大菱鲆养殖用益生菌、饲料及无抗化养殖方法与流程

本发明属于鱼类养殖技术领域，具体涉及大菱鲆养殖用益生菌、饲料及无抗化养殖方法。

背景技术：

大菱鲆，俗称多宝鱼，原产自欧洲，适应低温水环境，肉质细嫩，营养丰富，深受消费者喜爱，是我国北方工厂化养殖的支柱产业之一。

但是，随着养殖规模的快速增长，养殖密度的增加，以及水体环境的恶化，一系列的疾病也随之而来。近年来在大菱鲆养殖过程中细菌性疾病的急剧爆发严重影响并制约了我国大菱鲆养殖产业的健康发展，给养殖户带来了巨大的经济损失。为了防治大菱鲆的养殖疾病，目前大菱鲆养殖业中长期存在用药不规范、甚至滥用违禁药物的问题。其中，抗生素的不规范使用导致药物残留及污染问题已成为人们关注的焦点。因此，探寻有效的替代抗生素预防或治疗大菱鲆疾病的技术方法，在保证养殖大菱鲆健康成长的前提下，减少或杜绝抗生素的使用是当前急需解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明提供大菱鲆养殖用益生菌、饲料及无抗化养殖方法，该益生菌可有效抑制大菱鲆养殖的致病病原菌，将该益生菌应用于饲料可替代抗生素起到防治大菱鲆疾病的效果，采用该无抗化养殖方法可在保证大菱鲆健康成长前提下，在养殖全周期过程中减少或避免抗生素的使用，从而解决大菱鲆养殖中抗生素残留以及环境污染的问题。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一株大菱鲆养殖用益生菌，命名为纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)，经鉴定为枯草芽孢杆菌属，该菌株于2020年06月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2020184。

作为优选，所述纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)为通过培养分离方法从日本纳豆中筛选取得的枯草芽孢杆菌菌株，所述纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌具有抑制效果。

本发明还公开了一种大菱鲆养殖用饲料，包括a组分饲料，所述a组分饲料包括益生菌组分，所述益生菌组分的原料组分包括所述大菱鲆养殖用益生菌。

作为优选，所述益生菌组分的原料组分还包括凝结芽孢杆菌(baci//uscoagulan)bncc136363，所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulan)bncc136363购自北京北纳创联生物技术研究院，所述纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)与所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulan)bncc136363的活菌数量比为1∶2；所述a组分饲料的活菌数量大于或等于10⁷cfu/kg(a组分饲料的活菌数量为用平板涂布方法检测测得的单位质量的a组分饲料中所含的益生菌组分的活菌数量)。

作为优选，所述的大菱鲆养殖用饲料还包括b组分饲料，所述b组分饲料的原料组分包括中草药提取物组分，所述中草药提取物组分包括牛至精油、黄芪多糖和黄酮。

作为优选，所述牛至精油提取自牛至，所述牛至精油在b组分饲料中的含量为1ml/kg；所述黄芪多糖和黄酮分别采用水蒸汽蒸馏法提取自黄芪和甘草，所述黄芪多糖和黄酮质量比为1.5∶1，所述黄芪多糖和黄酮在b组分饲料中的总含量为0.7wt％-0.9wt％。

作为优选，所述a组分饲料和b组分饲料均包括营养成分，所述营养成分的组分及其重量份数包括：粗蛋白40份，粗脂肪28份，粗灰分10份，粗纤维3份、总磷1.5份，份钙1.5份，所述营养成分还包括微量元素，所述微量元素包括cu、mn、zn、l，所述微量元素在所述饲料中的总含量为6mg/kg。

本发明还公开了一种大菱鲆无抗化养殖方法，采用所述大菱鲆养殖用饲料。

作为优选，所述的大菱鲆无抗化养殖方法包括以下步骤：

疫苗制备：从养殖区的患病大菱鲆体内分离、筛选出杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌，对所得杀鲑气单胞菌菌株和大菱鲆弧菌菌株进行培养后，对菌液进行灭活以制备灭活疫苗；

疫苗接种：对养殖区内的健康大菱鲆经腹部注射灭活疫苗，将免疫接种后的大菱鲆放回养殖池中；

饲料饲养：正常饲养完成疫苗接种的大菱鲆，并采用所述菱鲆养殖用饲料对完成疫苗接种的大菱鲆进行饲喂。

作为优选，所述的大菱鲆无抗化养殖方法所用的所述大菱鲆养殖用饲料包括所述a组分饲料和b组分饲料，所述饲料饲养步骤包括多个饲喂周期，一个所述饲喂周期中，采用所述a组分饲料饲喂10-12天，停喂所述a组分饲料3-4天，再采用所述b组分饲料饲喂5-7天，停喂所述b组分饲料3-4天，停喂所述a组分饲料或所述b组分饲料时可以用常规饲料饲喂大菱鲆；一个所述饲喂周期结束后再重复进行下一个所述饲喂周期。上述一个所述饲喂周期中，采用所述a组分饲料饲喂天数可为10-12天中任意天数，如10天、11天或12天；停喂所述a组分饲料天数可为3-4天中任意天数，如3天或4天；采用所述b组分饲料饲喂天数可为5-7天，如5天、6天或7天；停喂所述b组分饲料天数可为3-4天，如3天或4天。

作为优选，一个所述饲喂周期中，一个所述饲喂周期中，采用所述a组分饲料饲喂12天，停喂所述a组分饲料4天，再采用所述b组分饲料饲喂7天，停喂所述b组分饲料4天。

作为优选，所述的大菱鲆无抗化养殖方法还包括病原菌检测步骤，所述大菱鲆无抗化养殖方法包括以下步骤：

病原菌检测：在养殖区的患病大菱鲆中取样，对样本所含细菌进行检测，以确定致病的病原菌，所述病原菌检测包括对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的检测，以确定病原菌包括杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌；

疫苗制备：从养殖区的患病大菱鲆体内分离出杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌，通过人工感染试验筛选出对健康大菱鲆具有较强毒性的杀鲑气单胞菌菌株和大菱鲆弧菌菌株；对所得杀鲑气单胞菌菌株和大菱鲆弧菌菌株分别进行繁殖培养后，将两种菌液分别进行离心，离心速度为3500r/min，离心所得沉淀物经反复清洗后，用pbs缓冲液分别稀释为活菌含量1×10⁹cfu/ml的杀鲑气单胞菌菌液和大菱鲆弧菌菌株菌液；分别在所得的两种菌液中添加0.2％的甲醛溶液，28℃下灭活24h，得杀鲑气单胞菌灭活菌液和大菱鲆弧菌菌株灭活菌液，取杀鲑气单胞菌灭活菌液和大菱鲆弧菌菌株灭活菌液各100l，分别接种在tsb固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中，放置24h后进行观察，培养皿中无菌落长出，所得杀鲑气单胞菌灭活菌液和大菱鲆弧菌菌株灭活菌液即可作为杀鲑气单胞菌灭活疫苗和大菱鲆弧菌菌株灭活疫苗；

疫苗接种：所得杀鲑气单胞菌灭活疫苗和大菱鲆弧菌菌株灭活疫苗按体积比1∶1的混合液后，加入与所述混合液等体积的弗氏佐剂得注射疫苗，对养殖区内的健康大菱鲆经腹部注射0.1ml注射疫苗即完成免疫接种，将免疫接种后的大菱鲆放回养殖池中；

饲料饲养：所述饲料饲养步骤的每日饲料投喂量为鱼体重的2wt％-5wt％，饲养环境的水温为14℃～19℃，盐度29-32，ph为7.8-8.2。

本发明的有益效果为：提出了大菱鲆养殖用益生菌、饲料及无抗化养殖方法，该益生菌可有效抑制大菱鲆养殖的致病病原菌，将该益生菌应用于饲料可替代抗生素起到防治大菱鲆疾病的效果，采用该无抗化养殖方法可在保证大菱鲆健康成长前提下，在养殖全周期过程中减少或避免抗生素的使用，从而解决大菱鲆养殖中抗生素残留以及环境污染的问题。

附图说明

图1为饲料饲养方式对大菱鲆体重影响对比图；

图2为抗生素养殖方法和无抗养殖方法对大菱鲆体重影响对比图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本领域已知杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌是大菱鲆细菌病的主要致病病原菌，在养殖过程中，一般采用抗生素防治由其引起的大菱鲆细菌病。

本发明从日本纳豆中筛选得到一株大菱鲆养殖用益生菌，经鉴定为枯草豆芽孢杆菌属，该益生菌可以产生抑菌产物，对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌具有较好的抑制效果，能够替代抗生素防治由杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌引起的大菱鲆细菌病。该益生菌菌株命名为纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)，该菌株于2020年06月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2020184。

一种大菱鲆养殖用饲料，包括a组分饲料，所述a组分饲料包括益生菌组分，所述益生菌组分的原料组分包括所述大菱鲆养殖用益生菌。

一种大菱鲆无抗化养殖方法，采用上述大菱鲆养殖用饲料。

将上述的大菱鲆养殖用益生菌应用于大菱鲆养殖用饲料，可以通过日常饲喂起到防治杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌等引起的细菌病，使用该饲料饲喂大菱鲆，可在保证大菱鲆健康成长前提下，在养殖全周期过程中减少或避免抗生素的使用，从而解决大菱鲆养殖中抗生素残留以及环境污染的问题。

实施例1菌株筛选与鉴定

为了获得对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌具有抑制效果的益生菌菌株，本发明自日本纳豆和大菱鲆肠道中分离出了多种菌种，并通过抑菌实验，筛选出了具有优异抑菌效果的大菱鲆养殖用益生菌，该益生菌分离筛选自日本纳豆，可采用如下筛选方法取得：

1)分离：将日本纳豆搅散后取菌丝、大菱鲆肠道剪碎后取碎块，分别加入生理盐水中混匀。取混匀后上清液80℃水浴加热10min。各取水浴后的样品100μl，分别涂布于lb固体培养基和mrs固体培养基平板中；在恒温培养箱37℃下培养12h；

2)纯化：从培养后平板中分别挑取不同的单菌落于lb固体培养基和mrs固体培养基平板上划线，纯化培养12h，重复三次；

3)富集：将纯化培养后的菌株分别于lb液体培养基和mrs液体培养基中富集培养，通过上述分离步骤自日本纳豆中分离出三个菌株，分别暂时命名为nd2、nd7、nd11，自山东地区养殖场的大菱鲆肠道内分离出八个菌株，分别暂时命名为gm1、gm2、gm3、gl1、gl2、gl3、gl4、gl5：

4)抑菌实验：对分离步骤筛选出的11个菌株进行抑菌测试，实验所用金黄色葡萄球菌(bncc354037)和大肠杆菌(bncc118966)购自北京北纳创联生物技术研究院；所用杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌为实验室分离所得，分离方法简述为：

(a)分离：取山东地区大菱鲆养殖场的患病大菱鲆病灶处及肠道，剪碎后分别加入生理盐水中混匀。取混匀后上清液80℃水浴加热10min。取水浴后的样品100μl涂布于lb固体培养基平板中。在恒温培养箱37℃下培养12h；

(b)纯化：从培养后平板中分别挑取不同的单菌落于lb固体培养基平板上划线，纯化培养12h，重复三次；

(c)富集：将纯化培养后的菌株分别于lb液体培养基中富集培养；

(d)鉴定：对所得菌株dna序列pcr扩增后进行16srrna鉴定，鉴定结果表明，通过上述分离步骤自大菱鲆皮肤疖点病灶处分离出的菌株为杀鲑气单胞菌，自大菱鲆肠道中分离出的菌株为大菱鲆弧菌，所得两种菌株作为抑菌实验用菌株。

抑菌实验采用滤纸片法，其检测方法可简述为分别将四种病原菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、杀鲑气单胞菌、大菱鲆弧菌)涂布于lb固体培养基平板上，每种病原菌涂布11个lb固体培养基平板对应步骤3)筛选的11个菌种的抑菌实验；步骤3)筛选所得的11个菌株分别加入液体培养基分别制成活菌含量1×10⁹cfu/ml的益生菌菌液，每种益生菌菌液分别浸泡20张滤纸片，单种益生菌菌液浸泡过的滤纸分别取5张均匀的摆放在四种病原菌的lb固体培养基平板上制成样品，并做好标记。所得样品37℃的恒温培养12h，观察抑菌圈，实验结果如表1所示，发明人筛选出了一株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌都具有较好抑菌效果，尤其是对大菱鲆细菌病的主要致病病原菌杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌具有优异抑菌效果的菌种nd2，从实验结果可以看出，与其他各菌种相比，nd2具有明显优异于其他菌种的更显著的抑菌效果，故筛选nd2作为大菱鲆养殖用益生菌；

5)鉴定：对菌株nd2的dna序列pcr扩增后进行16srrna鉴定，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌属。

由实施例1方法筛选鉴定所得大菱鲆养殖用益生菌菌株命名为纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)，该菌株于2020年06月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2020184。

表1.实施例1分离的单株菌株抑菌实验结果

注：-：无活性；+：抑菌圈直径＜10mm；++：抑菌圈直径10～15mm；+++：抑菌圈直径＞15mm。

具体的，所述益生菌组分的原料组分还包括凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulan)bncc136363，所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulan)bncc136363购自北京北纳创联生物技术研究院，所述纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)与所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulan)bncc136363的活菌数量比为1∶2。发明人发现，通过上述益生菌复配使用方式，可显著提高益生菌对大菱鲆致病病原菌的抑菌效果。

具体的，所述a组分饲料的活菌数量大于或等于10⁷cfu/kg(a组分饲料的活菌数量为用平板涂布方法检测测得的单位质量的a组分饲料中所含的益生菌组分的活菌数量)。将上述复配的益生菌应用于大菱鲆饲料，可提高含该益生菌组分的饲料对大菱鲆细菌病的防治效果。

实施例2复合益生菌抑菌实验

本实施例对所述纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)与所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulan)bncc136363的活菌数量比对抑菌效果的影响进行了测试，抑菌测试方法与实施例1的抑菌实验类似，抑菌实验用于浸泡滤纸片的益生菌液的活菌含量与实施例1相同，滤纸浸泡时间也与实施例1相同，测试结果如表2所示。

表2.实施例2的复合益生菌抑菌实验结果

注：-：无活性；+：抑菌圈直径＜10mm；++：抑菌圈直径10～15mm；+++：抑菌圈直径＞15mm。

从表2展示的实验结果可以看出，所述纳豆芽孢杆菌nd2(baci/lusnattond2)与所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulan)bncc136363以特定活菌数量比例1∶2复配时能够提高对大菱鲆弧菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果。因此，按该比例将纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)与凝结芽孢杆菌(baci//uscoagu/an)bncc136363同时应用于饲料中，可显著提高益生菌对大菱鲆致病病原菌的抑菌效果，从而提高含该益生菌组分的饲料对大菱鲆细菌病的防治效果。

具体的，所述的大菱鲆养殖用饲料还包括b组分饲料，所述b组分饲料的原料组分包括中草药提取物组分，所述中草药提取物组分包括牛至精油、黄芪多糖和黄酮。牛至精油、黄芪多糖和黄酮具有一定抑菌效果，将a组分饲料和b组分饲料联用可以提高抑菌效果，从而提高饲料对大菱鲆细菌病的防治效果。

具体的，所述牛至精油提取自牛至，所述牛至精油在b组分饲料中的含量为1ml/kg；所述黄芪多糖和黄酮分别采用水蒸汽蒸馏法提取自黄芪和甘草，所述黄芪多糖和黄酮质量比为1.5∶1，所述黄芪多糖和黄酮在b组分饲料中的总含量为0.7wt％-0.9wt％。

具体的，采用上述包含a组分饲料和b组分饲料的大菱鲆养殖用饲料进行大菱鲆饲喂的大菱鲆无抗化养殖方法，其饲喂喂养步骤包括多个饲喂周期，一个所述饲喂周期中，采用所述a组分饲料饲喂10-12天，停喂所述a组分饲料3-4天，再采用所述b组分饲料饲喂5-7天，停喂所述b组分饲料3-4天，停喂所述a组分饲料或所述b组分饲料时可以用常规饲料饲喂大菱鲆；一个所述饲喂周期结束后再重复进行下一个所述饲喂周期。

具体的，一个所述饲喂周期中，采用所述a组分饲料饲喂12天，停喂所述a组分饲料4天，再采用所述b组分饲料饲喂7天，停喂所述b组分饲料4天。

实施例3饲喂方式实验

本实施例对单独饲喂a组分饲料的益生菌组(b)、单独饲喂b组分饲料的中草药组(0)和采用上述a组分饲料和b组分饲料按饲喂周期交替投喂的交替饲喂组(m组)对大菱鲆生长和免疫效果进行了实验研究。

该实验中，m组的一个所述饲喂周期中，采用所述a组分饲料饲喂12天，停喂所述a组分饲料4天，再采用所述b组分饲料饲喂7天，停喂所述b组分饲料4天。

该实验的空白对照组以升索牌大菱鲆专用饲料作为投喂饲料；a组分饲料由益生菌组分和所述升索牌大菱鲆专用饲料组成，所述益生菌组分由所述纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnattond2)和所述凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulan)bncc136363组成，二者的活菌数量比为1∶2；所述a组分饲料的活菌数量等于10⁷cfu/kg；b组分饲料由升索牌大菱鲆专用饲料、牛至精油、黄芪多糖和黄酮组成，所述牛至精油在b组分饲料中的含量为1ml/kg；所述黄芪多糖和黄酮质量比为1.5∶1，所述黄芪多糖和黄酮在b组分饲料中的总含量为0.8wt％；

实验过程可简述为：在山东地区养殖基地的大菱鲆养殖车间进行该实验，养殖系统为流水养殖，单个养殖池长×宽×高分别为5m×5m×1m，养殖水体11.25m³。养殖水体初始平均温度15℃，盐度29，ph为7.8，大菱鲆鱼苗平均初始体重85g，养殖密度约100条/m³。试验采用四个养殖池，分别按益生菌组(p组)、中草药组(0组)、交替饲喂组(m组)和空白对照组(ck组)的投喂方式进行饲喂，每日饲料投喂量为鱼体重的2wt％，实验周期为30天，每十日对鱼苗平均体重进行测试以分析大菱鲆生长，测试结果如图1所示。30天实验完成后对大菱鲆的鱼肉营养成分、氨基酸组成和脂肪酸含量进行测试，水分测定按照国标gb5009.3-2016方法，粗蛋白测定按照国标gb/t6432-2018方法，粗脂肪测定按照国标gb5009.6-2016方法，灰分测定按照国标gb5009.4-2016方法，氨基酸测定按照国标gb5009.124-2016方法，脂肪酸测定按照国标gb5009.168-2016方法。测试结果分别如表3、表4和表5所示。

表3大菱鲆常规营养成分(％)

表4大菱鲆氨基酸组成(％)

表5大菱鲆脂肪酸含量(％)

从图1的实验结果可以看出，益生菌组(p组)、中草药组(0组)、交替饲喂组(m组)大菱鲆的生长速率明显高于空白对照组(ck组)。其中，交替饲喂组(m组)生长速率最快，益生菌组(p组)次之，即本实施例的益生菌应用于饲料不仅可以起到防治大菱鲆细菌病的作用，还能够促进大菱鲆生长，采用本实施例的饲喂方式(m组)也能够促进大菱鲆生长。

鱼类的营养价值主要取决于肌肉中蛋白质和脂肪含量。一般认为，鱼肉水分含量高，则蛋白质、脂肪含量将会减少，鱼肉品质就差；反之，鱼肉水分含量低，则蛋白质、脂肪含量就高，鱼就肥嫩好吃，鱼肉品质就好。除蛋白质和脂肪外，其所含氨基酸与脂肪酸的种类、含量以及比例也是鱼肉品质的重要评判标准，大菱鲆中富含人体必需氨基酸。饱和脂肪酸过多摄入可能导致血液中血脂、总胆固醇以及低密度脂蛋白浓度升高，而不饱和脂肪酸则可以软化血管、调节血脂、清理血栓，减少心血管疾病的发生，特别是其中的亚油酸、epa和dha等不饱和脂肪酸能降低血液中对人体有害的胆固醇和甘油三脂，抑制癌细胞的生长。因此，脂肪酸的营养价值由不饱和脂肪酸的含量和组成决定。人体不能合成亚油酸和亚麻酸，必须从膳食中补充。

从表3-5的实验结果可以看出，交替饲喂组(m组)鱼体必需氨基酸及氨基酸总量都显著高于其他各组，鱼体粗蛋白、粗脂肪含量高于其他各组。m组中dha和epa含量都显著高于其他组，因此，采用本实施例的饲料和饲喂方式(m组)饲养大菱鲆能使其产生优质脂肪酸，提高营养价值。

同时，在本实施例的整个实验过程中，三个实验组(m组、p组、0组)均未出现鱼苗死亡情况，但空白对照组(ck组)的大菱鲆出现了杀鲑气单胞菌感染，后期还有个体出现肠炎和寄生虫感染，空白对照组(ck组)死亡率达到30％～50％。

具体的，所述a组分饲料和b组分饲料均包括营养成分，所述营养成分的组分及其重量份数包括：粗蛋白40份，粗脂肪28份，粗灰分10份，粗纤维3份、总磷1.5份，份钙1.5份，所述营养成分还包括微量元素，所述微量元素包括cu、mn、zn、l，所述微量元素在所述饲料中的总含量为6mg/kg。

实施例4养殖方法实验

本实施例的所述大菱鲆无抗化养殖方法还包括病原菌检测步骤，所述大菱鲆无抗化养殖方法包括以下步骤：

病原菌检测：在养殖区的患病大菱鲆中取样，对样本所含细菌进行检测，以确定致病的病原菌，所述病原菌检测包括对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的检测，以确定病原菌包括杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌；

疫苗制备：从养殖区的患病大菱鲆体内分离出杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌，通过人工感染试验筛选出对健康大菱鲆具有较强毒性的杀鲑气单胞菌菌株和大菱鲆弧菌菌株；对所得杀鲑气单胞菌菌株和大菱鲆弧菌菌株分别进行繁殖培养后，将两种菌液分别进行离心，离心速度为3500r/min，离心所得沉淀物经反复清洗后，用pbs缓冲液分别稀释为活菌含量1×10⁹cfu/ml的杀鲑气单胞菌菌液和大菱鲆弧菌菌株菌液；分别在所得的两种菌液中添加0.2％的甲醛溶液，28℃下灭活24h，得杀鲑气单胞菌灭活菌液和大菱鲆弧菌菌株灭活菌液，取杀鲑气单胞菌灭活菌液和大菱鲆弧菌菌株灭活菌液各100l，分别接种在tsb固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中，放置24h后进行观察，培养皿中无菌落长出，所得杀鲑气单胞菌灭活菌液和大菱鲆弧菌菌株灭活菌液即可作为杀鲑气单胞菌灭活疫苗和大菱鲆弧菌菌株灭活疫苗；

疫苗接种：所得杀鲑气单胞菌灭活疫苗和大菱鲆弧菌菌株灭活疫苗按体积比1∶1的混合液后，加入与所述混合液等体积的弗氏佐剂得注射疫苗，对养殖区内的健康大菱鲆经腹部注射0.1ml注射疫苗即完成免疫接种，将免疫接种后的大菱鲆放回养殖池中；

饲料饲养：所述饲料饲养步骤的每日饲料投喂量为鱼体重的2wt％-5wt％，饲养环境的水温为14℃～19℃，盐度29-32，ph为7.8-8.2。

具体的，所述病原菌检测步骤可采用任意现有测试方法进行，如免疫学方法、pcr检测方法和/或lamp检测方法等，本领域已有针对副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌等病原菌的单一lamp检测方法的报道，对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的传统检测方法包括免疫学方法和pcr检测方法等。对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌优选采用双重lamp方法，该检测方法与中国专利cn201510452542.7公开的一种大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的双重lamp检测方法类似，其检测方法可简述为：将患病鱼组织用pbs进行匀浆煮沸并进行10倍梯度稀释，将稀释液进行等温扩增，扩增完成后向反应管中分别加入1μlsybrgreenl(1∶10)(购自北京索莱宝科技有限公司)，观察反应管中的颜色变化。阳性结果变为绿色，阴性结果颜色无变化，可以通过肉眼直接观察。

采用双重lamp方法比普通pcr检测方法灵敏度高出2到3个数量级，检测引物具有较高的灵敏性，可以用于样本中痕量细菌的检测。

具体的，所述疫苗制备过程从山东地区养殖厂的患病大菱鲆体内分离出杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌。

具体的，所述疫苗接种步骤后，将免疫接种后的大菱鲆放回养殖池中正常饲养28天后采血进行免疫血清凝集效价测定，结果均可诱导大菱鲆血清产生较高的凝集抗体效价。

养殖方法实验：

2019年4月1日，在山东地区养殖基地的大菱鲆养殖车间开展无抗化养殖技术研究。养殖系统为流水养殖，单个养殖池长×宽×高分别为5m×5m×1m，养殖水体11.25m³。养殖水体初始平均温度15℃，盐度29，ph为7.8，大菱鲆鱼苗平均初始体重85g，养殖密度约100条/m³。

试验设置三个养殖池分别采用本实施例的大菱鲆无抗化养殖方法的无抗养殖组(p’组)、采用抗生素防治疾病的抗生素组(ke’组)和对照组(ck’组)进行大菱鲆养殖实验。其中：

p’组每日饲料投喂量为鱼体重的2wt％，p’组的饲料中，a组分饲料由益生菌组分和所述升索牌大菱鲆专用饲料组成，所述益生菌组分由所述纳豆芽孢杆菌nd2(baci//usnattond2)和所述凝结芽孢杆菌(baci//uscoagu/an)bncc136363组成，二者的活菌数量比为1∶2；所述a组分饲料的活菌数量等于10⁷cfu/kg；b组分饲料由升索牌大菱鲆专用饲料、牛至精油、黄芪多糖和黄酮组成，所述牛至精油在b组分饲料中的含量为1ml/kg；所述黄芪多糖和黄酮质量比为1.5∶1，所述黄芪多糖和黄酮在b组分饲料中的总含量为0.8wt％；

ke’组不进行疫苗接种，也不采用本申请的大菱鲆养殖用饲料，饲料投喂量与p’组相同，采用的抗生素为恩诺沙星进行疾病防治，以升索牌大菱鲆专用饲料饲喂鱼苗，抗生素使用方法为每1kg体重鱼苗每日使用200mg恩诺沙星；

ck’组不采用任何疾病防治手段，仅以升索牌大菱鲆专用饲料饲喂鱼苗，饲料投喂量与p’组相同。

本实验的实验周期为3个月，定期取样分析大菱鲆生长(体重测试结果如图2所示)、抗生素残留，取养殖池水样测氨氮、硝态氮、亚硝态氮、总氮等含量，测定养殖系统n的收支。氨氮测定按照国标hj535-2009纳氏试剂法，硝态氮测定按照锌-镉还原法，亚硝态氮测定按照重氮-偶氮光度法，总氮测定按照国标gb/t11894-1989方法。抗生素残留测定按照国标gb/t20444-2006方法。

本实施例的实验结果如下：

(1)肠道形态：实验中使用抗生素组大菱鲆肠道受到不同程度损坏，肠道褶皱出现断裂，本方法养殖的大菱鲆肠道壁明显增厚，肠道内褶皱增多；

(2)体重：一月后对照组大菱鲆平均体重约为174g/尾，抗生素组平均体重约为180g/尾，无抗养殖组大菱鲆平均体重约为210g/尾，即本方法养殖的大菱鲆的生长速度提升约30％，产量提升约35％；

(3)发病情况：本方法养殖的大菱鲆存活率达到100％，5月后，进入夏季发病高峰期，利用双重lamp进行致病菌检测，无抗养殖组未检测到杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌致病菌感染；对照组出现病鱼，体表出现红色凸起，经取样检测为杀鲑气单胞菌感染，对照组发病高达80％以上，而无抗养殖组发病率为0；对照组后期出现大菱鲆弧菌引起的肠炎，该疾病为传染性疾病，发病率100％，患病大菱鲆的死亡率100％，但无抗养殖组未出现感染和死亡；

(4)水质情况：无抗养殖组的养殖池水体中氨氮含量相对于对照组降低20％-30％；

(5)无抗养殖组的大菱鲆品质明显高于对照组，表现为粗蛋白含量、脂肪含量、脂肪酸含量明显高于对照组，肉质更加细嫩。

以上所述，仅是本发明的实施例证而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明的技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>大菱鲆养殖用益生菌、饲料及无抗化养殖方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>873

<212>dna

<213>纳豆芽孢杆菌nd2(bacillusnatto)

<400>1

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<213>杀鲑气单胞菌(aeromonassalmonides)

<400>2

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<210>3

<211>871

<212>dna

<213>大菱鲆弧菌(vibrioscophthalmi)

<400>3

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