一种高效的粳稻花培方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效的粳稻花培方法，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 水稻花药培养是用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的水稻花药，通过无菌 操作技术，接种在人工培养基上，改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，并连续进行 有丝分裂，形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织一愈伤组织，进而分化成完整的水 稻植株的过程。
[0003] 水稻的体细胞(二倍体)具有24个染色体，性细胞(花粉细胞和卵细胞，单倍体)具 有12条染色体。由花粉长成的单倍体水稻植株只有一套染色体，即12条染色体，每一同源染 色体只有一个成员，因而每一等位基因也只有一个成员。水稻是自花授粉植物，在高度纯合 的情况下不发生退化现象，因此由单倍体加倍得到的纯合的二倍体水稻的生活力是旺盛 的，这保证了水稻单倍体可以培育出丰产的新品种。因此水稻花药培养育种具有缩短育种 周期，提高选择效率，加速有效性状转移等许多优点。
[0004] 1964年，印度德里大学的两位植物学家Guha和Maheshwari发现，他们培养的毛叶 曼陀罗花药中长出的胚状体是来源于花粉的单倍体植株。1968年，日本的新关Niizeki和大 野Oono通过花药培养得到了单倍体水稻植株，使水稻单倍体育种成为可能。我国也于1970 年以来开展了群众性的水稻花药培养和单倍体育种工作。许多科技工作者对花药培养中小 孢子发育成可育植株的许多影响因子进行了研究，随着研究的不断深入，花药培养技术逐 步完善，并应用于水稻遗传育种，现在水稻花药培养已经成为当今生物技术育种中较为成 熟、实用、有效的育种新技术。
[0005] 我国自1970年开始水稻花培研究以来，经历了启动、调整、发展三个阶段，在花培 方法、诱导手段、取材世代及群体规模等研究上不断完善、创新，与常规育种手段和杂交稻 育种手段相结合，已经育出了 40余个花培品种及恢复系、不育系等，如1975年首次育成的粳 稻品种单丰1号、中花系列、龙粳系列、京花系列、闽花系列、宁粳系列、早单7301、晚单7号、 合单76-085、合江21、浙粳66号、花寒早、花培528、南抗1号、朝花矮、协优赣-8等。
[0006] 由于水稻籼粳稻的分化，籼稻花药培养仍旧非常困难，而粳稻花药培养得到迅速 的发展和应用。我国粳稻花培经历了 40余年的研究、发展，已成为一种成熟而实用的粳稻育 种辅助手段，取得了丰硕成果，它的作用已被人们普遍认可。
[0007] 然而，现阶段粳稻花培育种在花药培养方法上仍存在着工作量大、工作效率低的 矛盾，限制了花培技术在粳稻育种中的更广泛的应用。如何提高工作效率、加快选择效率、 缩短育种周期、创新种质材料、配合其它生物技术的应用，快速获得纯系，充分利用花培技 术在基础理论研究和育种应用研究的雄厚基础，成为我们迫切需要解决的问题。多年的实 践经验发现，花培工作效率低的最重要的原因是花培操作方法的局限性。剪颖抖药法是目 前花药分离最普遍的操作方法，然而，剪颖和抖药过程既需要专业组培操作，又需要消耗大 量的劳动，成为花培操作的限速步骤。如何快捷分离水稻花药，并且保证分离后粳稻水稻花 药维持活力且无污染适宜离体培养，是解决花培操作低效的关键。
[0008] 离心机是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机 械。离心机主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开，或将乳浊液中两种密度不同又互 不相溶的液体分开。利用不同密度或粒度的固体颗粒在液体中沉降速度不同的特点，有的 沉降离心机还可对固体颗粒按密度或粒度进行分级。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对现有粳稻花药离体培养操作方法的专业操作要求高且耗时 耗力的缺陷，提供一种提高操作量、工作效率高的高效的粳稻花培方法。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的： 一种高效的粳稻花培方法，其特征在于:所述花培方法的步骤如下： (1) 取粳稻穗并低温预处理； (2) 对预处理后的粳稻稻穗进行灭菌； (3) 在无菌条件下将粳稻稻穗进行机械分割，切碎的稻穗倒入离心管中密封后置于摇 床上震荡； (4) 将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中，离心获得离体粳稻花药； (5) 对离体粳稻花药进行接种和诱导培养出粳稻花药愈伤组织； (6) 分化、继代与移栽，完成该粳稻花培过程。
[0011] 所述花培方法的详细步骤如下： (1) 取粳稻穗并低温预处理： 取穗时间一般选择晴天上午9:00-11:00,取材后，用75%乙醇表面消毒，然后用湿润的 纱布包裹粳稻稻穗，保持稻穗湿润，最后放到冰箱中，在4°C下低温预处理2-8天； (2) 对预处理后的粳稻稻穗进行灭菌： 预处理后，剪下稻苞，将稻苞浸泡于75%的酒精中处理3~5min，然后将该稻苞转移于超 净工作台中剥离稻穗，用消毒过的纱布包裹稻穗后用浓度为0.1%的升汞灭菌并间或摇动， 无菌水漂洗3~4次； (3) 在无菌条件下将粳稻稻穗进行机械分割，切碎的稻穗倒入离心管中密封后置于摇 床上震荡： 在无菌条件下将粳稻稻穗进行机械分割，将20-30g切碎的稻穗倒入含有60-80ml 18% 蔗糖溶液的100毫升离心管中，盖上离心管盖并用保鲜膜将离心管盖头位置紧紧封闭，从超 净工作台中取出离心管，置于摇床上300-400rpm震荡5-10min; (4) 将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中，离心获得离体粳稻花药： 将离心管放入高速冷冻离心机中离心，完成后然后轻轻取出离心管，可发现破碎的粳 稻颖壳和支梗沉降到离心管底部，将离心管轻轻放回超净工作台中，无菌操作，轻轻撕开保 鲜膜，打开离心管盖，将上层分离的粳稻花药倒入盛有已灭菌的蔗糖溶液容器； (5) 对离体粳稻花药进行接种和诱导培养出粳稻花药愈伤组织： 用灭菌过的合适孔径的网筛勺搅动蔗糖溶液，使粳稻花药均匀分散，然后S出，使得花 药均匀分散到网筛勺上，控出液滴，将花药磕到装有粳稻花药诱导培养基的培养瓶内，26-28°C暗培养，诱导粳稻愈伤组织； (6)分化、继代与移栽，完成该粳稻花培过程： 待粳稻花药愈伤组织直径达到1.5cm后，转接于粳稻花药分化培养基上光培养，分化出 花培幼苗，待花培苗苗高达到3cm后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至8cm后 移栽至周转箱壮苗，10~15天后移栽入大田。
[0012] 所述步骤（1)中的取穗以粳稻剑叶叶枕距为5~8cm、稻穗中部花药位置占颖壳的 1/3~1/2为标准取穗。
[0013] 所述步骤(2)中的稻苞是指稻苞顶枕距为7cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材 获得的部分。
[0014] 所述步骤(2 )中的0.1%的升汞灭菌时间为10-12min。
[0015] 所述步骤(3)中的稻穗进行机械分割的距离是2.0-2.5mm/段。
[0016] 所述步骤(4)中的离心机参数设置为：离心转速9000-10000rpm，离心时间5-8分 钟，离心温度10-20°C。
[0017] 所述步骤(4)中的蔗糖溶液的质量分数为18%。
[0018] 所述步骤(5)中的合适孔径的网筛勺的孔径为50-70目。
[0019] 所述步骤(6)中的光培养的条件为:温度27~29°C，光照强度1500-20001x、光周期 膚暗脱
[0020] 本发明相比现有技术有如下优点： 本发明通过创造性地对粳稻花药采取机械切割的方式进行破碎，然后根据具体需要采 用不同大小的离心力对碎片进行分离，成功提取到了纯净的粳稻花药，并通过优化离心介 质和采用无菌操作，成功获取到了活力旺盛的粳稻花药并进一步花培成功，获得了健壮的 花培苗;提高操作量的同时大大提升了粳稻花培工作效率。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0022] 本发明提供的高效的粳稻花培方法的详细技术方案为： (1) 取粳稻穗并低温预处理 以粳稻剑叶叶枕距为5~8cm、稻穗中部花药位置占颖壳的1/3~1/2为标准取穗，取穗 时间一般选择晴天上午9:00-11:00;取材后，用75%乙醇表面消毒，然后塑料薄膜包住整个 稻穗，扎紧塑料袋口，保持稻穗湿润，最后放到冰箱中，在4°C下低温预处理2-8天； (2) 对预处理后的粳稻稻穗进行灭菌 预处理后剪下顶枕距为7cm至穗下节间上部0.5cm的区域内剪材获得的粳稻稻苞，将稻 苞浸泡于70%的酒精中处理3~5min，然后将该稻苞转移于超净工作台中剥离稻穗，用消毒 过的纱布包裹稻穗后用浓度为0.1%的升汞灭菌l〇-12min并间或摇动，无菌水漂洗3~4次； (3) 在无菌条件下将粳稻稻穗进行机械分割，切碎的稻