本发明属于农药技术领域，具体涉及一种吡咯-2-羧酸衍生物在杀虫中的用途。
背景技术：
自从上世纪末文献报道发现植物内生真菌可以产紫杉醇后，国内外学者纷纷把目光转向植物(特别是药用植物)内生菌的研究，发现了植物内生菌除能够适应植物内部特殊环境外，还能够编码产生多种生物活性物质，用来增强植物对外界的抵抗力。此外，内生菌因长时间与宿主协同进化使其产生某些与宿主植物相同或结构相似的具有药用价值的代谢产物。近年来从植物内生菌发酵产物中分离得到的代谢产物结构类型多样，包括生物碱、甾体、萜类、蒽醌类、环肽类、黄酮类等。
中药百部是传统的止咳和杀虫药物，活性成分百部生物碱以含饱和氮杂奥化吡咯环状母核结构为特征，具有镇咳、祛痰、杀虫、抗菌等药理作用。百部内生菌产生与宿主植物活性相似的化合物，我们从百部内生菌发酵液中发现吡咯-2-羧酸衍生物具有很强的杀灭蚜虫、螨虫、飞虱、线虫、螟虫、飞蛾等的活性。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：
提供的吡咯-2-羧酸衍生物具有防治蚜虫、螨虫、飞虱、线虫、螟虫、飞蛾等的农药新应用。
发明采用如下技术方案：
吡咯-2-羧酸衍生物的结构式如下：
式i中：
r1,r2和r3独立选自氢，卤素，硝基，氰基，羟基，三氟甲基、c1-c4烷基，c1-c4卤代烷基，c1-c4烷氧基，苯基，苯基-c1-c4烷基，苯基-c1-c4烷氧基，苯氧基，5至6元杂芳基，5至6元杂环烷基中；
r4选自氢，至少单取代的c1-c8烷基，至少单取代的c3-c8环烷基，至少单取代的c3-c8环烷基-c1-c4烷基，至少单取代的4至7元杂环烷基，至少单取代的苯基，至少单取代的苯基-c1-c4烷基，至少单取代的5至6元杂芳基，至少单取代的5至6元杂芳基-c1-c4烷基，所述r4中，c1-c8烷基、c3-c8环烷基、c3-c8环烷基-c1-c4烷基、4至7元杂环烷基、苯基、苯基-c1-c4烷基、5至6元杂芳基、5至6元杂芳基-c1-c4烷基的取代基各自独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、羧基、氨基、c1-c4烷基、c1-c4卤代烷基、c1-c4烷氧基、苯基、苯基-c1-c4烷基、苯基-c1-c4烷氧基、苯氧基；
r1,r2和r3优选自氢、甲基、三氟甲基、乙基、丙基、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、甲酰胺基或乙酰胺基中的一种；
r4优选自氢、甲基、乙基、丙基或如下所示的基团；
r5选自氢、甲基、羟基、羟甲基、羟乙基、氨基、甲酰胺基或乙酰胺基；n选自1到5。
在本发明一些实施方式中，所述异构体选自对映异构体、非对映异构体、顺反异构体或立体异构体。
在本发明进一步优选的实施例中，所述化合物可以是如表1中所示的化合物：
上述吡咯-2-羧酸衍生物是从中药百部中内生链霉菌发酵产物中分离或通过化学合成得到。
所述的百部内生链霉菌bs-1是经过下述提取分离方法获得：采集百部新鲜药材，进行表面消毒处理。分别取百部的根茎叶切碎后放入离心管，加少量灭菌水，涡旋，80℃热水浴1min，取200μl涂板于isp4和燕麦培养基(加双抗：两性霉素50mg/l；萘啶酸25mg/l)，28℃培养一到两个月，并用m2平板纯化。
所述的百部内生链霉菌发酵液粗提物通过下述方法得到：配制种子培养基，将bs-1菌株接入种子培养基，26～30℃，培养3～5天得种子培养液；将得到的种子培养液接入发酵培养基中，26～30℃，200rpm培养6～9天得发酵物。加入2～6％xad-16树脂，继续振荡4～6h，离心弃去上清液，加入甲醇提取，涡旋超声，离心，取上清甲醇溶液，蒸干得到菌株粗提物。
所述的百部链霉菌中的吡咯-2-羧酸衍生物是通过下述方法分离纯化：将所述bs-1粗提物，先后采用mci、反相硅胶、sephadexlh-20分离材料进行柱色谱分离，并辅以prep-hplc方法进行纯化，获得单体化合物。
作为优选：分离纯化时，bs-1粗提物经过减压mci柱层析，采用甲醇-水按0-100％甲醇梯度洗脱。再采用反相硅胶、sephadexlh-20分离材料进行柱色谱分离，并辅以prep-hplc方法进行纯化，获得单体化合物(具体分离过程见实施例2)。所述吡咯-2-羧酸酯类化合物在制备杀虫剂中的用途，尤其是在制备杀二斑叶螨、棉蚜虫药物中的应用。
有益效果：数据结果表明本发明化合物2、3、4、5、9、10、4-甲基-1h-吡咯-2-甲酸(11)(购自上海升泓生物科技有限公司)、对叶百部碱(tu)(购自南京金益柏生物科技有限公司)、bs-1粗提物(bs-1)对蚜虫和二斑叶螨成虫均具有杀虫活性；其中吡咯-2-羧酸(11)、对叶百部碱(tu)、bs-1粗提物(bs-1)对蚜虫的杀虫活性较高，化合物3、对叶百部碱(tu)对二斑叶螨的杀虫活性较高(杀虫活性数据见实施例4)。
具体实施方法
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：
(1)百部内生链霉菌的分离：采集百部新鲜药材，进行表面消毒处理。分别取百部的根茎叶切碎后放入离心管，加少量灭菌水，涡旋，80℃热水浴1min，取200ul涂板于isp4和燕麦培养基，28℃培养一到两个月，并用m2平板纯化。
(2)bs-1的菌种培养：配制isp4培养基(isp437g/l；agar15g/l)；配制燕麦培养基(oatmeal65g/l)。配制m2培养基(glucose,4.0g/l；yeastextract,4.0g/l；maltextract,10.0g/l；caco3,2.0g/l；agar,18.0g/l)。120℃灭15-20分钟。
(3)bs-1的发酵液的培养[cornflour,40.0g/l；glucose,10.0g/l；glutenpowder,5.0g/l；k2hpo4·3h2o,0.5g/l；bran,10.0g/l；caco3,2.0g/l；(nh4)2so4,1.0g/l]。发酵液平均分装于150个250ml锥形瓶，120℃灭15-20分钟。将bs-1菌株接入配制好的种子培养基中，于28℃下，培养3天得种子培养液；将种子也以5％比例接入发酵液中。
实施例2：吡咯-2-羧酸酯类化合物的制备：将实施例1得到的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的甲醇萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；浸膏经过减压mci柱层析，采用甲醇-水按0-100％甲醇梯度洗脱，hplc分析合并为12个组分(a-l)。组分b用制备液相制备，洗脱条件：35％甲醇-水等度洗脱，得化合物2(8.8mg)。组分c用制备液相制备，洗脱条件：35％甲醇-水等度洗脱，得化合物7(7mg)。组分f过凝胶，分成3个部分(f1-f3)，f2部分用制备液相制备，洗脱条件：30％甲醇-水等度洗脱，得化合物6(2mg)。组分g用制备液相制备，洗脱条件：0-30min，体积分数为40％的甲醇线性增加至60％的甲醇，得化合物4(14mg)和化合物1(7.7mg)。组分i部分用制备液相制备，洗脱条件：60％甲醇-水等度洗脱，得化合物3(23mg)。组分j过凝胶柱，分成三个部分(j1-j3)，j1部分用制备液相制备，洗脱条件：60％甲醇-水等度洗脱，得化合物10(34.6mg)。j2部分用制备液相制备，方法：0-30min，体积分数为50％的甲醇线性增加至80％的甲醇，得化合物5(19.0mg)。j3部分用制备液相制备，洗脱条件：0-30min，体积分数为40％的甲醇线性增加至70％的甲醇，得化合物8(11.7mg)。组分k用制备液相制备，洗脱条件：75％甲醇-水等度洗脱，得化合物9(61mg)。
化合物结构如下式：
实施例3：
取上述实施例2制备的化合物1，其鉴定过程：根据高分辨质谱数据212.0901[m+h]+，推算出该化合物1的分子式为c10h13no4，不饱和度为5。氢谱数据显示，有两个甲基(δh2.02,1.27)，一个亚甲基(δh2.57)，三个次甲基(δh6.77,6.53,5.24)。碳谱数据显示，有两个芳香碳(δc121.6,119.0)，两个羰基(δc159.7,171.7)。cosy谱图数据提示有两个结构单元：nh-1/h-5/4-ch3/h-3和7-ch3/h-7/h2-8。再由hmbc谱图信息，h-3(δh6.77)与c-2/c-4/c-5相关；h-5(δh6.53)与c-3/c-4相关推出关键骨架4-甲基l-1h-吡咯-2-羧酸。通过h-3/c-6和h-7/c-6的hmbc相关把上面两个结构单元连接起来。
化合物2,3,4,5,6,7,8,9,10的鉴定过程同化合物1一致，只在化合物1的基础上分别增加了脂肪链长度或者替换了c-4/c-9的取代基团。
化合物1-10的1hnmr数据见表1，化合物1-10的13cnmr数据见表2。
化合物1的绝对构型用合成法确定。r/s构型的羟基丁酸甲酯与吡咯羧酸反应生成r/s构型的吡咯羧酸酯，得到对应构型的产物1a/1b，比旋光度(1a,[α]20d-12.0；1b,[α]20d+9.0)；而化合物1比旋光度为[α]20d-25.7，因此确定化合物1的绝对构型为7r。命名为endostemoninea。
其它9个吡咯-2-羧酸酯类化合物与化合物1为相同骨架化合物，只在其结构基础上有微小变化，其结构分析过程参照化合物1，命名为endostemonineb-j。
表1.化合物1-10的1hnmr数据
#measuredincd3od.
表2.化合物1--10的13cnmr数据
#measuredincd3od.
实施例4：
本发明吡咯-2-羧酸酯类化合物的抗虫活性的测定。
试验方法：取化合物2、3、4、5、9、10(结构见实施例1)、4-甲基-1h-吡咯-2-甲酸(11)(购自上海升泓生物科技有限公司)、对叶百部碱(tu)(购自南京金益柏生物科技有限公司)、bs-1粗提物(bs-1)、对照药(吡虫啉im、联苯肼酯bi)(购自江苏省苏科农化有限责任公司)各对蚜虫和二斑叶螨进行活性测试。
药剂配制：将待测样品用少量无水甲醇溶解，然后用0.1％吐温-80水稀释到所需浓度。
蚜虫活性测试：选成蚜接到黄瓜叶片上，繁殖两天，剔除母蚜和较小的蚜虫，使叶片上保持25头左右的若蚜。将叶片剪下，连同蚜虫一起浸渍到药液中10s，用滤纸吸取多余的药液，晾干水渍。叶柄用脱脂棉包住，加水保湿；放到90mm培养皿中，用保鲜膜盖好，防止蚜虫爬出。处理后24h、48h和72h调查活虫数和死虫数，共调查2次。在体视镜下，用毛笔轻触虫体，不动的视为死亡。
二斑叶螨活性测试：选取带有二斑叶螨成螨的四季豆苗叶片，剪取叶片，剔除若螨，使叶片上保持30头左右的成螨，接到无虫叶片上；第二天剪下带有成螨的叶片(25头左右/叶片)，将叶片连同成螨一起浸渍到药液中10s，用滤纸吸取多余药液，晾干水渍；用吸水纸包住叶柄，放到一次性水杯中，杯中加水20ml，为防止叶片浸入水中，下面可垫吸水纸。处理后24h、48h和72h调查活虫数和死虫数，共调查2次。在体视镜下，用毛笔轻触虫体，不动的视为死亡。
计算方法：
pt—处理组死亡率，单位为百分率(％)；
p0—对照组死亡率，单位为百分率(％)；
根据不同浓度下虫子的死亡率拟合二元一次方程，得吡咯-2-羧酸酯类对蚜虫和二斑叶螨的毒力测定结果，见表3。
表3.对蚜虫，二斑叶螨在72h的毒力测定结果
结果与分析：
表3的数据表明该类化合物对棉蚜虫有高抑制活性(lc50范围：3.55-32.00ppm)；对二斑叶螨有中等抑制活性(lc50范围：197.6-685.5ppm)，具有潜在的防治蚜虫和螨虫的功效。对叶百部碱(tu)是百部植物中具有杀虫活性的主要成分，从表中数据来看，百部内生菌粗提物bs-1对蚜虫防治作用强于对叶百部碱，百部内生菌粗提物bs-1对二斑叶螨防治作用与对叶百部碱相当。
化合物2、3、4、5、9、10、4-甲基-1h-吡咯-2-甲酸(11)、对叶百部碱(tu)、bs-1粗提物(bs-1)对蚜虫和二斑叶螨成虫均具有杀虫活性；其中4-甲基-1h-吡咯-2-甲酸(11)、对叶百部碱(tu)、bs-1粗提物(bs-1)对蚜虫的杀虫活性较高，化合物3、对叶百部碱(tu)对二斑叶螨的杀虫活性较高。
不同浓度吡咯-2-羧酸酯类对蚜虫和二斑叶螨均有一定的毒力，且在相同时间内随着杀虫剂浓度的升高，其死亡率逐渐升高。
实验表明：吡咯-2-羧酸酯化合物能杀灭二斑叶螨、蚜虫。吡咯-2-羧酸酯化合物有望替代百部药材来发挥药材原本的杀虫效果。