一种抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型的构建与评价方法与流程

本发明属于实验动物模型的构建及评价方法技术领域，具体涉及一种抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型的构建与评价方法。

背景技术：

抑郁症又称抑郁障碍，是一种常见的精神疾病，它以显著而持久的心境低落、思维迟缓、认知功能损害、意志活动减退为主，除了会出现“三低症状”还会产生一系列其他疾病，如胃肠疾病、焦虑症等。临床发现抑郁患者常出现消化系统不适症状，而消化系统障碍通常与情感障碍有关，胃肠疾病发病率较高，常伴随一些不良情绪，其中抑郁、焦虑居多，抑郁症和胃肠疾病有着共同的病理生理学机制，胃肠功能紊乱被作为抑郁症的躯体症状，成了抑郁症的共病表现。可能原因是其支配的复杂神经系统如中枢神经、肠神经和自主神经中任何一个系统出现异常都将导致胃肠功能失调而产生疾病。

脑肠轴为大脑与肠道通过自主神经系统和下丘脑-垂体-肾上腺轴神经内分泌系统相互关联网络，通过脑与肠道的相互影响对情绪进行调节。基于脑-肠轴，通过对肠神经系统与中枢神经系统相结合研究，中枢神经系统直接调控胃肠运动分泌功能，5-ht转运体可影响5-ht的代谢过程，而5-ht转运体功能下降使得5-ht不能及时灭活，从而造成胃肠道损伤引发胃肠疾病，5-ht可以调节中枢神经系统和肠神经系统，因此也包括胃肠和情绪问题，而且胃肠疾病伴发的情绪问题则是抑郁症的主要症状。

由于抑郁症伴发胃肠功能疾病的现象非常普遍，临床诊断过程中，患者经常被单方面诊断为抑郁症或者胃肠疾病，造成了患者治疗延迟、无效、甚至出现误诊等现象，严重影响了抑郁患者的治疗。临床治疗抑郁症时，常发现患者有胃肠动力紊乱现象，因而将抑郁与胃肠疾病合而为病，且两者关系密切，甚至可互为因果，而将胃肠疾病作为抑郁症躯体症状的主要表现，有利于构建适合临床病理特征的实验动物模型并进行合理的模型评价，有利于说明疾病发病机制及药理作用机理。现代研究多使用药物构建动物模型，以此来模拟与临床近似的病理特征，目前尚存在以下一些问题。

在模型构建方面，目前并没有抑郁伴胃肠动力障碍模型，因此只能通过构建cums模型复合胃肠动力障碍模型来模拟临床抑郁患者的病理生理特征。在模型评价方面，目前用于研究的实验动物模型构建成功与否，判断的主要依据是抑郁模型的行为学特征和胃肠疾病的检测指标胃残留率和小肠推进率，目前尚无相关共病模型的评价指标体系。抑郁的影响因素较多，只是部分地反应了抑郁相关的一些情绪变化，现有的模型评价仅使用旷场试验和糖水偏爱率及强迫游泳不动时间作为模型评价的标准具有一定的局限性；仅用胃排空率和肠推进率，作为评价胃肠动力的指标,存在不全面性；胃肠动力指标胃残留率和小肠推进率准确的描述了胃肠疾病的变化情况，但是这些方法存在实验操作误差，缺乏一定的精准性，因此在抑郁的基础上构建胃肠动力障碍模型来反映临床抑郁患者伴有的胃肠疾病并建立完善的评价体系具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有药物治疗抑郁症时常伴有胃肠疾病的问题本发明提供了一种抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型的构建与评价方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型的构建方法：

采用雄性sd大鼠作为实验对象，制备cums模型，在制备cums模型的基础上制备胃肠动力障碍模型，即得抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型。cums模型表现为抑郁与其伴发的胃肠疾病共病，可作为抑郁伴胃肠动力障碍共病实验动物模型,用于抑郁伴发胃肠疾病共病生物学机制研究。

所述制备cums模型，在制备cums模型的基础上制备胃肠动力障碍模型，具体方法为：采用9种应激程序，每天随机给予1种不同的应激方式，共持续3周，从第17d开始在制备cums的基础上进行腹腔注射l-精氨酸，制备胃肠动力障碍模型。更好的模拟了临床抑郁患者的躯体症状。

所述从第17d开始在制备cums的基础上进行腹腔注射l-精氨酸具体操作为：第17d注射l-精氨酸5.2g/kg，第18d-21d每天注射l-精氨酸2.6g/kg。该方法更好的模拟了临床抑郁患者伴有的胃肠动力不足现象。

所述9种应激程序包括：禁水24h、禁食24h、昼夜颠倒24h、束缚3h、36v足底电击2min、4℃冰水游泳5min、45℃热刺激10min、夹尾2min和60w超声波刺激3h。利用经受不同应激程序的抑郁动物来模拟临床抑郁患者，该方法能成功复制抑郁患者伴有的胃肠疾病的现象,为后期研究两者合病的治疗提供基础。

一种抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型构建的评价方法：包括以下步骤：

(1)对实验动物模型构建期间每周进行行为学测试，并记录数据，通过行为学测试评价cums模型是否构建成功；

(2)进行取材检测前30min灌胃营养半固体糊，进行胃残留率和小肠推进率的测试，并记录数据，通过胃残留率和小肠推进率测试以及血清中胃动素和胃泌素的检测评价胃肠动力障碍模型是否构建成功；

(3)对行为学测试、胃残留率和小肠推进率测试以及血清中胃动素和胃泌素的检测的数据进行统计学分析，判断抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型构建是否成功。

所述行为学测试包括：糖水偏爱率、旷场测试和强迫游泳测试。

所述旷场测试包括：穿越格数、直立次数和中央格停留时间。

所述评价cums模型是否构建成功的依据是：造模后sd大鼠行为特征均发生改变，大鼠糖水偏爱率下降，穿越格数和直立次数均减少，中央格停留时间和强迫游泳不动时间均增多。通过抑郁行为的差异，来确定模型是否成功，能否更好的模拟临床患者。

所述评价胃肠动力障碍模型是否构建成功的依据是：造模后抑郁大鼠的胃肠动力不足，导致胃残留率增大以及小肠推进率减少，胃动素以及胃泌素的含量均减少。

所述判断抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型构建是否成功的依据是：实验动物模型行为学的变化：穿越格数减少，糖水偏爱率减低，强迫游泳不动时间增加，胃残留率增加，肠推进率减少，胃动素含量减少，胃泌素含量下降。通过以上数据证明了该方法成功地建立了共病模型，为抑郁患者伴发胃肠疾病的治疗提供了研究基础。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

在抑郁大鼠上进行共病模型构建，更能反映临床抑郁症患者时常伴胃肠疾病的病理生理实质。采用经典的cums抑郁症模型，在此基础上构建胃肠动力障碍共病模型。采用spss软件中的t-检验对所得数据进行统计学分析，发现造模后大鼠行为学有所改变，且胃肠动力指标也有所变化，通过共病模型更加能够反映临床抑郁症患者的生理病理表现。

与以往的实验动物模型相比，本发明所建立的方法更加全面、系统、综合地体现造模前后机体的变化，体现了共病模型的合理性和科学性，可以为药理研究提供一种可靠的可用于抑郁症伴胃肠动力障碍共病实验动物模型的构建与评价方法。

附图说明

图1是造模对大鼠糖水偏爱率的影响图；

图2是造模对大鼠在旷场实验中穿越格数的影响图；

图3是造模对大鼠在旷场实验中直立次数的影响图；

图4是造模对大鼠在旷场实验中中央格停留时间的影响图；

图5是强迫游泳实验中不动时间的影响图；

图6是造模对大鼠体重变化的影响曲线图。

附图符号说明：

k—空白组，m—模型组。

具体实施方式

一种抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型的构建方法：

采用雄性sd大鼠作为实验对象，实验动物在温度20-25℃、湿度55±22％环境中饲养，自然昼夜节律。将其随机分为空白组和模型组，每组10只。

制备cums模型，模型组采用cums造模，随机给予9种不同应激方式，禁水24h、禁食24h、昼夜颠倒24h、束缚3h、36v足底电击2min、4℃冰水游泳5min、45℃热刺激10min，夹尾2min，60w超声波刺激3h，每天随机给予1种刺激，连续21天。空白组大鼠正常群养，实验结束后，用行为学指标检测抑郁症大鼠模型是否成功建立。

行为学测试包括：糖水偏爱率、旷场测试包括和强迫游泳测试。

旷场测试包括：穿越格数、直立次数和中央格停留时间。

在制备cums模型的基础上制备胃肠动力障碍模型，第17天开始，cums组应激结束后给予大鼠腹腔注射l-精氨酸5.2g/kg(将适量盐酸精氨酸粉末溶于生理盐水配成20％盐酸精氨酸溶液，搅拌混匀后调节ph值至7.3)。第18-21天，cums不同的应激程序结束后，给予大鼠腹腔注射l-精氨酸2.6g/kg。

第22天开始进行行为学指标测试(糖水偏爱率)，如图1所示。

第23天进行旷场测试，如图2(穿越格数)、图3(直立次数)和图4(中央格停留时间)所示。

第24天进行强迫游泳测试，禁食12h(不禁水)，如图5所示。

第25天，进行取材检测前30min给予营养半固体糊，之后取材进行检测。

检测指标：胃残留率、小肠推进率、胃动素和胃泌素，如表1、2、3、4所示。即得抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型。

一种抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型构建的评价方法：包括以下步骤：

(1)对实验动物模型构建期间每周进行行为学测试，并记录数据：

体重基线测定：适应期第7天记录每只大鼠的体质重量(g)，随后，每周称重一次，如图6，造模对大鼠体重变化的影响曲线图。从图中可看出造模对大鼠体重的影响显著，造模第7天与空白组相比，模型大鼠的体重增量减少，造模可能影响了大鼠的食欲导致体重增长缓慢。造模第14天与空白组相比，模型组存在差异。造模第21天与空白组相比，模型组存在极显著差异(p<0.01)。综上所述可推测，模型组体重增长缓慢，可能与大鼠对食物不易消化或影响消化有关。

糖水偏爱实验(sucrosepreferencetest)的基线测定：适应期第5天下午8:00孤养每只大鼠并给予一瓶自来水，一瓶现配的1％质量体积分数的蔗糖水进行糖水甜度偏好的训练，自来水瓶和蔗糖水瓶位置固定，目的在于辅助大鼠正确识别糖水和自来水，12h糖水训练后即适应期第6天上午8:00撤掉水瓶进行禁水12h，适应期第7天上午8:00-9:00进行3h的糖水偏爱基线测定。糖水偏爱率＝1％质量体积分数的蔗糖水消耗量(ml)/总饮水消耗量(ml)×100％。如图1，造模对大鼠糖水偏爱率的影响，通过图1可看出造模前各组大鼠糖水偏爱率基线值无显著性差异，排除了因大鼠个体对甜度感应的差异带来的影响。造模21天后各组大鼠的糖水偏爱率，相比空白组，模型组具有显著性差异(p<0.05)。表明造模应激造成的大鼠对甜度快感缺失的现象。

旷场实验(openfieldtest)的基线测定：适应期第7天下午利用自制大鼠旷场实验箱，将大鼠平托置于旷场实验箱中央格，开始计时5min，记录后4min中大鼠的中央格停留时间：从放入大鼠置中央格到逃离中央格所需时间(s)，穿越格数：后4min中大鼠跨越格子的数量，直立次数：后4min中大鼠两爪抬起远离地面的次数。

见图2，造模对大鼠在旷场实验中穿越格数的影响图，旷场实验中的穿越格数可以一定程度上反映大鼠的活动能力。由图2可知造模前各组大鼠旷场实验中穿越格数基线值无显著性差异，排除了大鼠个体活动能力差异的影响。通过21天造模对各组大鼠在旷场实验中穿越格数的影响可知，相对空白组，造模应激使得各组大鼠穿越格数显著减少即活动能力降低。

见图3，造模对大鼠在旷场实验中直立次数的影响图，旷场实验中的直立次数可以一定程度上反映大鼠的活动能力及对新鲜环境的好奇程度。图3可看出造模前各组大鼠旷场实验中直立次数基线值，无显著性差异，排除了大鼠个体差异的影响。通过21天造模对各组大鼠在旷场实验中直立次数的影响可知，相比空白组，造模应激使得各组大鼠直立次数显著减少,具有极显著性差异(p<0.01)，表明造模应激导致大鼠活动能力和对新鲜环境的好奇程度降低的现象。

见图4，造模对大鼠在旷场实验中中央格停留时间的影响图，旷场实验中的中央格停留时间可以一定程度上反映大鼠对陌生环境的好奇程度。图4可看出造模前各组大鼠旷场实验中中央格停留时间基线值，无显著性差异，排除了大鼠个体差异的影响。经过21天造模对大鼠在旷场实验中中央格停留时间的影响可知，模型组相比空白组的中央格停留时间都显著延长(p<0.01)。

强迫游泳实验(forcedswimmingtest)：造模结束后，每只大鼠单独置于一个装有清洁水的透明圆柱形有机玻璃缸内，记录6min内大鼠的游泳行为状况，分析后4min内大鼠强迫游泳的不动时间(仅头部露出水面，四肢停止挣扎呈漂浮状态)。实验过程中水温保持在26±1℃，每只动物测试完毕后应及时换水，保证每组水质无差异，测试完成后立即用毛巾擦干并将大鼠归笼。

见图5，强迫游泳实验中不动时间的影响图，21天造模对各组大鼠在强迫游泳不动时间的影响可知，相比空白组，造模应激使得模型组大鼠强迫游泳不动时间显著增加,具有极显著差异(p<0.01),表明造模导致大鼠对增加了其行为绝望状态，近似地体现了抑郁症状。

造模后sd大鼠行为特征均发生改变，大鼠糖水偏爱率下降，穿越格数和直立次数均减少，中央格停留时间和强迫游泳不动时间均增多，cums模型构建成功。

(2)进行取材检测前30min灌胃营养半固体糊，进行胃残留率和小肠推进率的测试，并记录数据：

营养半固体糊的配置：量取300ml蒸馏水，加热到60-70℃，称取羧甲基纤维素钠12g，一边搅拌一边分次加入(待絮状溶液混匀后方可再次加入羧甲基纤维素钠)；同理依次称取奶粉19.2g，白糖9.6g，淀粉9.6g，搅拌半小时后，最后称取活性炭4g加入混匀配置成350ml的半固体营养糊。置于4℃暂存，用前2h取出，恢复至室温。

胃排空试验：待行为学测试完毕后，禁食不禁水12h，次日在进行取材检测大鼠30min前根据1ml/100g剂量灌胃自制半固体营养糊，30min后进行取材，迅速解剖取出全胃，结扎胃贲门和胃幽门，用滤纸擦干后称重得到胃全重(g),用手术剪沿着胃壁的大弯剪开，用蒸馏水清洗胃内容物，滤纸擦干后称重得到胃净重(g)。

胃内残留率(％)＝(胃全重-胃净重)/灌胃自制半固体营养糊重量×100％

胃排空实验中通过灌胃大鼠自制的半固体营养糊，对大鼠胃内残留率进行考察，可以在一定程度上反映抑郁伴胃肠疾病大鼠的胃排空功能。表1显示，相比空白组，模型组大鼠的胃内残留率升高，提示造模应激影响到了大鼠正常的胃排空功能。

表1造模前后各组实验动物抑郁大鼠胃内残留率的影响

与空白对照组比：**p<0.01,*p<0.05

小肠推进率试验：待行为学测试完毕后，禁食不禁水12h。次日在进行取材检测大鼠30min前根据1ml/100g剂量灌胃自制半固体营养糊，30min后进行取材，迅速解剖，剪开胃幽门和回盲部取出小肠(十二指肠、空肠和回肠)，拉直小肠至于干净的实验台上，用钢尺测量小肠的全长(cm)和胃幽门至自制半固体糊推进处的距离(cm)。

小肠推进率＝胃幽门至自制半固体糊推进处的距离/小肠的全长×100％

在小肠推进实验中，小肠推进率可以一定程度上反映在造模干预大鼠小肠蠕动功能是否会受到影响。表2显示，相比空白组，模型组大鼠的小肠推进率显著降低(p<0.01)，提示造模应激减缓了大鼠的小肠蠕动。

表2造模前后各组实验动物抑郁大鼠小肠推进率的影响(±s)

与空白对照组比：**p<0.01,*p<0.05

相比空白组，抑郁伴胃肠疾病的模型组大鼠胃内残留率增大，小肠推进率降低，提示抑郁伴有胃肠疾病的胃排空功能和小肠蠕动功能降低。

血清中胃动素和胃泌素的检测：采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(elisa)法在多功能酶标仪中测量待检样品的吸光度，按照试剂盒说明的步骤，利用检测的吸光度，绘制标准曲线计算得出待检样品中胃动素和胃泌素的含量。

造模后，与空白组相比，模型组大鼠血清胃动素含量有所减少，存在统计学意义(*p<0.01)

表3造模后实验动物模型大鼠胃动素的变化

与空白对照组比：**p<0.01,*p<0.05

造模后，与空白组相比，模型组大鼠血清胃泌素含量明显下降，存在统计学意义(*p<0.01)

表4造模后实验动物模型大鼠胃泌素的变化

与空白对照组比：**p<0.01,*p<0.05

造模后抑郁大鼠的胃肠动力不足，导致胃残留率增大以及小肠推进率减少，胃动素以及胃泌素的含量均减少，胃肠动力障碍模型构建成功。

(3)以上行为学测试、胃残留率和小肠推进率测试以及血清中胃动素和胃泌素的检测均用spss17.0软件采用t-检验方法进行统计分析。

综上，根据行为学结果以及胃排空率，小肠推进率，血清中胃动素和胃泌素的变化可知抑郁伴胃肠疾病模型构建成功。

为表明本发明具有以上优势，分别采用抑郁相关的行为学数据及胃肠动力不足的指标胃排空率和小肠推进率的变化评价抑郁伴胃肠动力障碍实验动物模型(结果见图1、图2、图3、图4、图5和图6，表1、表2、表3和表4)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。