[0001]
本发明属于微生物农药技术领域，具体是涉及一种可以直接给香蕉注射的防治枯萎病的微生物菌剂注射液
--
该注射液的主要成份为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens) jcd-h-12发酵菌液。
背景技术：
[0002]
香蕉枯萎病是由尖胞镰刀菌古巴专化型((fusarium oxysporium f.sp.cubense, foc)病原真菌引起的毁灭性土传病害，自1874年首次在澳大利亚发现以来，曾于1896年在巴拿马造成大面积危害，之后逐渐传至世界各地，是至今无法解决的世界科技难题。目前，在我国广东、海南、广西、云南和福建等香蕉主产区，香蕉枯萎病是由foc的4号生理小种引起的，粉蕉枯萎病是由foc的1号生理小种引起的，发病蕉园发病率一般在30-50%，重病区可达90%以上，导致香蕉减产、甚至绝收，是香蕉生产上的一个主要限制因子。
[0003]
迄今对该香蕉枯萎病尚无理想的抗病品种和化学药剂，因此，结合栽培措施，施用对该病具有拮抗效果的微生物菌株，从而抑制土壤香蕉枯萎病菌数量，改变土壤的微生物生态结构，促进香蕉生长，提高香蕉广谱抗病性，成为一种理想的生物防治措施。但在我们长期一线香蕉枯萎病的防治来看，在种植香蕉的土壤中大量使用腐熟好的有机肥与大量拮抗微生物菌剂有明显的防治效果，但对于已经有轻微或中度发病的植株来看，发现使用拮抗微生物菌剂滴灌与叶面喷施治疗香蕉枯萎病时，救治成功率低（不到30%），主要原因是拮抗微生物菌剂滴灌与叶面喷施香蕉，其拮抗微生物从根系或叶面进入香蕉体内定植所需要的时间过长，不能在香蕉植株体内短时间快速繁殖，从而无法抑制已经发病的香蕉植株内足够多的病原菌，如果香蕉体内不能快速占据更多的拮抗微生物，香蕉发病过快而至死亡。通过叶面喷施与滴灌拮抗微生物来治疗香蕉枯萎病时，甚至有时会加速香蕉的死亡与减产，经过分析，可能的原因是由于部分拮抗微生物菌剂作为内生菌，会在香蕉体内繁殖，产生抑菌物质，会加速病原真菌向植株上部快速转移，而导至植株维束管加速褐化而死亡。因此，种植户只能将发病植株进行砍掉，茎叶与附近土壤进行消毒处理或者大量使用拮抗微生物菌剂，以防止其快速传染其他健康植株。因此，在发现香蕉植株已经发生枯萎病时，如何快速使用拮抗微生物能快速进入植株体内定植，是解决防治香蕉枯萎病的关键。
[0004]
由于，现有的拮抗微生物菌剂的主要使用方式为：对于土传病害，采用灌根的方法进行防治； 对于叶部病害，采用叶面喷施的方法进行防治；还未有报道利用拮抗微生物菌剂进行注射防治病害的，也没有可以给植物直接注射的微生物菌株报道；更没有直接注射活菌制剂防治枯萎病的报道。因此，寻找到一种可以直接给香蕉注射的植物内生菌株，及其能防治香蕉枯萎病的微生物注射液则对香蕉种植领域具有重大意义。
技术实现要素：
[0005]
本发明的目的是提供一种可以直接给香蕉注射的微生物菌剂注射液；该注射液的主要成份为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens) jcd-h-12发酵菌液，该菌种
已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.11856保藏日期为2015年12月10日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；本发明的另一个目的是提供一种可以直接给香蕉注射的微生物菌剂注射液在防治枯萎病上的应用，具体施用方法为：当香蕉有枯萎病时，用兽用注射器吸取微生物菌剂注射液（解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12发酵菌液）的1-40倍稀释液注入香蕉地下球茎位置，小叶生长期每株注1-30ml稀释液，大叶生长期每株注5-80ml稀释液。
[0006]
解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12，本发明人已经在发明专利zl2015109510983中公开，其具有解磷，防病促生，增产提质，抑菌谱广等多重功效，能有效防治白粉病，烟草黑胫病，灰霉病，水稻稻瘟病，黄瓜枯萎病、番茄早疫病、甜椒炭疽病、西瓜菌核病、小麦赤霉病、西瓜枯萎病、辣椒疫霉病菌等，广谱抗菌并且效果稳定持久，具有开发集解磷与防治病害一体的菌肥与微生物农药制剂。但并未公开其可作为直接给香蕉注射的微生物菌剂，由于注射菌液要完全水溶，因此重新优化了生产工艺：取出解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12菌种保藏管，用lb固体培养基划平板进行复苏，33℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50mllb培养基中，在培养箱中33℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2l lb培养基的5l大三角瓶中， 33℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿cfu/ml，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；二、将步骤一培养的解淀粉芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600l发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，33℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于60亿cfu/ml，即可结束发酵，加微量元素10ml/l，调ph至7.0-7.2，无菌灌装得到成品微生物菌剂注射液；其中，所述lb培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000ml，ph7.2，固体培养基中加入琼脂2%。
[0007]
其中，所述发酵培养基：蛋白胨30 g/l，葡萄糖10g/l，可溶性淀粉10 g/l， 玉米浆8 g/l，硫酸镁0.3 g/l，硫酸锰0.2 g/l，磷酸二氢钠0.5 g/l，磷酸氢二钾2.3 g/l，硫酸亚铁0.01 g/l ， ph7.2。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15mpa，121℃灭菌30分钟。
[0008]
其中，微量元素：硼酸0.1 g，氯化钴0.1 g，氯化锌0.1g，钼酸钠0.02g，氯化铜0.01g，乙二胺四乙酸二钠1g，蒸馏水1000ml，0.10-0.15mpa，121℃灭菌30分钟。
[0009]
本发明有益效果：提供了一株可以直接注射给药的香蕉内生菌
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解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12，针对于感染中轻度枯萎病的香蕉，可以通过球茎注射解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12发酵菌液，可以快速高浓度定植至香蕉体内，从而抑制住病原菌的生长，控制病害，修复根系，减少香蕉因枯萎病死亡的损失。
具体实施方式
[0010]
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明实施例1 微生物菌剂注射液菌种的筛选在广西某香蕉组培公司将准备好的袋装生根苗撤封后用清水洗净，将培养好的22株菌种（大部分为植物内生芽孢杆菌）的发酵液离心后，用无菌水稀释至1
×
109cfu/ml的浓度，每棵苗在球茎处注射1ml菌液，每种菌液注射5棵香蕉苗（取115棵苗做试验，5棵注射无菌
水，其他5322棵苗不注射，同等条件下假植），分别假植在提前1-2天浇透水的营养袋上，假植时在营养袋中央挖一穴，把生根苗小心栽入，埋土至假茎根部1-2cm处，然后轻压土把苗固定。假植后，保持适宜的水份，前10天，棚内湿度保持95%以上，15天后湿度保持70%-80%，保持棚内温度为27-31℃，施肥采用常规施肥，实验时间为30天，统计每种注射菌液的死亡棵数，并最终取全部成活的菌种的香蕉苗的叶面组织检测活菌数，以活菌数多的作为目标菌株。
[0011]
试验结果如表1，可以看到，注射jcd-h-12，yhsw-1123的5棵香蕉苗都成活，注射清水的5棵成活，不注射的苗成活率达到98.1%（基地其他苗统计，5322棵苗成活5221棵），而其他的菌株都有死棵，甚至注射jcd-q-17，jcd-l-2都没有成活，明显可以看到不是所有的菌株能注射施菌，甚至可以导致香蕉全部死亡。30天后，取注射jcd-h-12，yhsw-1123的五棵香蕉苗的每个叶片各1g，依次用70%酒精浸泡30 s， 0.1%升汞浸泡45 s，无菌水漂洗3次，晾干剪碎。用无菌水进行等梯度稀释获得菌悬液，选择合适的稀释度，涂布于固体lb培养基上，30℃培养48 h，计算平均每克组织的含菌量，注射jcd-h-12的香蕉苗中叶片的jcd-h-12含菌量为3.8
×
104cfu/ml，注射yhsw-1123的香蕉苗叶片中的yhsw-1123含菌量为1.2
×
10
2 cfu/ml。明显jcd-h-12在香蕉上通过注射定植效果更好，在植株体内存活浓度更高。因此，选择jcd-h-12作为目标菌株，jcd-h-12为一株解淀粉芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens jcd-h-12，本发明人已经在发明专利zl2015109510983中公开，具有解磷，防病促生，增产提质，抑菌谱广等多重功效，能有效防治白粉病，烟草黑胫病，灰霉病，水稻稻瘟病，黄瓜枯萎病、番茄早疫病、甜椒炭疽病、西瓜菌核病、小麦赤霉病、西瓜枯萎病、辣椒疫霉病菌等，广谱抗菌并且效果稳定持久，具有开发集解磷与防治病害一体的菌肥与微生物农药制剂。该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.11856保藏日期为2015年12月10日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；其中，各芽孢发酵液，是经过以下步骤生产的：取出菌种保藏管，用lb固体培养基划平板进行复苏，33℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50mllb培养基中，在培养箱中33℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2l lb培养基的5l大三角瓶中， 33℃震荡培养40-48小时，检测其菌液浓度，芽孢含量超过10亿cfu/ml，即可作为芽孢发酵液；其中，所述lb培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000ml，ph7.2，固体培养基中加入琼脂2%。
[0012]
其中，accc 60429，accc 60383，accc 10369这三株菌是来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，地址： 北京市海淀区中关村南大街12号，都为植物内生菌，其他菌株为本发明人自主分离能在植株体内定植的芽孢杆菌。
[0013]
表1注射各芽孢发酵液对香蕉苗成活的影响
实施例2 微生物菌剂注射液的制备取出解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens jcd-h-12菌种保藏管，用lb固体培养基划平板进行复苏，33℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50mllb培养基中，在培养箱中33℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2l lb培养基的5l大三角瓶中， 33℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿cfu/ml，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；二、将步骤一培养的解淀粉芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600l发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，33℃培养24-36小时，检测芽孢含量为81亿cfu/ml，结束发酵，加微量元素10ml/l，调ph至7.0-7.2，无菌灌装得到成品微生物菌剂注射液；其中，所述lb培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000ml，ph7.2，固体培养基中加入琼脂2%。
[0014]
其中，所述发酵培养基：蛋白胨30 g/l，葡萄糖10g/l，可溶性淀粉10 g/l， 玉米浆8 g/l，硫酸镁0.3 g/l，硫酸锰0.2 g/l，磷酸二氢钠0.5 g/l，磷酸氢二钾2.3 g/l，硫酸亚铁0.01 g/l ， ph7.2。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15mpa，121℃灭菌30分钟。
[0015]
其中，微量元素：硼酸0.1 g，氯化钴0.1 g，氯化锌0.1g，钼酸钠0.02g，氯化铜0.01g，乙二胺四乙酸二钠1g，蒸馏水1000ml，0.10-0.15mpa，121℃灭菌30分钟。
[0016]
实施例3微生物菌剂注射液（解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12）通过注射快速在香蕉体内繁殖的盆栽试验在口径为30cm、高20cm的花盆中，装入l0kg的已经灭菌的混有肥料和草木灰的稻田土，将4-7片叶的香蕉苗栽入花盆中(外套一不漏液的黑色大盆)，每盆定植1株，遮阳2d，定植7d后，设计试验，分别为: 注射组：用兽用注射器吸取实施例2制备的微生物菌剂注射液10倍稀释液注入香蕉假茎底部位置，每株注射10ml稀释液（施用原液1ml）；喷淋组：将1ml实施例2制备的微生物菌剂注射液直接稀释50倍，喷施，同时再将5ml实施例2制备的微生物菌剂注射液稀释150倍直接淋根施入（由于在试验前进行过预试验，发现喷淋菌的菌量过少，植株前7天目的菌定植较少，因此加大了喷淋组菌的用量，喷淋组每株施用原注射液为6ml）。每处理20个重复。以上盆栽接种试验置于日光温室中，每天淋水1次。
[0017]
将香蕉苗按上述方法进行处理，于接菌后1 d, 3d, 5 d，7d,9d, 11 d，13 d, 15d，随机取两株香蕉苗，连根拨出，去掉大土块，抖落根表细土;并将每株分别切取根、叶片
各1g，依次用70%酒精浸泡30 s， 0.1%升汞浸泡45 s，无菌水漂洗3次，晾干剪碎。用无菌水进行等梯度稀释获得菌悬液，选择合适的稀释度，涂布于解无机磷固体培养基上，30℃培养48 h，计算平均每克组织的含菌量。由于解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens jcd-h-12具有较强的解磷作用的，其在解无机磷固体培养基中能在36小时之内长出小菌落，而取未接菌的香蕉叶根内的菌检测发现其在解无机磷固体培养基中能长出菌落最早发现菌落要72小时以后才能发现。因此，可以用解无机磷固体培养基作培养基来区分目的菌株。
[0018]
其中，解无机磷固体培养基（g/l）：(nh4)2so40.5，mgso4
·
7 h2o 0.5，nacl 0.2，ca3(po4)2 0.5，caco30.5，葡萄糖 2.0，mnso40.02，feso40.02，蒸馏水 1000 ml，琼脂ph7.2。
[0019]
试验结果：从表2中可以看出，注射组每棵香蕉注射原菌液1ml，第一天，解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12就能在叶组织中检测高达5.3
×
10
3 cfu/g，而第三天，则能高达2.4
×
10
6 cfu/g，而喷淋组，每棵香蕉苗使用注射原菌液为6ml，第一天叶面组织中检测到的解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12才87 cfu/g，而第三天也只有510 cfu/g，并且在后面的第5天，7天，9天，菌数都差了两个数量级。这显著证明了通过注射解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12发酵菌液比喷淋菌液在短期内能快速使其在香蕉体内定植繁殖。
[0020]
从表3中可以看出，注射组每棵香蕉注射原菌液1ml，第一天，解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12就能在根系中检测156 cfu/g，而第三天，则能高达3.5
×
103cfu/g，而喷淋组，每棵香蕉苗使用注射原菌液为6ml，第一天根系中检测到的解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12只有105 cfu/g，而第三天也只有440 cfu/g，注射组中的解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12在香蕉根系中定植速度在第3-7天则比喷淋组要高一个数量级，尽管没有在叶面中定植速度那么显著，但也是比喷淋组定植速度快很多。因此，从表2与表3可以证明通过球茎注射解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12，可以使其在香蕉体内快速高浓度繁殖。
[0021]
表2香蕉叶片组织中解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12含量（cfu/g）
日期13579111315喷淋组875102.4
×
1033.1
×
1044.6
×
1045.3
×
1043.7
×
1043.2
×
104注射组5.3
×
1032.4
×
1061.7
×
1062.3
×
1061.2
×
1066.8
×
1057.2
×
1055.5
×
105表3香蕉根系中解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12含量（cfu/g）
日期13579111315喷淋组1054403.1
×
1034.2
×
1043.8
×
1046.7
×
1044.5
×
1042.9
×
104注射组1563.5
×
1034.8
×
1043.3
×
1052.5
×
1052.8
×
1051.9
×
1051.6
×
105实施例4 本发明实施2制备的微生物菌剂注射液在香蕉枯萎病的防治的应用效果1试验时间：2020年5月-2020年10月2．试验地点：广西壮族自治区南宁市武鸣区某农场某农场有350多亩香蕉开始抽穗，枯萎病开始有发病，经过统计，枯萎病叶面病情指数分级标准参照下表4，2级发病的有103棵，3级发病的有24棵，4级发病的有4棵。
[0022]
喷淋组（每棵香蕉总用量注射液25ml）：叶面喷施100倍微生物菌剂注射液稀释液500ml，淋根使用微生物菌剂注射液为20ml（配合150倍的水），总共42侏（33 株病情指数2级，8株病情指数3级，1株病情指数4级）。
[0023]
注射组（每棵香蕉使用微生物菌剂注射液3ml）：每株注射60ml微生物菌剂注射液
20倍稀释液，总共42侏（33 株病情指数2级，8株病情指数3级，1株病情指数4级）。
[0024]
注射组+喷淋组（每棵香蕉总用量注射液18ml）：每株注射60ml微生物菌剂注射液20倍稀释液（每棵香蕉使用微生物菌剂注射液3ml），叶面喷施（100倍稀释液）500ml，淋根使用微生物菌剂注射液为10ml（配合300倍的水），总共43侏（33 株病情指数2级，8株病情指数3级，2株病情指数4级）。
[0025]
试验结果：如表5，喷淋组中初始的病情指数3级与4级的全部死亡，只有病情指数2级的有10株最后获得采摘，但每株产量也有影响，整个最终救治好的香蕉能采摘到果的只有喷淋组总棵数的23.8%。而且喷淋组株均产量只有4.80kg。而且在使用菌液滴灌后，发现病指4级的那株香蕉与3株病指3级的香蕉加速了死亡（以蕉农经验衡量）。可能的原因是由于我们的解淀粉芽孢杆菌作为内生菌，会从根系向至香蕉体内转移定植，而产生抑菌物质，会加速病原真菌向植株上部快速转移，而导至植株维束管加速褐化而死亡(7-10天即死亡)。而其他死亡的基本是在15天至60天内死亡的。
[0026]
而注射组只有初始的病情指数4级的那株死亡（注射时，发现病指4级的香蕉球茎已经褐化超过一半），而其他的初始为2级与3级的都能成活到最终采摘果。治好率达97.6%，均株产量达到26.04kg。香蕉注射完后的7天左右就能明显看到黄叶没有加重，而喷淋组已经有开始死亡。
[0027]
而复合组（注射组+喷淋组），不仅仅初始为2级与3级的都能成活到最终采摘果，而且还有一株初始病指为4级也最终成活至采摘果实，治好率达97.7%，均株产量达到26.89kg；尽管单一注射组株产量（26.04kg）比正常健康的株产量29.39kg(农场主提供采摘数据)要低，但能够将已经发病的香蕉达到97.6%的最终采果率，是完全意想不到的。当然最优方案是复合组，注射功剂使植物内生菌解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12尽快在植株体内占优，并且阻断了尖胞镰刀菌从球茎往香蕉假茎与健康球茎相连的根系扩散，同时叶面喷淋与滴灌，这样土壤，根系，叶面，植株体内多方面让解淀粉芽孢杆菌jcd-h-12定植占优，快速抑制尖胞镰刀菌的繁殖，从而提供了一种高治愈已经发枯萎病的香蕉植株，而大大减少农户损失；按传统的方法，如果有植株发生枯萎病，是直接砍掉以减少其对其他植株的传染，来减少农户损失。以3元/kg香蕉田间售价，只注射42株香蕉相对于喷淋组（常规处理），就增产了866.4kg,增加产值达2599.2元，减去人工费与材料费，也可以至少增产1500元以上。
[0028]
表4香蕉枯萎病叶部病害分级标准病级发病程度代表数值1级没有出现条纹或者黄色叶片，植株表现健康02级有轻微条纹或者底部叶片黄化13级出现条纹或者底部叶片大部分黄化24级现现大量条纹或者几乎全部叶片黄化35级整株死亡4表5 微生物菌剂注射液在大田香蕉中的应用效果组别初始病株收获株总产量（kg）平均株产喷淋组4210201.44.80注射组42411067.826.04复合组43421129.526.89
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。