一种用于防治镰刀菌的共振异构体固体混合物的制作方法

本发明涉及一种对于镰刀菌有抑制活性物质，可以用于治疗植物或者动物（包括人）镰刀菌引起的疾病，属于动植物抗真菌感染的药物领域。

背景技术：

烯胺酯类化合物具有优异的杀菌活性，其中（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯是这类化合物的优秀代表。其对于镰刀菌有高效的专杀活性，它不仅能有效防治由镰刀菌引起的小麦赤霉病，同时也可以有效降低致癌物小麦赤霉毒素的产生。

但是，（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯在实际使用的时候药效不够稳定，做成水悬浮剂使用的时候，不同批次的抗真菌活性总是有差异。

技术实现要素：

研究（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯的具体结构，发现该化合物的nh2两个活泼氢核磁数据在氘代氯仿中与d6mso氢的出峰位置有所区别，在氘代氯仿中，一个在9.56，另一个在5.90，而在d6mso中一个在9.50，另一个从5.9移到在9.30。很明显，两个氢的化学环境不同，升高核磁检测温度，其中最为9.5的峰没有位移，但是从9.30的峰变成了8.90，二者化学位移距离不仅没有接近反而增大了。

研究（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯红外谱图发现，红外谱图难以完全解释它的相应结构。在红外谱图中（见附图3），分别有1670和1622处有两个c=o伸缩振动或者c=n双键的特征吸收峰。而且1622的吸收强度远远要强于1670，这从基本理论上很难解释（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯的结构。在理论上，该化合物只有一个羰基，碳碳双键的强度应该小于碳氧双键的吸收峰。将其和甲醛和吗啉反应制备成曼尼希碱，取代一个氢，这两个峰消失一个。只保留一个1640的峰。很明显，之所以出现1670和1620的峰是由于nh2上的氢引起的。

附图1是（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯同系化合物（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸甲酯的x射线单晶衍射谱图结果，单晶衍射给出的结果表明，c7和nh2其碳氮键的键长在1.32，一般来讲碳氮双键的键长在1.35，很明显，单键的解释不符合分子结构中的c-n键长，反而双键更符合这样的单晶数据分析结果。

碳碳双键的键长在1.40和苯环上的芳香环上的碳碳的键长接近，c10和氧的碳氧双键的键长也在羰基和单键之间更接近双键，c8-c10碳碳单键的键长在1.45，也接近芳香环上c-c键长；这些都指明一点，（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸甲酯的固体形态存在芳香环的特征。

(z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯应该由如下的结构解释：碳氧双键、碳碳双键和氮上的孤对电子形成6电子的芳香环结构，以n-h-o形成稳定的氢键连接。在溶液中，由于n-h-o氢键在氮氧之间振动速度快，(z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯表现出来了一个峰纯的单一物质。

在固体状态，在n-h-o中之间的h振动的速度变慢，其化学过程如下图所示：氢键会发生断裂，当靠h靠近氮的时候，就显示c=o的特性如（共振结构式1），当靠近氧的时候，就显示c=n的特性如（共振结构式2）。其固体应该为共振异构体1和共振异构体2的混合物。

为了进一步验证探讨亚胺烯醇式（共振式2）存在的可能，用gcmass和massfrontier分析（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯的碎片（谱图见附图2），(z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯的气质谱图，在198左右有一个碎片峰，这意味着，（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯存在m-18的碎片峰，可能存在着羟基；进一步通过massfrontier谱图可以明显地组装出含有亚胺烯醇式异构体的存在。

综合上述，（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯在固体形态的时候并不是以前认为纯的化合物，而是由（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯（简称共振异构体1）和其共振异构体（z）-3-乙氧基-3-羟基-2-（（亚氨基）（苯基）甲叉基）丙烯腈（简称共振异构体2）组成的混合物。

在自然界，生命体的90%以上是水，决定药效中的活性物质的生物活性是由其在水中的溶解速度，传播速度决定的。

根据构效的关系，烯醇式异构体由于含有羟基和亚氨基，会比单纯的烯胺酯结构在水中的溶解速度要快。共振异构体2在由共振异构体1和在共振异构体2中的比例不同导致了，固体混合物在水中的溶解速度不同，从而导致了该固体实际使用中对于镰刀菌的防治效果不同。

异构体2比例的提高，固体的混合物的溶解速度会相应地提高，实际使用效果更好。

本发明提出一种对于镰刀菌具有抑制活性的共振异构体固体混合物，由（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯（共振异构体1）和（z）-3-乙氧基-3-羟基-2-（（亚氨基）（苯基）甲叉基）丙烯腈（共振异构体2）组成，所述共振异构体2会加速固体混合物在水中的溶解速度，提高固体混合物对于镰刀菌的防治效果。

上述所提出的一种对于镰刀菌具有抑制活性的共振异构体固体混合物，其特征为所述共振异构体2在所述固体混合物中的含量范围在20%-80%，优选30-60%。

一种对于镰刀菌具有抑制活性的共振异构体固体混合物，其特征为所述有抑制活性的镰刀菌为茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、轮枝镰刀菌、尖孢镰刀菌、层生镰刀菌、半裸镰刀菌、胶孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌、单格镰刀菌、拟枝镰刀菌、雪腐镰刀菌、本色镰刀菌、燕麦镰刀菌、木贼镰刀菌、小麦赤霉菌中单纯一种或者任选几种的组合。

一种对于镰刀菌具有抑制活性的共振异构体固体混合物，其特征为所述的混合物可以用作治疗小麦赤霉病、黄瓜枯萎病、草莓枯萎病、小麦茎基腐病、香蕉枯萎病、水稻穗腐病、花生根腐病、西瓜枯萎病、芒果炭疽病、黄瓜炭疽病、水稻恶苗病、玉米穗粒腐病中一种或者任意几种并发的镰刀菌为病原菌的植物病害。

一种对于镰刀菌具有抑制活性的共振异构体固体混合物，其特征为所述混合物对于人类或者动物镰刀菌有防治效果，可以用于镰刀菌感染的治疗。

上述的镰刀菌感染，为镰刀菌角膜炎或者镰刀菌甲癣的致病菌。

本发明提出一种控制权利活性固体混合物中共振异构体1和共振异构体2比例的方法，该方法包括如下的步骤：1）将共振异构体1或者共振异构体1和共振异构体2固体混合物升温到一定的温度2）并在该温度保持一定的时间，3)然后以降温梯度降到一定的温度。通过上述的反应条件可以有效控制共振异构体1和共振异构体2的比例。

控制上述固体混合物中共振异构体1和共振异构体2比例的方法，其特征为所述步骤1)的温度为在固体形态的70-120℃或者熔融状态的120-170℃。

控制固体混合物中共振异构体1和共振异构体2比例的方法，其特征为所述步骤2）中保温时间范围为0-16小时。

控制权利要求固体混合物中共振异构体1和共振异构体2比例的方法，其特征为所述的降温梯度范围从5℃每小时到170℃每分钟。

附图说明：

附图1：(z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸甲酯x射线单晶衍射模拟结果

附图2：(z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸甲酯气质谱图mass-frontier谱图注解结果

附图3：共振异构体1和供着异构体2的固体混合物固体红外谱图。

【具体实施例】

为了更好地说明本说明书的内容，更好让本领域技术人员理解本发明解决技术问题的技术手段，所要达到的技术效果，下面结合具体实施例来进一步阐述。当然本发明不仅限于具体实施例所描述的方法和范围；

1、制备实施例

1.1：（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯制备路线1

将该化合物2-氰基-3-氯-3-苯基丙烯酸乙酯与氨水在惰性溶剂溶剂中反应，包括二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃，在吡啶、三乙胺或n，n-二甲基苯胺缚酸剂存在下，在0-70℃下搅拌反应，过滤，脱溶，水洗，得（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯；

1.2：（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯制备路线2

将苯基亚氨基乙酯与氰乙酸乙酯在溶剂中或者无溶剂投入在一定温度下反应反应，用催化剂，催化包括有机叔胺（三乙胺、吡啶或n，n-二甲基苯胺）或者无机盐包括（碳酸氢铵、碳酸铵、尿素），在一定的反应温度下，温度范围0-100℃反应2-8小时，降温、过滤、水洗得到（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯；

1.3不同比例共振异构体1和共振异构体2固体混合物的制备

不同比例共振异构体1和共振异构体2固体混合物的制备方法将按照如下的过程：1）将（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯固体升温到一定的温度，这个温度范围包括50-120℃的固体熔融之前的温度，包括从120-170℃的熔融状态，并保持一定的时间，保温时间从15分钟-16小时，然后再以一定的降温梯度降温，这样的降温梯度可以从5℃每小时到170每分钟。通过这样的温度条件得到不同比例共振异构体1和共振异构体2的固体混合物；

1.3.1共振异构体1：共振异构体2=1:1固体混合物的制备

将5g（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯升温到150℃，待熔融后保持15分钟，然后迅速将此固体放置在0℃的冰水浴中。得到含共振异构体1:共振异构体2=1:1的固体混合物；

1.3.2共振异构体1：共振异构体2=2:1固体混合物的制备

将5g（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯升温到150℃，待熔融后保持15分钟，然后以每小时5度的梯度降温到25℃。得到含共振异构体1:共振异构体2=2:1的固体混合物；

2、使用效果

2.1溶解速度测试

1、材料与方法

样品：1）共振异构体1：共振异构体2比例分别为2:1，1.5:1，1:1的固体粉末样品，研磨后用400m的过筛，平均粒径（40微米）

测量方法：

1）将上述固体混合物准确称取0.1g，放入25ml容量瓶

2）将用移液管准确量取温度为25℃的蒸馏水，放入25ml容量瓶

3）放入25℃的恒温水浴

待一定的时间内分别取一定量的液体，用滤头过滤后液相色谱分析测量水溶液的（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯浓度；

2.2固体的水溶液对于小麦赤霉菌的抑制活性

2.2.1、材料与方法

1.供测试剂及计量设计：

共振异构体1：共振异构体2=1:1的固体的水溶液

（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯原药（丙酮溶液）

1.1供测靶标：

小麦赤霉病（gibberllazeae），敏感菌株（g4）

2.2.2试验操作：

2.1含药培养基制备：按照一定的浓度梯度，将测试药剂分别加入经灭菌并冷却至45℃左右的培养基中混匀；

2.2测试方法：采用菌落直径法。将药剂母液稀释成系列浓度制备含药培养基，每皿接种一菌碟，菌丝面朝上。26℃培养至无水对照菌落布满培养皿三分之二时，测量各浓度处理的菌落直径，每个处理3次重复。每个菌落十字交叉法测量2次，以其平均数代表菌落的大小，计算药剂对于菌体的生长率的抑制，建立毒力回归方程，求出ec50，ec90及相关系数r

2.2.3试验结果：

表1、共振异构体1：共振异构体2固体混合物水溶液与（z)2-氰基-3-苯基-3-氨基丙烯酸乙酯原药（丙酮溶液）对小麦赤霉病的室内活性结果表

2.3共振异构体1：共振异构体2=1:1固体混合物水溶液对于镰刀菌的抑制活性

按照2.2的测试方法，测试固体混合物对于不同植物病原菌的抑制活性

表3：共振异构体1：共振异构体2=1:1固体混合物抑制植物病原菌的毒力

2.4共振异构体1：共振异构体2=1:1固体混合物对于不同镰刀菌的抑制活性

表4：共振异构体1：共振异构体2=1：1固体混合物对于植物动物（包括人）致病镰刀菌的活性