丹参素作为公猪精液常温抗菌保存液中有效成分的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及公猪精液常温保存稀释液，具体涉及丹参素作为公猪精液常温保存稀释液成分的应用。

背景技术：

随着猪人工授精技术在集约化养猪场中的推广与应用，精液的保存技术越来越受到重视，并日益显示出其在降低公猪饲养量和饲养成本、加快猪群品种改良、减少疾病传播等多方面的优势。与冷冻精液相比，常温液态保存精液人工授精后具有母猪繁殖性能高(受胎率、分娩率和窝产仔数高)、所需费用低、操作程序简单等优点；从精液的保存效果考虑，常温液态保存的精液更有利于猪的繁殖，能够产生更大的经济效益。因此，目前的生产实践中猪的人工授精主要采用常温保存的精液。

猪精液常温保存是指将稀释后的精液保存在15～25℃的条件下保存的技术，又称为室温保存。常温保存主要是采用弱酸环境抑制精子活动和代谢，减少能量的消耗，再恢复ph等环境条件又使精子复苏的原理来达到保存精液的目的。在猪精液常温保存过程中会受到温度、渗透压、ph、稀释倍数、氧化损伤、缓冲剂、渗透压、细菌等多种因素的影响。稀释液不仅能为精子提供代谢所需的能量，调整ph和渗透压，还可以抑制精液中微生物的繁殖，起到保护精子的作用。因此，稀释液是影响猪精液常温保存效果的关键因素。

随着社会的发展，抗生素将逐步被严加管制到禁用，以控制抗生素滥用所造成的危害。抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物。20世纪90年代以后，科学家们将抗生素的范围扩大，统称为生物药物素，主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，一般情况下对其宿主不会产生严重的副作用。但是，由于对抗生素认识不足，导致人类使用抗生素于牲畜养殖过程中随意添加，从而造成牲畜体内抗生素含量超标，并最后经人类食用导致人体内抗生素超标。为了食品类的生产安全，需要在家畜生产阶段的各个细节注意抗生素使用。因此，在精液保存过程中使用可替代抗生素的纯天然物质成为人类为之奋斗的目标。

技术实现要素：

丹参素(dss)化学名称为3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸，是中药唇形科植物丹参的活性水溶性成分。本发明基于研究发现，提供丹参素作为公猪精液常温抗菌保存液中有效成分的应用。尤其是丹参素作为公猪精液常温抗菌保存液中抗菌和抗氧化有效成分的应用。

本发明以丹参素作为公猪精液的常温保存液的组分，常温保存后公猪精子活率、质膜和顶体完整率、线粒体膜电位、t-aoc水平、sod和cat活性、mda含量、atp含量、gapdh活性、稀释液渗透压及抗菌性等指标优良，尤其是同时发挥抗氧化和抗菌作用，提高了公猪精液的常温保存质量。

尤其是，本发明提供丹参素作为公猪精液常温抗菌保存液中唯一抗菌和抗氧化有效成分的应用，无需添加其他抗氧化剂和抗菌剂。

本发明同时还提供了包含丹参素的公猪精液的常温抗菌保存液。

本发明的公猪精液的常温抗菌保存液由以下组分制备而成：每1l所述公猪精液的常温稀释液的配方为：tris5.65g，柠檬酸2.9g，d-葡萄糖27.5g，氯化钾0.75g，edta2.35g，碳酸氢钠1.0g，柠檬酸三钠6.9g，丹参素25μm，其余为超纯水。

本发明的公猪精液的常温保存稀释液配方，在稀释液中添加适量的丹参素能够显著提高公猪精子活率、质膜和顶体完整率、atp含量、线粒体膜电位、gapdh活性以及溶液抗菌性。

附图说明

图1为不同浓度丹参素对公猪精液中t-aoc活性(a)和mda含量(b)的影响；

图2为不同浓度丹参素对公猪精液中sod(a)和cat(b)活性的影响；

图3为不同浓度丹参素对公猪精子atp含量(a)、线粒体膜电位(b)和gapdh活性(c)的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行进一步的详细说明。

实施例：

按照本发明的技术方案，本实施例给出七组用于公猪精液常温保存的使用丹参素的稀释液配方，基础液中添加丹参素的浓度分别为0μm、1μm、5μm、10μm、25μm、50μm、100μm，如表1所示。每1l稀释液中其他成分根据表2进行称取。

表1丹参素添加浓度方案

表2基础稀释液配方

上述实施例中公猪精液的常温保存稀释液用于公猪精液的常温保存的方法，按下列步骤实施：

1.基础稀释液的配制：按中效型稀释粉配方成分准确称量d-葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、氯化钾、edta、tris于灭菌烧杯中，取1l双蒸水对药品进行溶解，并放置在37℃水浴锅中以促进其溶解。待完全溶解后，用0.22μm滤菌膜过滤于无菌玻璃瓶中，现配现用或用封口膜密封，4℃保存备用。

2.丹参素储存液的配制：称取20mg丹参素，用10ml双蒸水充分溶解，配制成2mg/ml的储存液，分装，-20℃保存备用。

3.手握法采集公猪精液(每次固定采精时间为早上8：00～9：00)，将射精中段富含精子的部分收集于垫有三层滤纸的保温杯中，30min内送回实验室检测，所采原精要求气味和颜色正常，镜检精子活率大于80％，密度为2～4亿个/ml才能用于后续试验。按照精液比稀释液为1：4的比例，用基础稀释液对原精进行稀释。首先在原精中缓慢倒入稀释液，1：1稀释原精，平衡0.5min后，再将剩下的稀释液缓慢倒入精液中达到所需的比例，使其混合均匀。保持原精与稀释液的温差不超过1℃。

4.将稀释好的精液分装到已灭菌的10ml离心管中，小心平放在铺有毛巾的工作台上，包裹后放置在17℃恒温箱里，保存时注意避光，为防止精子因沉淀而死亡可以每隔12h按要求将精液样品轻轻翻动一次。

5.测定常温保存精子活率、顶体完整率、质膜完整率、t-aoc活性、mda含量、sod和cat活性、atp含量、线粒体膜电位、gapdh活性、抗菌性以及溶液渗透压变化。测定方法如下所示：

(1)使用公猪精液检测系统casa(hview-ssav8.0)检测精子活率。从恒温箱中取出精液样品，轻轻倾斜摇匀之后取100μl于灭菌的1.5ml离心管中，放置在浮板上在37℃恒温水浴锅内孵育5min，并预热好放置在37℃恒温加热板上的专用载玻片和盖玻片。孵育结束后在载玻片上滴10μl精液，盖上盖玻片，静置片刻后利用计算机辅助精液分析系统(casa)检测精子活率。每次随机选择3个视野进行测定，结果取平均值。

(2)利用sybr-14/pi、fitc-pna荧光染料对精子质膜完整率、顶体完整率进行检测。

(3)通过t-aoc检测试剂盒和mda含量检测试剂盒(微量法)对保存第3d和7d的精液样品进行测定，并严格按照试剂盒说明书进行操作和计算。

(4)利用sod活性检测试剂盒和cat活性检测试剂盒(微量法)对保存第3d和7d的精液样品进行测定，并严格按照试剂盒说明书进行操作和计算。

(5)利用atp含量检测试剂盒(紫外分光光度法)、线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1法)和gapdh活性检测试剂盒(分光光度法)对精液样品进行测定，并严格按照试剂盒说明书进行操作和计算。

(6)在添加不同浓度丹参素的lb液体培养基中检测细菌od值。从4℃恒温冰箱中取出备用菌悬液，在室温下放置20min。将高温灭菌好的lb液体培养基及相关试验用品放入超净工作台内紫外处理20min。在超净工作台内移取10ml液体培养基于灭菌的10ml离心管内，再滴加10μl菌液，混匀。分别添加不同浓度丹参素溶液于液体培养基中，再设置0.25g/l庆大霉素组作阴性对照共8组。每个菌种设置3个重复。将样品放置于17℃恒温冰箱中保存，第7天取出用紫外可见光分光光度计检测每个样品的od值。od值越大，表明样品中细菌浓度越高。

(7)精液稀释液渗透压的测定。每24h测定一次渗透压，使用osmopro3250全自动冰点渗透压仪进行测定。渗透压仪开机后，静置10min后开始检测样品。用移液器添加精液稀释液100μl至1.5ml的样品管中，然后样品管放在检测位置。无论校准还是测量，必须用同量的样品进行检测才能得出准确的结果。

6.测定结果

测定结果如表3、4、5和图1、2、3所示。

表3丹参素对常温保存公猪精子质量的影响

表4基础液中不同浓度丹参素对细菌的作用效果(mm)

表5基础液中添加丹参素对渗透压的影响(％)

根据以上操作步骤，测定公猪精子活率、顶体完整率、质膜完整率、t-aoc活性、mda含量、sod和cat活性、atp含量、线粒体膜电位、gapdh活性、抗菌性以及溶液渗透压变化。

如表3所示，在猪精液常温保存稀释液中添加25μm丹参素能达到最佳的保存效果，显著提高精子活率、质膜完整率和顶体完整率(p<0.05)。

如表4所示，在猪精液常温保存稀释液中添加25μm丹参素能达到最佳的抗菌效果，显著提高精子抗菌性(p<0.05)，与抗生素庆大霉素做对比无显著差异，可替代抗生素进行使用。

如表5所示，在猪精液常温保存稀释液中添加5、10、25、50、100μm丹参素均对稀释液渗透压无显著影响(p<0.05)，可以维持溶液基础渗透压平衡，更有利于精液长时间保存。

如图1所示，添加丹参素能显著提高公猪精子t-aoc水平，且显著降低mda含量(p<0.05)。

如图2所示，添加丹参素能显著提高公猪精子sod、cat活性(p<0.05)。

如图3所示，添加丹参素能显著提高公猪精子atp含量、线粒体膜电位和gapdh活性(p<0.05)。

上述实施例结果表明稀释液可使精液有效保存时间(符合国家标准)延长至9d，精子活率达到61.83％。高浓度的丹参素(25、50、100μm)能够显著提高精液总抗氧化能力和抗氧化酶活性，降低丙二醛含量，从而减缓精液常温保存过程中ros对精子产生的有害作用，同时具有显著的抗菌效果。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。