与辣椒花药黄色基因紧密连锁的分子标记gssr114及其应用

与辣椒花药黄色基因紧密连锁的分子标记gssr114及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种与辣椒花药黄色基因紧密连锁的分子标记GSSR114及其应用。本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有“花药黄色”这一性状的引物对，为能够扩增得到如下DNA片段的引物对：是以辣椒基因组DNA为模板，采用序列1和序列2所示引物对进行PCR扩增所得的DNA片段，具体为由序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对。本发明选取市场现有的优良品种的辣椒材料，进行杂交、单倍体培育并加倍，之后进行花药颜色筛选鉴定，获知花药黄色由单隐性基因控制，且进一步研究发现该单隐性基因与SSR标记GSSR114紧密连锁，GSSR114于辣椒开花前就预测出花药是否为黄色，可用于辣椒育种。CGMCC No. 1254820160601
【专利说明】
与辣楓花药黄色基因紧密连锁的分子标巧GSSR114及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，设及一种与辣椒花药黄色基因紧密连锁的分子标记 GSSRl 14及其应用。
【背景技术】
[0002] 辣椒(Capicum annuum L.)是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物。辣椒杂种优 势明显，利用杂种优势可有效解决辣椒市场需求。目前辣椒市场上主要应用的是Fi代杂交 种。而种子纯度的高低直接影响一代杂交种的产量及产品质量。在辣椒杂交制种过程中，母 本自交种子的产生会显著降低杂交种的纯度。在利用辣椒雄性不育两用系制种过程中，若 不能完全拔出50%的可育株，同样会大大降低杂交种子的质量。而且不育系本身育性易受 环境条件影响而使不育性不稳定，导致自交结实而影响制种纯度。
[0003] 隐性标记性状的利用可有效解决上述问题。将易于识别的隐性标记性状转育给辣 椒母本和辣椒雄性不育系，通过目测及标记性状连锁标记分析进行选择，可有效解决常规 辣椒杂种鉴定方法繁琐、耗时、费财，及辣椒雄性不育系、保持系的选育周期较长、费力等问 题。
[0004] 辣椒花药的颜色有多种，有黄色、绿色、紫色和粉色等等。然而至今还没有辣椒花 药颜色遗传分析和基因定位的相关研究报道。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种与辣椒花药黄色基因紧密连锁的分子标记GSSR114及其 应用。
[0006] 本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有"花药黄色"运一性状的引 物对。
[0007] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有"花药黄色"运一性状的 引物对可为能扩增得到如下DNA片段的引物对:所述DNA片段是W辣椒基因组DNA为模板，采 用序列表中序列1和序列2所示引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。
[000引进一步，所述引物对具体可为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成 的引物对。
[0009] 所述引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。制备所述引物对的方法，具体 可包括将所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
[0010] 含有所述引物对和如下中的至少一种的用于鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有 "花药黄色"运一性状的试剂盒也属于本发明的保护范围：dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲 液。
[0011] 本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有"花药黄色"运一性状的 方法。
[0012] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有"花药黄色"运一性状的方法， 具体可包括如下步骤：
[OOK] (a似待测辣椒的基因组DNA为模板，采用所述引物对(如序列1和序列2)进行PCR 扩增，得到PCR产物；
[0014] (b)将步骤(a)所得PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳结果按照如下确定所述待测 辣椒是否具有"花药黄色"运一性状:若将步骤(a)所得PCR产物进行凝胶电泳所得带型与标 准带型一致，则所述待测辣椒具有或者候选具有"花药黄色"运一性状;若将步骤(a)所得 PCR产物进行凝胶电泳所得带型与所述标准带型不一致，则所述待测辣椒不具有或者候选 不具有"花药黄色"运一性状;所述标准带型为W具有"花药黄色"运一性状的辣椒(如辣椒 材料DHl21)的基因组DNA为模板，W所述引物对(如序列1和序列2)进行PCR扩增，并将扩增 产物进行凝胶电泳所得的带型。
[0015] 将步骤(a)所得PCR产物进行凝胶电泳时采用的凝胶电泳条件与获得所述标准带 型时采用的凝胶电泳条件应该保持一致。
[0016] 在所述方法中，所述待测辣椒可为任意品种的辣椒。在本发明的一个实施例中，所 述待测辣椒具体选自辣椒材料DH12U花药黄色）、辣椒自交系12-Z65(花药紫色），W及运两 者的杂交或回交后代。
[0017] 本发明还提供了一种培育具有"花药黄色"运一性状的辣椒品种的方法。
[0018] 本发明所提供的培育具有"花药黄色"运一性状的辣椒品种的方法，具体可包括选 取符合如下条件的辣椒品种作为亲本进行育种的步骤：W基因组DNA为模板，采用所述引物 对(如序列1和序列2)进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳，电泳条带的带型与标准带型 相同；所述标准带型为W具有"花药黄色"运一性状的辣椒(如辣椒材料DH121)的基因组DNA 为模板，W所述引物对(如序列1和序列2)进行PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳所得的 带型。
[0019] 将所述亲本的PCR产物进行凝胶电泳时采用的凝胶电泳条件与获得所述标准带型 时采用的凝胶电泳条件应该保持一致。
[0020] 在上述两种方法中，进行所述PCR扩增时采用的退火溫度可为55°C。
[00別]进一步，所述PCR扩增的反应条件具体为：94°C预变性4min;94°C变性15s，55°C退 火 15s，72°C 延伸 30s，：34 个循环；72°C 保溫 5min。
[0022] 在上述两种方法中，所述电泳具体可为非变性聚丙締酷胺凝胶电泳，所述非变性 聚丙締酷胺凝胶中，所述聚丙締酷胺凝胶的浓度为6.0%(质量百分含量）。
[0023] 在本发明中，所述辣椒材料M1121具体是按照包括如下步骤的方法选育获得的：
[0024] (1)将四份用于杂交的辣椒品种两两进行杂交，得到两个单交杂种;再将两个所述 单交杂种进行杂交，得到双交杂种；
[0025] 所述四份用于杂交的辣椒品种为"己欧"、"玛丽莲"、"博收一号"和"博收二号"；
[0026] (2)将所述双交杂种进行单倍体培育，加倍后得到系列DH株系；
[0027] (3)从系列所述DH株系中选择花药为黄色的株系，即为所述辣椒材料DH121。
[0028] 在所述方法的步骤（1)中，所述"将四份用于杂交的辣椒品种两两进行杂交"为将 "己欧"与"博收一号"进行杂交，"玛丽莲"与"博收二号"进行杂交。
[0029] 在所述方法的步骤(2)中，所述系列DH株系可为:将所述双交杂种进行单倍体培育 所得的若干自然加倍的双单倍体，和/或将所述双交杂种进行单倍体培育所得的若干单倍 体进行人工染色体加倍后得到的若干人工加倍的双单倍体。
[0030] 在所述方法的步骤(2)中，所述进行的单倍体培育为花药培养。
[0031] 进一步，进行所述花药培养时的花药为取自于4°C低溫预处理1-3天(如2天）的花 蕾中的花药，其中的所述花蕾可为小抱子发育处于单核靠边期一双核早期的花蕾。
[0032] 进一步，进行所述花药培养时采用的培养基为N4-3培养基;所述N4-3培养基为固 液双层培养基（固体层在下，液体层在上）；固体层为在NTH基本培养基的基础上添加薦糖至 在所述固体层的质量百分比为3-6% (如3%)，添加活性炭至在所述固体层的质量百分比为 0.5%，添加琼脂粉至在所述固体层的质量百分比为0.8%，pH值调为5.8;液体层为在NTH基 本培养基的基础上添加薦糖至在所述液体层的质量百分比为3-6% (如6% )，添加IAA至在 所述液体层的浓度为0.5-1.5mg/L(如1. Omg/L)，添加6-BA至在所述液体层的浓度为0.1- 0.6mg/L(如0.6mg/L)，添加戊烘草胺至在所述液体层的浓度为0.1-0.5mg/L(如0.5mg/L)， pH值调为5.8。其中，所述NTH基本培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：硝酸氨825mg/L，硝 酸钟950mg/L，二水氯化巧166mg/L，屯水硫酸儀185mg/L，憐酸二氨钟680mg/L，棚酸6.20mg/ L，四水硫酸儘25mg/L，屯水硫酸锋lOmg/L，二水钢酸钢0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六 水氯化钻0.03mg/L，肌醇lOOmg/L，烟酸5mg/L，盐酸化唉醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘 氨酸2mg/L，叶酸5mg/L，生物素0.5mg/L。另外，培养时的接种密度为每60mm直径培养皿12- 18枚(如嫩)花药。
[0033] 进一步，进行所述花药培养时，所述花药先在28-35°C(如28°C)条件下黑暗培养1- 10天(如8天），再转移到25-28°C(如25°C)条件下黑暗培养4-8周（如8周），得到胚状体;将所 述胚状体转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗，得到再生株。
[0034] 在所述方法的步骤(3)中，从系列所述DH株系中选择花药为黄色的株系，是通过在 辣椒口椒始花期采用目测法观察已盛开花朵花药的颜色来完成选择的。
[0035] 在所述方法的步骤(3)中，所选的株系除了具有"花药黄色"运一性状外，最好同时 其他综合性状优良（如植株生长健壮、座果连续性好、抗病性好）。
[0036] 所述辣椒材料畑121所具有的"花药黄色"运一性状由单隐性基因控制。
[0037] 本发明还提供了一种与辣椒"花药黄色"运一性状相关的分子标记。
[0038] 本发明所提供的与辣椒"花药黄色"运一性状相关的分子标记，具体为W辣椒基因 组DNA为模板，采用所述引物对(如序列1和序列2)进行PCR扩增所得的DNA片段。
[0039] 所述引物对(如序列1和序列2)或所述试剂盒或所述分子标记在如下任一中的应 用也属于本发明的保护范围：
[0040] (1)鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有"花药黄色"运一性状；
[0041] (2)辣椒育种。
[0042] 本发明选取市场现有的优良品种的辣椒材料，进行杂交、单倍体培育并加倍，之后 进行花药颜色筛选鉴定，获知花药黄色由单隐性基因控制，且进一步研究发现该单隐性基 因与SS財示记GSSR114紧密连锁，GSSR114于辣椒开花前就预测出花药是否为黄色，可用于辣 椒育种。
[0043] 保藏说明
[0044] 建议分类命名:辣椒
[0045] 拉下名：Kapsi州m annuum)
[0046] 参据的生物材料：12-Z65
[0047] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、
[004引保藏机构简称:CGMCC
[0049] 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0050] 保藏日期:2016年6月旧
[0化1] 保藏中屯、登记入册编号：CGMCC No. 12548
【附图说明】
[0052] 图1为具有由单隐性基因控制的"花药黄色"运一性状的辣椒材料DH121的选育流 程图。
[0053] 图2为实施例1中花药培养步骤中得到的胚状体的照片。
[0054] 图3为实施例1中再生植株培养步骤中得到的再生株的照片。
[0055] 图4为实施例1中驯化移栽步骤中得到的植株的照片。
[0056] 图5为辣椒材料M1121的黄色花药(右)和12-Z65的紫色花药(左）图片。
[0057] 图6为实施例2中辣椒材料M1121花药黄色连锁分析示意图。
[005引图7为实施例3中与辣椒ayw基因紧密连锁的GSSR114分子标记的验证结果。泳道1- 8和10-64为96份WDH121与12-Z65为亲本构建的BCi株系中部分株系的验证结果。B所示的 是与父本12-Z65-致的带型，A所示的是与母本DH121-致的带型，H所示的是A和B的杂合带 型。
【具体实施方式】
[0059] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061] 辣椒品种"己欧"为上海种都种业科技有限公司产品。辣椒品种"玛丽莲"为先正达 生物科技中国有限公司产品。辣椒品种"博收一号"和"博收二号"为北京博收种子有限公司 产品。
[0062] 实施例1、具有由单隐性基因控制的"花药黄色"运一性状的辣椒材料DH121的选育 及鉴定
[0063] -、具有由单隐性基因控制的"花药黄色"运一性状的辣椒材料M1121的选育
[0064] 选育具有由单隐性基因控制的"花药黄色"运一性状的辣椒材料DH121的方法，如 图1所示。
[0065] (1)选取杂交材料：四份用于杂交的优良辣椒品种"己欧"、"玛丽莲"、"博收一号" 和"博收二号"。
[0066] (2)杂交:将吧欧"与"博收一号'进行杂交，得到单交杂种1;将"玛丽莲"与"博收 二号"进行杂交，得到单交杂种2。再将单交杂种1和单交杂种2杂交，得到双交杂种。
[0067] (3)单倍体培育并加倍:将所述双交杂种进行单倍体培育，得到若干自然加倍的双 单倍体(DH株系）和若干单倍体;从若干所述DH株系中选择花药为黄色(最好同时其他综合 农艺性状优良）的株系，即为具有由单隐性基因控制的"花药黄色"运一性状的辣椒材料 DH121。其中，所述DH株系除了为若干自然加倍的双单倍体外，也可W为对所述若干单倍体 进行人工染色体加倍后得到若干人工加倍的双单倍体。
[0068] ①选取花蕾:在上述双交杂种中，选择长势良好、无病虫害的植株作为供体植株， 严格按镜检结果选取小抱子发育处于单核靠边期一双核早期的花蕾。
[0069] ②花蕾预处理:4°C低溫预处理花蕾2天。
[0070] ③花蕾消毒：取合适大小的预处理后的花蕾，剥去花專后，先用75%的酒精浸泡 30s，再用8%的次氯酸钢振荡消毒15min，最后用无菌水清洗3次，每次5min，得到消毒后的 花蕾。
[0071] ④接种:取消毒后的花蕾，于超净工作台上将花药完好无损的剥离，W每60mm直径 培养皿12枚花药的密度接种于M-3培养基上。
[0072] 该M-3培养基为固液双层培养基（固体层在下，液体层在上），固体层为在NTH基本 培养基的基础上添加薦糖至在所述固体层的质量百分比为3%，添加活性炭至在所述固体 层的质量百分比为0.5%，添加琼脂粉至在所述固体层的质量百分比为0.8%，pH值调为 5.8;液体层为在NTH基本培养基的基础上添加薦糖至在所述液体层的质量百分比为6%，添 加 IAA至在所述液体层的浓度为1. Omg/L，添加 6-BA至在所述液体层的浓度为0.6mg/L，添加 戊烘草胺至在所述液体层的浓度为0.5mg/L，pH值调为5.8。
[0073] 其中，NTH基本培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：硝酸氨825mg/L，硝酸钟 950mg/L，二水氯化巧166mg/L，屯水硫酸儀185mg/L，憐酸二氨钟680mg/L，棚酸6.20mg/L，四 水硫酸儘25mg/L，屯水硫酸锋lOmg/L，二水钢酸钢0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯 化钻0.03mg/L，肌醇lOOmg/L，烟酸5mg/L，盐酸化唉醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸 2mg/L，叶酸5mg/L，生物素 0.5mg/L。
[0074] ⑤花药培养:花药先在28°C条件下黑暗培养8天，再转移到25°C条件下继续黑暗培 养;培养8周时间，即可看到大量胚状体发生，如图2所示。
[0075] ⑥再生株培养:选取子叶型胚状体，转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮 苗，得到再生株，如图3所示。
[0076] ⑦鉴定倍性:待再生株长至3-4片真叶，切取叶片，通过保卫细胞叶绿体计数法，从 细胞染色体的水平鉴定再生株的倍性。
[0077] ⑧驯化移栽:将鉴定为二倍体的上述再生株移栽至培养±中，进行驯化培养；其 中，该培养±由赔石和草炭按质量比1:1混合制成，并经过高压灭菌;培养条件为:光照时间 为16小时/天，强度为20001X光照，溫度为22-25°C;培养得到驯化后的二倍体再生株，即DH 株系(如图4所示）。
[0078] ⑨性状调查:在辣椒口椒始花期，采用目测法观察已盛开花朵花药的颜色，根据观 测结果，与Royal ^dicultural Society比色卡（北京东方诺贝科技发展有限公司产品） 上相应代码(如下1-6)的颜色进行比对，按照最大相似度原则，确定所观察的辣椒材料的花 药颜色。1:白（FAN4 155C);2:浅黄(FANl 6C);3:黄(FANl 12A);4:浅蓝(FAN2 110A);5:蓝 (FAN2 110A);6:紫(FAN2N89CD)。从系列所述DH株系中选择花药为黄色（对应比色卡上的 "3:黄(FANl 12Ar)、植株生长健壮、座果连续性好、抗病性好的优良株系），即为具有由单 隐性基因控制的"花药黄色"运一性状的辣椒材料M1121。
[0079] 二、具有由单隐性基因控制的"花药黄色"运一性状的辣椒材料M1121的鉴定
[0080] W经步骤一四亲杂交、单倍体培育选育出的其它综合性状优良、花药为黄色的辣 椒双单倍体材料D化21与花药为紫色的辣椒12-Z65CGMCC No. 12548为亲本（图5)，构建Pi、 P2、Fi、BCi、BC2、F2 六联合世代。
[0081 ] 2013年春季，于北京市农林科学院蔬菜研究中屯、农场将畑121(Pi)与12-Z65(P2)杂 交，得到Fi代种子，2013年冬季，于中屯、海南立亚农场，Fi代自交、并分别与DHm、12-Z65回 交，分别获得F2、BCi和BC2代的种子。
[0082] 2014年春季和秋季，将六个世代的种子播种，溫室内育苗。2014年春季Pi、P2、Fi、 BCi、BC2、F2六个世代的样本容量分别为：25、26、30、126、130、253。2014年秋季口1、口2、尸1、8。、 BC2、F2六个世代的样本容量分别为:21、25、24、84、86、243(表1)。
[0083] 在辣椒口椒始花期，采用目测法观察已盛开花朵花药的颜色。根据观测结果，与标 准卡上相应代码的颜色进行比对，按照最大相似度原则，确定种质的颜色。
[0084] 1:白（FAN4 155C);
[00化]2:浅黄(FANl 6C);
[0086] 3:黄(FANl 12A);
[0087] 4:浅蓝(FAN2 110A);
[008引 5:蓝(FAN2 110A);
[0089] 6:紫(FAN2N89CD)。
[0090] 2人同时调查W确保结果的准确性。花药为黄色的单株（即符合比色卡上"3:黄 (FANl 12A)"的单株），鉴定为花药黄色，其它尽管紫色深浅有差异，均统计为花药非黄色。 计算分离比，采用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析，SAS8.0对结果进行卡方 测验。
[0091] 综合两个季节的花药颜色鉴定结果，2014年春季，在Fi群体和BC2群体中，全部为非 黄色花药植株;在F2群体中，花药为非黄色的单株有184株，花药为黄色的单株有69株，非黄 色花药与黄色花药植株数量的分离比例经卡方检验符合3:1;在BCi群体中，花药为非黄色 的单株有65株，花药为黄色的单株有61株，非黄色花药与黄色花药植株数量的分离比例经 卡方检验符合1:1 (表1)。2014年秋季，在Fi群体和BC2群体中，全部为非黄色花药植株;在F2 群体中，花药为非黄色的单株有186株，花药为黄色的单株有57株，非黄色花药与黄色花药 植株数量的分离比例经卡方检验也符合3:1;在BCi群体中，花药为非黄色的单株有43株，花 药为黄色的单株有41株，非黄色花药与黄色花药植株数量的分离比例经卡方检验符合1:1 (表1)。由此可知，辣椒"花药黄色"运一性状由1对单隐性基因控制。
[0092] 表1 M1121X12-Z65后代群体CMV抗性分离情况统计
[0093]
[0094]
[00巧]实施例2、与ayw基因紧密连锁的SSR标记GSSR114的获得
[0096] -、实验方法
[0097] 采用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取实施例1中双亲、F2群体各单株基因组 DNA。首先，应用平均分布于辣椒12条染色体的1200对SSR引物(标为genSSR、GSSR、ZS、PSWP 2400对InDel引物(标为GI、CIDH)对辣椒双亲进行多态性筛选。然后，在F2群体中各选7个黄 色花药、紫色花药单株的DNA，构建黄色花药和非黄色花药基因池，利用上一步筛选出的多 态性引物对辣椒花药黄色与非黄色基因池DNA进行BSA分析，进一步筛选多态性引物。最后 利用上一步筛选出的多态性引物对F2群体各单株基因型进行分析，并利用化inMap 4.0软 件绘制连锁图。
[009引 SSR和InDel PCR标记反应体系10化:3化DNA(2.SngAiU，正向、反向引物巧OngAi L)各化L，扣L GoTaq泉.Green Master 111；[又。1'01116邑日，胖13。0]13；[]1,1]54)。口〔1?反应程序：94°[预 变性4min;94°C变性15s，55°C退火15s，72°C延伸303,34个循环;72°(：保溫5111111。扩增产物用 6.0 %非变性聚丙締酷胺凝胶，150V恒功率电泳分离Ih，银染显色后在胶片观察灯下进行带 型统计分析。
[0099] 共显性标记的统计方法:按照化inmap 4.0的要求母本DH121-致的带型记为A(花 药应为黄色），与父本12-Z65-致的带型记为B(花药应为紫色），杂合带型记为H(花药应为 紫色）。
[0100] 连锁图构建：先用Calculate命令计算相关参数，在Gro叫ings(tree)命令下，在 L0D>3.0的状态下进行连锁群分组，然后用Create Groups for Mapping命令作图，用Map 命令构建框架图，并进行图距的计算。
[0101] 二、结果
[0102] 应用平均分布于辣椒12条染色体的1200对SSR引物(标为genSSR、GSSR、ZS、PSWP 2400对InDel引物(标为GI、CIDH)对辣椒双亲进行多态性筛选，其中592对表现为多态，多态 率为16.44%。利用592对引物对辣椒花药黄色与非黄色基因池DNA进行BSA分析，筛选获得 46对多态性引物。用筛选出的46对多态性引物对秋季F2群体的243个单株进行分离分析。利 用JoinMap 4.0软件将其中的28个分子标记和ayw基因定位到了第11条染色体上化OD = 10)，距离ayw基因最近的分子标记为GSSR114,遗传距离为0.1 cM(图6)。
[0103] 用于扩增SSR标记GSSRl 14的引物对：
[0104] 上游引物:5'-TCTTAGCAAGAATGCCCCAG-3'（序列1);
[0105] 下游引物:5 ' -CGGTAACCCATGTCACGATT-3 '（序列2)。
[0106] 实施例3、与ayw基因紧密连锁的SSR标记GSSR114在鉴定辣椒花药颜色上的应用
[0107] -、实验材料
[0108] 从实施例1中W辣椒材料DH121与辣椒自交系12-Z65为亲本构建的BCi群体中随机 选取96个单株（表3)作为实验材料，对实施例2获得的与ayw基因紧密连锁的SSR标记 GSSRl 14进行验证，确定利用该标记筛选具有"花药黄色"运一性状的辣椒品种，用于分子标 记辅助育种(Marker assisted selection,MAS)的准确性。
[0109] 二、实验方法
[0110] 针对从实施例1中W辣椒材料DHl21与辣椒自交系12-Z65为亲本构建的BCi群体中 随机选取的96个单株(表3)，苗期单株挂牌标记取样后，提取其基因组DNA并W其为模板，用 实施例2获得的与ayw基因紧密连锁的SSR标记GSSR114的扩增引物(序列巧日序列2)进行PCR 扩增，检测并统计各单株的基因型。同时，在辣椒口椒始花期，采用目测法观察运96个单株 已盛开花朵花药的颜色并做记录(参见实施例1相关步骤进行）。
[0111] PCR反应体系（10化）：3化DNA( 2. SngAiL)，正向、反向引物（SOngAiL)各化L，化L GoTaq巧Green Master mix(Promega，Wisconsin,USA)。
[0112] PCR反应程序:94°C预变性4min;94°C变性15s，55°C退火15s，72°C延伸30s，34个循 环；72°C 保溫 5min。
[0113] 扩增产物用6.0%非变性聚丙締酷胺凝胶，150V恒功率电泳分离化，银染显色后在 胶片观察灯下进行带型统计分析。与母本D化21-致的带型记为A，与父本12-Z65-致的带 型记为B，杂合带型记为H。
[0114] 结果发现:针对分子标记GSSRl 14，96份BCi群体材料中仅有4份材料(QB31、QB60、 地81和QB82)带型与表型结果不相符，正确率高达95.8% (表3,图7)。该结果表明，采用分子 标记GSSR114可W在苗期就鉴定出待测辣椒是否为黄色花药，且鉴定结果准确率较高。
[0115] 表3利用96份WDH121与12-Z65为亲本构建的BCi株系对标记GSSR114进行准确性 验证(地群体为(畑121 X 12-Z65) XDH121)
【主权项】
1. 用于鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有"花药黄色"这一性状的引物对，为能够扩增 得到如下DNA片段的引物对:所述DNA片段是以辣椒基因组DNA为模板，采用序列表中序列1 和序列2所示引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。2. 根据权利要求1所述的引物对，其特征在于:所述引物对为由序列表中序列1和序列2 所示的两条单链DNA组成的引物对。3. 制备权利要求1或2所述的引物对的方法，包括将权利要求1或2所述两条单链DNA分 别单独包装的步骤。4. 用于鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有"花药黄色"这一性状的试剂盒，含有权利要 求1或2所述的引物对和如下中的至少一种:dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液。5. -种鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有"花药黄色"这一性状的方法，包括如下步 骤： (a) 以待测辣椒的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对进行PCR扩增，得 至IjPCR产物； (b) 将步骤(a)所得PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳结果按照如下确定所述待测辣椒 是否具有"花药黄色"这一性状:若将步骤( a)所得PCR产物进行凝胶电泳所得带型与标准带 型一致，则所述待测辣椒具有或者候选具有"花药黄色"这一性状;若将步骤(a)所得PCR产 物进行凝胶电泳所得带型与所述标准带型不一致，则所述待测辣椒不具有或者候选不具有 "花药黄色"这一性状； 所述标准带型为以具有"花药黄色"这一性状的辣椒的基因组DNA为模板，以所述引物 对进行PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳所得的带型。6. -种培育具有"花药黄色"这一性状的辣椒品种的方法，包括选取符合如下条件的辣 椒品种作为亲本进行育种的步骤:以基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对进 行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳，电泳条带的带型与标准带型相同； 所述标准带型为以具有"花药黄色"这一性状的辣椒的基因组DNA为模板，以所述引物 对进行PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳所得的带型。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增时采用的退火温度为55 cC。8. 根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于:获得所述标准带型时采用的所述 具有"花药黄色"这一性状的辣椒为辣椒材料DH121; 所述辣椒材料DH121是按照包括如下步骤的方法选育获得的： (1) 将四份用于杂交的辣椒品种两两进行杂交，得到两个单交杂种;再将两个所述单交 杂种进行杂交，得到双交杂种； 所述四份用于杂交的辣椒品种为"巴欧"、"玛丽莲"、"博收一号"和"博收二号"； (2) 将所述双交杂种进行单倍体培育，加倍后得到系列DH株系； (3) 从系列所述DH株系中选择花药为黄色的株系，即为所述辣椒材料DH121。9. 与辣椒"花药黄色"这一性状相关的分子标记，为以辣椒基因组DNA为模板，采用权利 要求1所述引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。10. 权利要求1或2所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒或权利要求9所述的分子标 记在如下任一中的应用： (1) 鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否具有"花药黄色"这一性状； (2) 辣椒育种。
【文档编号】C12N15/11GK105925725SQ201610556981
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】张晓芬, 耿三省, 陈斌, 杜和山
【申请人】北京市农林科学院