皮肤增生性瘢痕动物模型及其构建方法与流程

[0001]
本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及皮肤增生性瘢痕动物模型及其构建方法。


背景技术：

[0002]
正常皮肤受到各种创伤后，会快速产生修复，其修复的结果，按照最终形式分为皮肤再生和皮肤瘢痕。其中，瘢痕又被细分为正常瘢痕和病理性瘢痕。病理性瘢痕多数是由于组织在修复过程中胶原蛋白的合成代谢与降解代谢失衡导致。病理性瘢痕根据解剖形态的不同，可进一步分为增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、萎缩性瘢痕和瘢痕癌，其中增生性瘢痕为临床最常见类型。各种类型的瘢痕从不同程度影响皮肤的外观和正常功能，对患者造成极大的生理或心理负担。长期以来，针对增生性瘢痕的发病机理研究并没有完全明确，通过手术或者非手术的治疗方法也未能完成，因此急需要建立相关疾病动物模型，加快增生性瘢痕的基础研究与治疗药物的发现。
[0003]
目前，增生性瘢痕动物模型主要以下几类：
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一、人源组织裸鼠移植模型：将人皮肤瘢痕组织去除上皮和皮下脂肪后，通过手术的方式移植到裸鼠背部皮下，移植后人瘢痕组织在裸鼠皮下能够存活并保持了原有的病理特征及瘢痕特点。但是此模型并不能完全模拟人类增生性瘢痕的生长和变化环境，对于研究瘢痕的病理过程有很大的局限。而且，移植后的瘢痕在裸鼠身体上，不是动物自身产生的，不同的体环境影响模型的应用。其次，移植后的组织成活一定时间后，出现萎缩吸收情况，与人身体上的持久存在增生有显著差别。再次，裸鼠是没有免疫力的，对于研究免疫与瘢痕相关性时无法提供准确的反馈。
[0005]
二、兔耳增生性瘢痕模型：兔耳腹侧创伤并去兔耳软骨愈合可以自发形成较稳定、持久的增生性瘢痕，69％的成功率。组织学染色，发现能够具备人增生性瘢痕的特点。但是，兔耳模型暴露了兔耳的软骨，使得创面的基底与人创面基底条件有差异，而且兔的软骨也穿增生。这些现象表明，兔耳增生性瘢痕和人的增生性瘢痕有很大不同。
[0006]
三、猪增性瘢痕模型：雌性杜洛克猪皮肤与人皮肤锥体结构类似，创面愈合过程中各类指标也与人增生性瘢痕有较高的相似度。但是猪的瘢痕模型在外观上未发红、隆起、而且猪深层皮肤愈合需要约三个月，建模时间长。另外，杜洛克猪的饲养和管理成本高，限制了此模型的广泛应用。
[0007]
四、药物诱导的小鼠增生性瘢痕模型：长期以来，博来霉素被用于建立肺纤维化、硬皮病等动物模型。使用balb/c小鼠，皮下植入含有博来霉素的微泵，可以诱导皮肤产生增生性瘢痕，具备人皮肤增生性瘢痕的特点。但是由于这样的皮肤并非属于发展而来，形成过程与人的皮肤增生性瘢痕相差甚远。另外，博来霉素停止给药后，瘢痕可能会消退，不利于长期观察。另一方面，进行大批量小鼠造模时，需要使用大量的微泵，成本相对较高。
[0008]
五、小鼠皮肤伤口牵张模型：在小鼠背部安装皮肤牵张器，对小鼠背部切割伤口愈合时，施加10天的机械张力，诱导产生增生性瘢痕。该模型一定程度上具备人皮肤增生性瘢
痕的特点。但是由于小鼠活动活跃，建模过程中牵张经常受损脱落，导致模型建立不稳定，影响实验研究的可重复性。


技术实现要素：

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本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了皮肤增生性瘢痕动物模型的构建方法、皮肤增生性瘢痕动物模型和筛选用于治疗皮肤增生性瘢痕药物的方法，利用该构建方法可以在小鼠皮肤上形成皮肤增生性瘢痕，且该瘢痕不易消退，便于长期观察，模型建立稳定性好，可重复性强，成本低，有助于增生性瘢痕的发病机理研究以及筛选与评价瘢痕治疗药物，应用前景好。
[0010]
在本发明的一个方面，本发明提出了一种皮肤增生性瘢痕动物模型的构建方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将小鼠腹部脱毛，间断性地皮下给予博来霉素溶液，其中，所述博来霉素溶液的浓度为0.2～0.8mg/ml。
[0011]
目前采用药物诱导的小鼠增生性瘢痕模型建立过程中，需要在皮下植入含有博来霉素的微泵，通过不间断地给药以形成瘢痕，但是，停止给药后，瘢痕容易消退，不利于长期观察，并且在植入微泵的手术也可能会带来皮肤损伤。
[0012]
本发明的发明人发现，通过控制博来霉素溶液的浓度为0.2～0.8mg/ml，采用间断性给药方式，即可形成增生性瘢痕，且该瘢痕不易消退，无需植入微泵以达到长期不间断给药，降低了模型建立成本。并且，模型建立稳定性好，可重复性强。该动物模型有助于增生性瘢痕的发病机理研究以及筛选与评价瘢痕治疗药物，应用前景好。
[0013]
根据本发明的实施例，上述皮肤增生性瘢痕动物模型的构建方法还可以具有下列附加技术特征：
[0014]
根据本发明的实施例，所述博来霉素溶液的给药量为每次80～120μl。当每次给予浓度为0.2～0.8mg/ml的博来霉素溶液80～120μl，可以有效地形成增生性瘢痕，且该瘢痕不易消退，构建模型成本低。
[0015]
根据本发明的实施例，所述间断性地皮下给予博来霉素溶液为每周2～4次，连续给药4～6周。每次给予0.2～0.8mg/ml的博来霉素溶液80～120μl，每周2～4次，连续给药4～6周，可以形成增生性瘢痕，且该瘢痕不易消退。
[0016]
根据本发明的实施例，所述小鼠为雄性。采用雄性小鼠构建模型，容易形成增生性瘢痕，且该瘢痕不易消退。
[0017]
根据本发明的实施例，所述小鼠为4～6周龄。采用4～6周龄小鼠构建模型，容易形成增生性瘢痕，且该瘢痕不易消退。
[0018]
根据本发明的实施例，将小鼠右腹部脱毛。脱毛方便给药，并且在右腹部容易形成增生性瘢痕，且该瘢痕不易消退。
[0019]
在本发明的又一方面，本发明提出了一种皮肤增生性瘢痕动物模型。根据本发明的实施例，所述皮肤增生性瘢痕动物模型是通过前面所述皮肤增生性瘢痕动物模型的构建方法所获得的。由此，根据本发明实施例的皮肤增生性瘢痕动物模型中形成的增生性瘢痕不易消退，有利于长期观察。该动物模型有助于增生性瘢痕的发病机理研究以及筛选与评价瘢痕治疗药物，应用前景好。
[0020]
在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选用于治疗皮肤增生性瘢痕药物的方
法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向前面所述皮肤增生性瘢痕动物模型给予候选药物，培养预设时间后，基于皮肤增生性瘢痕的变化，确定所述候选药物是否为目标药物。如前所述，本发明的皮肤增生性瘢痕动物模型中形成的增生性瘢痕不易消退，有利于长期观察。由此，在该动物模型上给予候选药物，培养一段时间后，观察瘢痕的变化，可以准确地确定候选药物是否为目标药物。例如，若瘢痕变小，则可以判断该候选药物为用于治疗皮肤增生性瘢痕的目标药物。
[0021]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
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本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
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图1显示了根据本发明一个实施例的正常小鼠及模型小鼠的he染色电镜图；
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图2显示了根据本发明一个实施例的正常小鼠及模型小鼠的masson染色电镜图；
[0025]
图3显示了根据本发明一个实施例的α-sma的mrna表达分析示意图；
[0026]
图4显示了根据本发明一个实施例的collagen-1的mrna表达分析示意图；
[0027]
图5显示了根据本发明一个实施例的collagen-3的mrna表达分析示意图。
具体实施方式
[0028]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0029]
实施例1
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选取健康的spf级雄性dba小鼠30只，4周龄，体质量(20
±
2)g，饲养于spf级动物房。在温度、湿度恒定的环境中，适应性饲养1周后开始给药。第一天，小鼠麻醉后右侧腹部脱毛，然后皮下注射0.5mg/ml博来霉素100μl。隔日注射，连续五周。期间连续观察皮肤瘢痕形成状况。到达时间后，收集注射部位皮肤。
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1、对每只小鼠的取样部位皮肤进行he及mason’s trichome染色，光镜下观察皮肤病理组织学变化。图1为he染色，图2为mason’s trichome染色。如图所示，正常小鼠皮肤组织结构完整，呈红染波纹状，胶原纤维较细，密集排列，纤维间和纤维周围可见部分成纤维下拨，无性细胞浸润；模型小鼠皮肤的表皮上层增厚明显、真皮层胶原沉积增加，胶原束增粗，排列不规则，脂肪层由结缔组织取代，可见大量艳星细胞浸润。
[0032]
2、对所有小鼠最终皮肤的瘢痕形成状况进行了统计。其中30只小鼠中，27只形成了增生性瘢痕病理形态，成功率为90％。
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3、采用rt-pcr方法，对正常小鼠皮肤和模型小鼠皮肤中α-sma、collagen-1、collagen-3的mrna表达水平进行了测定。如图3、图4、图5所示，模型小鼠皮肤的α-sma、collagen-1、collagen-3mrna表达明显高于正常小鼠皮肤。上述基因为增生性瘢痕的标志物，由此，实验结果表明采用本发明的模型可以获得增生性瘢痕。
[0034]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0035]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。