一种基于机械法获取花药的高粱花培方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基于机械法获取花药的高梁花培方法，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 高梁为禾本科高梁属一年生草本植物，是我国最早种植的禾谷类作物之一。高梁 在世界谷物生产中占有重要地位，6大洲47个国家每年种植面积约0.45亿hm，为世界第五大 作物。高梁具有食用、饲用、酿造用、能源用及加工用等多种用途，在我国，高梁主要用于酿 酒，但随着畜牧业、能源业、加工业及膳食结构的改变，饲料、饲草高梁、能源甜高梁、靑用高 梁及食用高梁等具有特殊用途的高梁越来越受到重视，种植面积不断扩大。
[0003] 高梁抗逆性强、适应性广且综合利用价值高而在国民经济中占有不可替代的重要 地位。高梁具有耐旱、耐溃、耐贫瘡、耐盐碱等多重抗性，生物量大，是公认的抗旱性较强的 作物，在水资源严重短缺的干旱和半干旱地区具有很大的发展潜力。高梁W其独具的高含 糖量、高生物产量、高乙醇转化率和高抗逆性被誉为"高能作物"，成为符合我国国情、适合 我国国±和气候条件、既产能源又产粮食的理想作物之一。加强高梁茎杆生物能源综合开 发利用，对缓解国家能源紧张、改善生态环境、促进国民经济稳定持续发展，都具有十分重 要而深远的意义。
[0004] 我国的高梁产区集中在东北、华北和西北地区，品种资源丰富，运为新品种的选育 奠定了丰厚的遗传基础。高产、含糖量高、抗性好、适应性广的高梁品种是促进高梁生产发 展的核屯、和基础。随着生物技术的发展和市场需求的变化，高梁的育种方法也有了很大发 展。目前我国高梁的育种方法主要有:传统育种方法、诱变育种法、倍性育种法、分子育种法 等。针对高梁产业化开发的实践需求，创新育种思路，加快品种选育，为生产提供适宜的新 品种，将有力地推动高梁产业的发展，并且可W促进种植业结构调整和农村经济发展。
[000引花药培养是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药。通过无菌操作接 种在培养基上，在一系列条件诱导下改变花药的发育程序，进行有丝分裂，经过脱分化后形 成细胞团，进而形成愈伤组织，经历再分化发育成完整的单倍体植株的过程。现在花药培养 集成了杂交育种、诱变育种、细胞学、遗传学等各种生物科学的内容，是育种学发展的趋势 之一，利用花药培养可W明显的加快育种进程、缩短育种年限。
[0006] 目前小麦、水稻、玉米及木本植物的花药培养已经取得了成功，而高梁的花药培养 诱导单倍体的方法和培养基还不完善。现阶段高梁花培育种在花药培养方法上仍存在着工 作量大、工作效率低的矛盾，限制了花培技术在高梁育种中的更广泛的应用。如何提高工作 效率、加快选择效率、缩短育种周期、创新种质材料、配合其它生物技术的应用，快速获得纯 系，充分利用花培技术在基础理论研究和育种应用研究的雄厚基础，成为我们迫切需要解 决的问题。
[0007] 多年的实践经验发现，花培工作效率低的最重要的原因是花培操作方法的局限 性，剪颖抖药法是目前花药分离最普遍的操作方法，然而，剪颖和抖药过程既需要专业组培 操作，又需要消耗大量的劳动，成为花培操作的限速步骤。如何快捷分离高梁花药，并且保 证分离后高梁花药维持活力且无污染适宜离体培养，是解决花培操作低效的关键。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有花药离体培养操作方法的专业操作要求高且耗时耗力 的缺陷，提供一种提高操作量、工作效率高的基于机械法获取花药的高梁花培方法。
[0009] 本发明的目的是通过W下技术方案解决的： 一种基于机械法获取花药的高梁花培方法，其特征在于:所述花培方法的步骤如下： (1) 取穗及预处理； (2) 对预处理后的高梁穗进行灭菌； (3) 在无菌条件下将高梁穗进行机械分割，切碎的高梁穗倒入离屯、管中密封后置于摇 床上震荡； (4) 将初步震荡后的离屯、管放入高速冷冻离屯、机中离屯、获得离体花药； (5) 对离体花药进行接种和诱导培养出花药愈伤组织； (6) 分化、继代与移栽，完成该花培过程。
[0010] 所述步骤(1)中的取穗W采集主茎上的圆锥花序且其花药中的小抱子处于单核晚 期为标准取穗;所述的预处理过程为:先用75%乙醇表面消毒，然后用湿润的纱布包裹整个 高梁穗，保持高梁穗湿润，最后放到冰箱中，在5°C下低溫预处理2-5天。
[0011] 所述步骤(2)中的灭菌过程为:预处理后剪下高梁穗，将高梁穗浸泡于75%的酒精 中处理3~5min，然后将该高梁穗转移于超净工作台中剥离高梁穗，用消毒过的纱布包裹高 梁穗后用浓度为0.1%的升隶灭菌l〇-12min并间或摇动，无菌水漂洗3~4次，打开纱布惊干。
[0012] 所述步骤(3)中的高梁穗按照2.2-2.6mm/段进行机械分割。
[0013] 所述步骤(3)中切碎的高梁穗倒入含有60-80ml的薦糖溶液的100毫升离屯、管 中，盖上离屯、管盖并用保鲜膜将离屯、管盖子位置紧紧封闭。
[0014] 所述步骤(3)中密封的离屯、管从超净工作台中取出后置于摇床上进行300-40化pm 震荡 8-lOmin。
[0015] 所述步骤(4)中的离屯、机参数设置为：离屯、机转速9000-10000巧m，离屯、时间8-10 分钟，离屯、溫度15-25°C;所述的离体花药需要放回超净工作台，无菌操作倒入盛有已灭菌 的18%薦糖溶液容器。
[0016] 所述步骤巧）中的离体花药接种和诱导培养过程为：用灭菌过的网筛勺揽动装有 离体花药的薦糖溶液，使离体花药均匀分散，然后圉出，使得离体花药均匀分散到网筛勺 上，控出液滴，将离体花药磕到装有诱导培养基的培养瓶内，溫度为27-29°C、湿度70%左右 的环境下暗培养，诱导出愈伤组织。
[0017] 所述步骤(6)中的分化、继代与移栽过程为:待花药愈伤组织直径达到1.5cm后，转 接于分化培养基，在溫度27~29°C、光12V暗12h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗苗 高达5cm后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗高达IOcm后移栽至周转箱壮苗，10~ 15天后移栽入大田。
[0018] 所述步骤巧）中的网筛勺的孔径为55-65目。
[0019] 本发明相比现有技术有如下优点： 本发明通过创造性地对高梁花药采取机械切割的方式进行破碎，然后根据具体需要采 用不同大小的离屯、力对碎片进行分离，成功提取到了纯净的高梁花药，并通过优化离屯、介 质和采用无菌操作，成功获取到了活力旺盛的高梁花药并进一步花培成功，获得了健壮的 花培苗;提高操作量的同时大大提升了花培工作效率。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0021] 本发明提供的基于机械法获取花药的高梁花培方法的详细技术方案为： (1) 取穗及预处理： 取穗W采集主茎上的圆锥花序且其花药中的小抱子处于单核晚期为标准取穗，取回 后，先用75%乙醇表面消毒，然后用湿润的纱布包裹整个高梁穗，保持高梁穗湿润，最后放到 冰箱中，在5°C下低溫预处理2-5天； (2) 对预处理后的高梁穗进行灭菌： 预处理后剪下高梁穗，将高梁穗浸泡于75%的酒精中处理3~5min，然后将该高梁穗转 移于超净工作台中剥离高梁穗，用消毒过的纱布包裹高梁穗后用浓度为0.1%的升隶灭菌 10-12min并间或摇动，无菌水漂洗3~4次，打开纱布惊干； (3) 在无菌条件下将高梁穗进行机械分割，切碎的高梁穗倒入离屯、管中密封后置于摇 床上震荡： 在无菌条件下将高梁穗按照2.2-2.6mm/段进行机械分割，切碎的高梁穗倒入含有60-80ml的18%薦糖溶液的100毫升离屯、管中，盖上离屯、管盖并用保鲜膜将离屯、管盖子位置紧紧 封闭，离屯、管从超净工作台中取出后置于摇床上进行300-40化pm震荡8-lOmin; (4) 将初步震荡后的离屯、管放入高速冷冻离屯、机中离屯、获得离体花药： 将初步震荡后的离屯、管放入高速冷冻离屯、机中，离屯、机参数设置为：离屯、机转速 10000-12000巧m，离屯、时间8-10分钟，离屯、溫度15-25°C，离屯、获得离体