗冻指数xa＝0.723为自变量xa，代入冻害指数公式y＝50.789-47.875xa，得到品种‘2-49’的冻害指数为24.51，品种‘5-28’的冻害指数为16.18。田间调查的实测冻害株数：‘品种2-49’为25.00，品种‘5-28’为18.33(表2)。本发明的鉴定值与田间实际测定值非常接近，而且也呈现品种‘2-49’的冻害程度高于品种‘5-28’的同样趋势，说明品种‘5-28’的耐寒力强于品种‘2-49’。实施例2、一种茶树品种耐寒力的鉴定方法：在茶树品种选育过程中，一般是将若干待鉴定品种与参照品种种植在同一肥力水平的地块上，然后在越冬低温冻害期过后进行田间受冻情况调查，比较待鉴定品种与参照品种之间的受害情况，或者对参试品种耐寒力强弱进行排序，从而获得待鉴定品种的耐寒力信息，供今后品种推广或者引种时参考。然而，如果在试验期间没有低温冻害气候出现，耐寒力鉴定就无法进行。在这种情况下，可以应用本发明技术进行鉴定。本实施例选择了经过鉴定比较明确了半致死温度的‘福鼎大白茶’(半致死温度lt50＝-4.50℃)、‘乌牛早’(lt50＝-4.08℃)和‘數北种’(lt50＝-2.01℃)等3个品种为材料[黄海涛,余继忠,张伟,周铁锋,敖存.抗寒茶树品种的筛选研究.中国农学通报,2012,28(25):219-223.]这3个品种作为样品。每个品种剪取12个成熟新梢，其余等同于实施例1。所得结果如表4所述，即，耐寒力强弱排序为：“福鼎大白茶”(预测的冻害指数h＝25.04)>‘乌牛早’(预测的冻害指数h＝33.25)>‘籔北种’(预测的冻害指数h＝35.58)，与已经发表的半致死温度lt50排序完全一致。表4.实施例2中3个茶树品种耐寒力鉴定结果对比例1-1、将实施例2中的“-15℃冷冻2小时”改成“-5℃冷冻2小时”，其余等同于实施例2。对比例1-2、将实施例2中的“-15℃冷冻2小时”改成“-20℃冷冻2小时”，其余等同于实施例2。对比例2-1、将实施例2中的“取出将新梢基部5-6cm插在盛有清水的烧杯或者水盘，在室温条件放置的时间”由2小时改成1小时；其余等同于实施例2。对比例2-2、将实施例2中的“取出将新梢基部5-6cm插在盛有清水的烧杯或者水盘，在室温条件放置的时间”由2小时改成3小时；其余等同于实施例2。对比例3-1、将实施例2中的“新梢插入水中的深度为5-6cm”改成“新梢插入水中的深度为2-3cm”；其余等同于实施例2。对比例3-2、将实施例2中的“新梢插入水中的深度为5-6cm”改成“将整个新梢插入水中”；其余等同于实施例2。上述对比例最终所得的冻害指数y与实施例2的对比，如下表2所述。表2、不同处理预测的冻害指数y福鼎大白茶乌牛早籔北种实施例225.0433.2535.58对比例1-15.704.847.71对比例1-242.1942.3843.42对比例2-112.8513.5913.45对比例2-232.7135.4734.55对比例3-124.6133.3133.81对比例3-238.2440.2240.29上述对比例存在着判定结果不正确或者无法进行有效判定的缺陷。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页12