一种荷花组织培养的初代培养方法与流程

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本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，特别是涉及一种荷花组织 培养的初代培养方法


背景技术：

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荷花以其优美的姿态、丰富的花色深受我国人民喜爱，属我国的十大名花之 一，具有较高的观赏价值和经济价值。近年来，随着我国经济的持续快速发展， 人民生活水平不断提高，荷花碗莲、鲜切花产业日益兴盛，市场对荷花新品种的 需求量日益旺盛和多元化。
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传统荷花的育种方式是杂交育种，这种方式具有育种周期长工作量大、容易 发生生殖障碍引起胚胎败育等缺点。通过分子生物学技术结合组织培养技术的育 种方法，可以缩短育种年限，节约时间成本，是未来荷花育种发展的方向和趋势。
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另外，荷花的常规繁殖方式主要依赖种藕分生进行无性繁殖，这种繁殖方式 带来一系列问题，从淤泥里挖藕耗时耗力，同时长期的无性繁殖导致病毒的积累 和品种的退化。而茎尖组织培养的方法是尝试解决这一问题的有效途径， 不同消毒灭菌方式对莲茎尖诱导率也存在较大影响，不同的培养基类型对莲茎 尖诱导率也存在影响
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莲组培育苗困难，尤其以腋芽为外植体进行组织培养时，易发生外植体褐化、 污染率高、诱导率低、芽苗不生长、分生困难、生根不稳定等技术瓶颈，严重限 制了荷花分子育种方法的推广及应用,外植体的灭菌方式是困扰其组织培养困 难的技术瓶颈
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莲的组培再生体系建立极为困难，目前国内外有关莲通过愈伤组织实现再生培 养成功的报道尚鲜少见。利用莲顶芽或腋芽离体培养诱导再生的快繁技术，一直 是各研究机构的研发热点(李良俊，1998)。花莲作为观赏花卉，属莲的一大类， 在这方面的研究才刚刚起步。在花莲芽离体培养的前期研究中，由于莲地下茎长 期在泥土中生长，芽自身多带细菌，因此消毒极其困难，容易褐化，生理活性差， 花莲地下茎段芽离体组培效果不理想，最佳始芽的分化率仅为58.1％(李良俊， 1995)。确定事宜的消毒剂类型和消毒时间对于外植体灭菌尤为重要，在植物组 织培养中，升汞和次氯酸钠是目前比较常见的2种外植体消毒剂。大量的研究证 明，升汞作为一种重金属强消毒剂，在杀死外植体表面细菌的同时，通常也大大 降低了植株细胞的活性(李国树等2014)。次氯酸钠性质温和，但是单纯使用， 消毒效果不佳，污染率高；消毒液的混合使用可以有效的降低外植体的污染率(周 俊辉等2003),
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莲组培育苗困难，尤其以腋芽为外植体进行组织培养时，易发生外植体褐化、 污染率高、诱导率低、芽苗不生长、分生困难、生根不稳定等技术瓶颈，严重限 制了荷花分子育种方法的推广及应用。


技术实现要素：

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为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种一种荷花组织培养的初代 培
养方法。用以解决现有技术中外植体褐化、污染率高、诱导率低、芽苗不生长 等问题。
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本发明所采用的技术方案是：1、一种荷花组织培养的初代培养方法，包括如下 步骤：
[0010]
s1:挑选顶芽及腋芽完好无损的发育良好的藕根，用解剖刀片沿着顶芽 基部，连根部将顶芽切下,作为外植体；
[0011]
s2:将切取的外植体浸泡在0.09-0.16％洗洁精水里1-2h，之后用小毛刷 在洗洁精水里轻刷干净，然放置在流动的自来水下冲洗1-2h，再置于超净工 作台下，用无菌水冲洗5-8次；
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s3:对外植体进行浸泡消毒处理：采用75％酒精消毒1-3min后，再用0.1％ 次氯酸钠消毒10-20min，最后再在2％ppm中浸泡1-2h，再用无菌水冲洗5～6次， 用无菌滤纸去除表面多余水分；
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s4:利用解剖刀将顶芽叶鞘剥去，外植体长度约1cm，以直插式插入诱 导培养基上；
[0014]
s5:接种后放置在光照培养箱中进行培养，设置光照强度1000～4000lx， 每天光照12h，温度28℃。
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优选的，所述诱导培养基的成分为：ms培养基+30.0g/l蔗糖+0.4研究不 同细胞分裂素对顶芽诱导培养的影响，naa浓度0.1mg/l，kt浓度梯度为 3.0mg/l。
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优选的，所述s3中75％的酒精消毒1min,0.1％次氯酸钠消毒10min，2％ppm 中浸泡2h外植体消毒效果较佳。
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与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)可以有效降低荷花组织褐变率， 实现更高的成活率、生长速度和出芽数；
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(2)可以增加组培快繁体系的稳定性，节省人力物力。
附图说明
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图1为本发明实施例中外植体c型腋芽；
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图2为本发明实施例中外植体a型顶芽
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图3为本发明实施例中外植体b型顶芽。
具体实施方式
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下面结合实施例对本发明进一步说明。
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实施例：
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本实施例所述材料均来源于苏州市农科院望亭荷花基地，自育品种“荷 塘情深”。
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s1:春季4月，荷花地下根状茎开始萌动，在荷花翻盆后，挑选顶芽及腋 芽完好无损的发育良好的藕根，在自来水下将淤泥冲洗干净，带回实验室处 理，用解剖刀片沿着顶芽基部，连根部将顶芽切下,作为外植体。
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s2:将切取的外植体浸泡在0.09％洗洁精水里1h，之后用小毛刷在洗洁 精水里轻刷干净，然放置在流动的自来水下冲洗1h，再置于超净工作台下， 用无菌水冲洗5次；
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s3:对外植体进行浸泡消毒处理：采用75％酒精消毒1min后，再用0.1％ 次氯酸钠消毒10min，最后再在2％ppm中浸泡2h，再用无菌水冲洗5次，然后 用无菌滤纸去除表面多
余水分；
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s4:利用解剖刀将顶芽叶鞘剥去，外植体长度约1cm，以直插式插入诱 导培养基上；
[0029]
s5:接种后放置在光照培养箱中进行培养，设置光照强度1000～4000lx， 每天光照12h，温度28℃。
[0030]
优选的，所述诱导培养基的成分为：ms培养基+30.0g/l蔗糖+0.4研究不 同细胞分裂素对顶芽诱导培养的影响，naa浓度0.1mg/l，kt浓度梯度为 3.0mg/l。
[0031]
采用本发明的方案，通过以下对比数据进行如下2组实验
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表2.1不同灭菌方式的比较
[0033]
表2.1
[0034][0035]
结果分析：
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按照表1所设定的9种不同灭菌方法进行消毒和灭菌，培养30d后记录外植 体的消毒污染情况。从表中可以看出，不同的处理方法，顶芽污染率的差异显著。 0.1％次氯酸钠消毒5min，污染率最高达到98.9％a。随着次氯酸钠消毒时间的延 长，消毒时间10min的时候，污染率仅仅降低了2.23％，当时间延长至15min时， 污染率下降了15.57％；升汞消毒5min，污染率为93.7a，随着升汞消毒时间的 增加，从5min到15min，污染率仅仅下降了12.6％；当采用传统表面消毒剂结 合生物消毒剂(ppm)的方法时(方法7)，对比不用ppm浸泡的方式，污染率下 降了56.67％。当使用浓度更高的ppm浸泡，2％的ppm浸泡1h，污染率是31.3％d， 2％的ppm浸泡2h，污染率下降到27.77％d。因此，莲外植体消毒，效果最好的消 毒方式是先用75％酒精消毒1min后，再用0.1％次氯酸钠处理10min，最后再在 2％ppm中浸泡2h。
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2、不同外植体的污染、存活死亡对比
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根据不同的解剖方式，将外植体分为a型、b型及c型，其中：a型顶芽为将顶 芽外面包裹的叶鞘及几层未展开叶芽全部除掉，只剩下顶芽生长锥，外植体长度 约1cm左右，；b型顶芽为只剥去顶芽外层叶鞘，保留顶芽生长锥和未展开叶芽， 长度约1～2cm左右；c型腋芽
为：仅仅除去顶芽外部包裹的一层叶鞘，外植体 约1～2cm左右。之后按照如表2.21-2.23设定的实验方法进行消毒及杀菌，定 期观察外植体污染及存活情况并进行记录，培养30d后外植体消毒实验结果如下 表2.2.1所示。
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表2.21：不同外植体类型污染情况比较
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如表2.2.1所示，0.1％次氯酸钠消毒5min时，不同类型外植体污染率差异 不显著，但是随着消毒时间的延长，不同类型的外植体污染情况差异显著，a类 型外植体污染率最低，b类型外植体污染率次之，c类型外植体污染率最高。
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在成活率的统计中(如下表2.2.2所示)，
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表2.2.2不同外植体类型成活率比较
[0044][0045]
0.1％次氯酸钠消毒5min时，不同类型的外植体存活率均为0；消毒时间10min 时，不同类型的外植体存活率差异不显著；消毒时间15min时，差异显著，a类 型外植体存活率最低，b类型外植体次之，c类型外植体最高。
[0046]
在死亡率的比较中(如下表2.2.3)，
[0047]
表2.2.3不同外植体类型死亡情况比较
[0048][0049]
0.1％次氯酸钠消毒5min时，不同类型的外植体死亡率差异不显著；消毒时 间延长至10min、15min、20min时，不同类型外植体差异显著，c类型外植体死 亡率最低，b类型外植体次之，a类型外植体死亡率最高。
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1.不同诱导培养基配方对比
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将大小一致的b型外植体芽接种至含有不同细胞分裂素的诱导培养基上进行 初代培养，根据外植体生长的情况，对诱导率、外植体芽生长状况等生长指 标进行统计。
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结果(表2.3)所示，添加不同浓度的6-ba和kt，外植体的诱导效果差异显 著。对比ck，添加一定浓度的6-ba和kt后，均能在一定程度上缩短芽的萌 发期限，提高诱导率。随着6-ba和kt浓度的增加，芽的萌发天数明显变短， 诱导率提高，芽的长度变短。a1-a4,诱导率差异显著，a4的诱导率达到84.43％， 萌动天数也最短，但是后期芽苗生长势较弱，褐化严重。a3的诱导率同样可 以达到83.33％，但是同时伴随有褐化问题。添加kt的培养基，从b1-b4，诱 导率明显提高，芽的萌发速度也变的更快。b4的诱导率最高，但是芽后期生 长势弱，b3的诱导率对比b4降低8.9％，芽萌发也较早、芽的生长很健壮。 b1、b2的芽诱导率均不高、萌发速度也较慢。在6-ba和kt的对比试验中， 可以发现，kt比6-ba比较不会出现褐化问题。因此，综合考虑诱导率和芽 的生长情况，比较适合芽初代诱导培养的培养基配方是b3，kt浓度为3.0 mg/l。
[0053]
表2.3：不同细胞分裂素浓度对外植体诱导的影响
[0054][0055][0056]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限 制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术 人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者 对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相 应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。