一种梨幼胚培养方法与流程

本发明涉及植物生物技术中离体快繁的育种方法，具体地说，涉及一种梨幼胚培养方法。

背景技术：

梨是世界性主要水果之一，是我国仅次于苹果、柑橘的第三大水果。梨是我国种植历史最悠久的果树之一，早在先秦时代，《诗经》中就有“山有苞棣，隰有树檖”的记载。梨也是是我国种植范围最广的果树之一，根据2019年1月联合国粮农组织(fao)的最新统计数据显示，截止到2017年底，我国梨栽培面积约96万公顷，总产量约1653万吨，分别占世界总栽培面积和总产量的69.1％和68.4％，稳居世界第一位。

经过长期的自然选择和生产发展，我国已经逐步建立了秋子梨、白梨及砂梨等优势产区。根据农业部2009年颁布的全国梨重点区域发展规划，传统的梨优势产区被划分为“三区四点”，体现出了较强的区域特色和生产优势。近年来，随着翠冠、黄冠等早中熟新品种的迅速发展，长江流域及其以南地区的南方早熟梨产业呈现了日新月异的面貌，梨果品质和经济效益显著提升。

梨可以采用播种、嫁接、扦插等方法繁殖，但这些方法都存在一定的局限性。播种繁殖的方式有两种，分别为春播和秋播，春播的种子需经过催芽，而秋播的种植则需经过浸泡及冲洗，繁殖所用时间较长。扦插的方式需要选择较健壮且无病虫害侵扰的枝条作为插穗，耗费物力大而且容易受到天气的影响。嫁接的方式需较细的人力操作，且繁殖效率低，接穗不易成活。这些因素极大限制了梨产业的发展。自然条件下，梨果实成熟后种子一般要第二年才能萌发，木质化种壳对水分的阻碍以及胚乳的包裹作用可能是导致梨种子休眠的原因。目前关于梨幼胚培养的研究报道较少，没有形成较成熟完善的理论和方法体系。因此，很有必要建立梨幼胚培养技术体系，为构建梨再生体系积累经验。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供出一种梨幼胚培养方法，本发明方法以梨未成熟幼胚或成熟幼胚为外植体，经过外植体消毒、幼胚培养、生根培养、炼苗移栽建立了梨离体幼胚的培养技术体系，该方法可以显著缩短育种进程，提高育种效率，开辟了一种新的育种途径。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种梨幼胚培养方法，该方法包括以下步骤：

(1)外植体消毒处理：选取授粉后5-6周的未成熟梨果实，采摘后先在低温条件下进行春化处理3-5d，将春化处理后的果实用水冲洗后剥去果皮、果肉，获得未成熟幼胚或带有种皮的成熟幼胚，再将未成熟幼胚或带有种皮的成熟幼胚用水充分清洗(优选为先用自来水洗1-2次后用蒸馏水冲洗5-7次)后吸干表面水分；在超净工作台上，以70％-75％乙醇浸泡未成熟幼胚或带有种皮的成熟幼胚10-30s，再用无菌水清洗(优选为清洗3-5次)，然后使用3.3％次氯酸钠溶液消毒4-6min，再用无菌水清洗后吸干未成熟幼胚或带有种皮的成熟幼胚表面水分后备用；

(2)幼胚培养：将步骤(1)处理后的带有种皮的成熟幼胚用已灭菌的镊子和解剖刀剖开种皮取出成熟幼胚，将未成熟幼胚或成熟幼胚接种于幼胚培养基上，进行幼胚培养；接种后置于每天光照10-14h，光照强度为800-1000μmolm^-2s^-1，相对湿度为70％-75％，培养温度为22-28℃的条件下培养至幼胚萌发，继续培养获得长出2-3对真叶的幼苗；

(3)生根培养：将步骤(2)所获得的长出2-3对真叶的幼苗在根颈以下0.6-1.2cm处剪断主根后接种到生根培养基上进行促根培养，接种后先在25-28℃条件下全暗培养1-3d，然后置于每天光照12-14h，光照强度为800-1000μmolm^-2s^-1，相对湿度为70％-75％，培养温度为22-28℃的条件下培养至生根；

(4)炼苗移栽：待幼苗长至3-5cm高后置于自然光照下炼苗5-7d，洗净根部培养基，移栽至草炭土基质中，覆膜，并向基质和叶片施用1/4ms大量元素营养液，保持湿度，7d后逐渐撤去覆膜，并逐步减少营养液施用次数，待幼苗成活后再移栽大田。

步骤(2)所述的幼胚培养基为：ms+1.8-2.0mg/l6-ba+0.1-0.2mg/liba+0.5％-0.7％琼脂，ph值为5.6-5.9。

步骤(3)所述的生根培养基为：1/2ms+0.4-0.5mg/liba+0.5％-0.7％琼脂，ph值为5.6-5.9。

步骤(1)中所述的低温条件为1-7℃条件。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用生物技术的方法，从幼果中取出未成熟幼胚或成熟幼胚进行无菌培养，可以缩短育种进程，提高育种效率。

(2)采用本发明中的离体培养方法，可结合传统田间杂交育种，开辟新的育种途径。

附图说明

图1为未成熟幼果的取样大小及未成熟、成熟胚的实物图；

图2为未成熟、成熟胚的扩繁-快速繁殖过程实物图(未成熟、成熟胚培养)。

图3为生根苗实物图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1：一种梨幼胚培养方法

(1)外植体消毒处理：

选取授粉后5周的未成熟梨果实(图1)，采摘后先在4℃条件下进行低温春化处理，5d后取出，使用自来水冲洗果实10min，然后剥去果皮、果肉，将获得的未成熟幼胚(种皮未发育)或带有种皮的成熟幼胚(种子)先用自来水洗1次后用蒸馏水冲洗5次，之后静置于滤纸上10min，将未成熟幼胚或带有种皮的成熟幼胚表面水分吸干。在超净工作台上，以75％乙醇浸泡未成熟幼胚或带有种皮的成熟幼胚20s，用无菌水清洗4次，然后使用3.3％次氯酸钠溶液消毒6min，再用无菌水清洗4次后用无菌滤纸吸干未成熟幼胚或成熟幼胚表面水分后备用；

(2)幼胚培养：

将步骤(1)处理后的带有种皮的成熟幼胚置于无菌滤纸上，用已灭菌的镊子和解剖刀剖开种皮取出成熟幼胚，将未成熟幼胚或成熟幼胚接种于含ms+2.0mg/l6-ba+0.2mg/liba+0.7％琼脂，ph值为5.8的幼胚培养基上(图2)，进行幼胚培养。接种后置于每天光照12h，光照强度为800μmolm^-2s^-1，相对湿度为75％，培养温度为22-28℃的条件下培养直至幼胚萌发，继续培养获得长出2-3对真叶的幼苗；

(3)生根培养：

将长出2对真叶的幼苗在根颈以下1.0cm处剪断主根后接种到含1/2ms+0.5mg/liba+0.7％琼脂，ph值为5.8的生根培养基上进行促根培养，接种后先在25-28℃条件下全暗培养2d，然后置于每天光照12h，光照强度为800μmolm^-2s^-1，相对湿度为75％，培养温度为22-28℃的条件下培养至生根(图3)。35天后，其生根成苗率能够达到40％左右。

(4)炼苗移栽：

待幼苗长至4cm高后置于自然光照下炼苗7d后，洗净根部培养基，移栽至草炭土基质(市售常规基质)中，覆膜，并向基质和叶片施用1/4ms大量元素营养液(市售)，保持湿度，7d后逐渐撤去覆膜，并逐步减少营养液施用次数，待幼苗成活后再移栽大田。

本发明方法以梨未成熟幼胚或成熟幼胚为外植体，经过外植体消毒、幼胚培养、生根培养、炼苗移栽建立了梨离体幼胚的培养技术体系，以期为建立梨再生体系、利用基因工程和细胞工程改良梨品种奠定基础，该方法可以显著缩短育种进程，当年即可成苗，提高育种效率，开辟了一种新的育种途径。