集装箱养殖尾水中生物热源的控制方法与流程

1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种集装箱养殖尾水中生物热源的控制方法。


背景技术：

2.进入21世纪以来，探索水产养殖的新模式和新技术已经受到越来越多国家的重视，水产养殖模式正逐步朝向集约化、生态化和有机化变革。近年来，一些养殖场为了节约成本，采取高密度养殖方式以提高产量。然而，养殖单产不断提高的同时，水的生态环境也不断恶化。为了控制水资源的污染问题，做到经济效益与绿色生态和谐发展，必须对传统粗放型养殖模式进行改变，因此新型养殖技术
‑
集装箱养殖技术应运而生。集装箱式水产养殖模式创新性地采用标准定制的集装箱为载体，利用集装箱进行标准化、工业化、模块化循环水养殖，有效控制箱体内的养殖体状态与养殖水环境，实现受控式生态循环养殖，其主导模式主要分为与池塘联动的“陆基推水式”和全循环利用的“一拖二式”两大主导模式
1.。
3.现有的“陆基推水式”(公开号为cn106386636a)和“一拖二式”(公告号为cn206586197u)集装箱养殖技术虽然在尾水处理方面配备了相关净化设施，但在广州等地的集装箱养殖厂采集的尾水样本仍出现内毒素浓度偏高的现象，说明了当前部分集装箱养殖缺乏对生物热原威胁的关注和解决，其原因可能包括:(1)现代集装箱养殖为大规模高密度养殖，鱼类本身可能携带细菌，外界环境也有带来有害微生物的风险，容易在水体扩散；(2)水体中所含有的有机物等物质，易于微生物的滋生；(3)高氮的饲料为微生物提供了氮源，利于微生物生存；(4)现有的尾排水处理技术，即集装箱养殖利用集装箱对鱼类进行集约化养殖，养殖尾水经过净化处理循环利用或者排放但存在于其中的内毒素却依然是养殖鱼类健康和绿色生态环境的一大威胁，不能针对各种有害微生物进行有效处理。
4.热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌内毒素，其致热活性远高于其他已知的热原物质，是革兰氏阴性菌和部分蓝藻细胞壁的脂多糖复合物，主要由菌体死亡解体释放
2.。内毒素对机体可产生致病作用，它作为外源性致热原作用于粒细胞和单核细胞等
3.，使之释放内源性致热原，引起发热；可激活血管活性物质的释放，使末梢血管扩张，通透性增高，静脉回流减少，心排血量减低，导致低血压并发休克
4.；因组织供血不足缺氧，导致代谢性酸中毒；可活化凝血因子
ⅻ
，导致dic
5.；可引起施瓦兹曼现象(shwartzman phenomenon)。
5.近年来，水环境的内毒素所致健康风险开始受到关注，当水体环境中病原微生物增殖时，菌体死亡释放的内毒素可通过血液、呼吸、胃肠等暴露途径引发潜在的健康风险。虽然目前国内外尚未将细菌内毒素列入饮用水和再生水水质标准，但是近年来国外有关地表水、地下水、饮用水、再生水和污水处理厂出水等内毒素污染的研究逐年增多。如日本淀川的内毒素活性为311
‑
2430eu
·
ml
‑
16.；加拿大蒙特利尔的13个地表水源的内毒素活性为32
‑
1188eu
·
ml
‑
17.；芬兰的水源在蓝藻暴发后内毒素活性达到20
‑
38000eu
·
ml
‑
18.；科威
in surface water sources and a drinking water treatment plant in beijing，china[j].water research，2013，47(11):3591
‑
3599.


技术实现要素：

[0020]
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种集装箱养殖尾水中生物热源的控制方法，该养殖方法可在“集装箱养殖”模式中广泛应用，以降低集装箱(本发明的集装箱采用标准定制的集装箱即可)养殖系统中致病性细菌等病原对生态环境的风险隐患，最大限度降低养殖尾排水的生态风险，解决产业发展的技术瓶颈。
[0021]
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
[0022]
一种集装箱养殖尾水中生物热源的控制方法，其包括如下步骤：
[0023]
(1)、池塘水源通过集装箱进水口处的臭氧处理，臭氧的浓度为0.2
‑
0.3mg/l，5
‑
10min后大量曝气待臭氧的浓度为0.002
‑
0.003mg/l后，将处理后的养殖尾水排入集装箱内，同时集装箱内投加预先选择的鱼苗；
[0024]
(2)、投加鱼苗10
‑
15天后，在集装箱内仅泼洒丁酸梭菌，使有效活菌数≥10亿/cfu/ml；
[0025]
(3)、集装箱内持续曝气，使养殖水体的溶氧含量为6
‑
8mg/l；
[0026]
(4)、养殖期间投加高能低氮低磷的饲料，每天早上和下午各投加一次，投加时间为0.5h，水温为12
‑
20℃，投加量为鱼平均体重的1
‑
3％；水温为20℃以上，投加量为鱼平均体重的3
‑
5％，养殖尾水通过集装箱出口处的臭氧处理后排出。
[0027]
作为本发明的一种优选实施例，步骤(1)中，进水臭氧产生的新生态氧能对嗜水气单胞菌等病原体起到极强的杀灭作用；氧化抑制病原菌，对细菌繁殖体的d值(杀灭90％的病原菌所需作用的时间(min)为0.3
‑
4.0，杀灭病毒的d值为2.42，杀灭真菌的d值为4
‑
18，杀灭细菌芽孢的d值为0.8
‑
7.3。
[0028]
作为本发明的一种优选实施例，步骤(1)中，预先选择的鱼苗条件为：体色一致，无白色死苗，身体清洁，略带暗青色(鲤鱼除外)，规格较整齐，体型茁壮，光滑而不拖泥，游动活泼。
[0029]
作为本发明的一种优选实施例，步骤(2)中，若集装箱的水内环境发生改变时，加入丁酸梭菌后，不能与消毒剂、氧化剂同时使用，应间隔24小时以上。加入的消毒剂和氧化剂要随鱼体的情况选择相应的物质。
[0030]
作为本发明的一种优选实施例，步骤(2)中，丁酸梭菌可以调节水质、抑杀细菌、防治肠炎白便，拖便。
[0031]
作为本发明的一种优选实施例，步骤(3)中，在水溶液中氧气可形成氧化能力很强的自由羟基(oh)，破坏细菌等病原蛋白质分子结构，使去氧核糖核酸(dna)断链和作用于细胞膜脂质等，从而抑制细菌等病原以至将其杀灭，对苗种起到保护作用。
[0032]
作为本发明的一种优选实施例，步骤(4)中，以鲤鱼、鲫鱼和团头鲂为例，早上9时投喂一次，下午5时投喂一次，投喂时间控制在0.5h内，水温为12
‑
20℃时，投喂量为鱼平均体重1
‑
3％，水温在20℃以上时，投喂量为鱼平均体重的3
‑
5％。特殊鱼种需要考虑养殖温度、天气、水质等情况，进行投喂。养殖过程中，集装箱内养殖水一直在循环流动，保证鱼肉的肉质紧实，品质好，单位产出也高。
[0033]
作为本发明的一种优选实施例，步骤(4)中，高能低氮低磷的饲料包括0.2
‑
0.3wt％微量元素、0.11
‑
0.15wt％维生素、0.2
‑
0.4wt％氯化胆碱、1
‑
3wt％磷酸二氢钙、0.01
‑
0.02wt％虾青素、0.1
‑
0.2wt％β胡萝卜素、15
‑
20wt％虾粉、15
‑
25wt％发酵豆粕、5
‑
10wt％鱼粉、5
‑
8wt％豆油、4
‑
6wt％鱼油、10
‑
15wt％面粉、5
‑
15wt％杂粕、0.2
‑
0.7wt％赖氨酸、0.2
‑
0.5wt％蛋氨酸和0.1
‑
0.4wt％苏氨酸。其中，微量元素包括铁、铜、锌、锰、碘、硒及钴，维生素包括v
c
、v
a
、v
b2
和v
b6
。
[0034]
养殖期间投喂的上述饲料应为高能低氮低磷专用饲料，该饲料有增加鱼类粪便的成型率和耐水性的特点，有利于粪便的收集，有效降低了养殖水体及尾排水污染。其中：部分对鱼类生长影响重大的微量元素使用了氨基酸螯合物，鱼类吸收效果更好，排放更少，健康高效。
[0035]
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
[0036]
第一、本发明基于四级屏障体系可有效控制受控式集装箱尾排水中由于致病性细菌产生的内毒素
‑
生物热源风险，使集装箱尾水中的细菌内毒素含量减少至0.012eu/ml，以降低集装箱养殖系统中致病性细菌等病原对生态环境的风险隐患，从源头能最大限度保障养殖水产品质量安全，保障水环境生态安全，解决产业发展的技术瓶颈。
[0037]
第二，本发明利用生物热源作为评价养殖尾排水的新型指标，具有极强的前瞻性、科学性和适应性，可广泛推广。其次，立足于应用与环境保护相协调，且具备较好的前期调研和技术基础，符合农业绿色发展和转型升级的国家政策，具有广阔的应有前景和市场前景。
附图说明
[0038]
图1为本发明的内毒素标准曲线示意图。
[0039]
图2为本发明中广州观星农业集装箱养殖水、广州观星农业集装箱尾排水及市售矿泉水中内毒素浓度示意图。
[0040]
图3为本发明中室内养殖水、广州土塘养殖水、广州土塘尾排水、江苏兴化河蟹养殖场的养殖水、北京自来水和水气单胞菌纯培养液106cfu(超声破碎)中内毒素浓度示意图。
具体实施方式
[0041]
本发明提供了一种集装箱养殖尾水中生物热源的控制方法。
[0042]
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0043]
实施例：
[0044]
本实施例的集装箱养殖尾水中生物热源的控制方法包括如下步骤：
[0045]
(1)、池塘水源通过集装箱进水口处的臭氧处理，臭氧的浓度为0.3mg/l，5min后大量曝气待臭氧的浓度为0.003mg/l，将处理后的养殖尾水排入集装箱内，同时集装箱内投加预先选择的鱼苗，其中，鱼苗选择：体色一致，无白色死苗，身体清洁，略带暗青色(鲤鱼除外)，规格较整齐，体型茁壮，光滑而不拖泥，游动活泼。
[0046]
(2)、投加鱼苗15天后，在集装箱内仅泼洒丁酸梭菌，使有效活菌数≥10亿/cfu/ml；
[0047]
(3)、集装箱内持续曝气，使养殖水体的溶氧含量为6mg/l；
[0048]
(4)、养殖期间投加高能低氮低磷的饲料，每天早上9时和下午5时各投加一次，投加时间为0.5h，水温为12℃时，投加量为鱼平均体重的1％；水温为20℃时，投加量为鱼平均体重的3％，养殖尾水通过集装箱出口处的臭氧处理后排出。
[0049]
其中，在步骤(1)中，进水臭氧产生的新生态氧对细菌繁殖体的d值(杀灭90％的病原菌所需作用的时间(min)为0.3，杀灭病毒的d值为2.42，杀灭真菌的d值为4，杀灭细菌芽孢的d值为0.8。
[0050]
在步骤(4)中，高能低氮低磷的饲料包括0.2wt％微量元素、0.11wt％维生素、0.2wt％氯化胆碱、1wt％磷酸二氢钙、0.01wt％虾青素、0.1wt％β胡萝卜素、15wt％虾粉、15wt％发酵豆粕、5wt％鱼粉、5wt％豆油、4wt％鱼油、10wt％面粉、5wt％杂粕、0.2wt％赖氨酸、0.2wt％蛋氨酸和0.1wt％苏氨酸。其中，微量元素包括铁、铜、锌、锰、碘、硒及钴，维生素包括v
c
、v
a
、v
b2
和v
b6
。
[0051]
<实验>
[0052]
将上述实施例的集装箱养殖尾水进行内毒素的检测：
[0053]
1.样品采集
[0054]
采集集装箱尾排水、广州土塘养殖水、广州土塘尾排水、江苏兴化河蟹养殖场的养殖水、室内养殖水、北京自来水、市售矿泉水、嗜水气单胞菌纯培养液106cfu(超声破碎)等8种水样及1类细菌培养液。玻璃采样瓶均无热源玻璃器皿，采样结束后，至于4℃保存，等待细菌内毒素检测。
[0055]
2.细菌内毒素检测：
[0056]
细菌内毒素检测方法有鲎试剂凝胶法(gel
‑
clot)、鲎试剂浊度法(动态/终点)、鲎试剂基质显色法(动态/终点)。本次细菌内毒素含量检测采用新型检测方法，不依赖于鲎试剂的重组c因子内毒素快速检测
‑‑
rfc检测法，rfc可以重组方式表达和纯化c因子，激活的c因子直接作用于荧光底物，可提供更宽的动态范围和更好的分辨率，不需要级联反应中的其它试剂，避免葡聚糖引起的g因子非特异性干扰造成的假阳性，提高了数据的精确度及准确性。
[0057]
(1)、样品预处理：
[0058]
尾排水水样中含有的余氯会干扰内毒素测试结果，需要先投加0.01％的硫代硫酸钠来淬灭水中余氯。此外，水源水进入水厂之前会经过水质调节和预处理，为防止水厂进水中含有预氧化药剂对内毒素测试的干扰，也需要在水厂进水中投加0.01％的硫代硫酸钠来钝化残留的氧化剂。为了防止ph值对内毒素测试的干扰，先用无热原无内毒素的氢氧化钠、盐酸液(ph值＝7)调节水样ph值。
[0059]
(2)、内毒素定量检测：
[0060]
(2
‑
1)制备内毒素工作标准品溶液：取用4支一次性无热原安瓿瓶，在瓶身标明内毒素工作标准品溶液浓度(分别为0.005eu/ml、0.05eu/ml、0.5eu/ml及5eu/ml)，用溶解至20eu/ml的内毒素工作标准品溶液制备系列内毒素标准品溶液(释后的内毒素标准品溶液在2
‑
8℃能稳定8h，须在8h之内使用)。
[0061]
(2
‑
2)加样至测定板：将内毒素工作标准品溶液、10种样品(即集装箱尾排水、广州土塘养殖水、广州土塘尾排水、江苏兴化河蟹养殖场的养殖水、室内养殖水、北京自来水、市
售矿泉水、嗜水气单胞菌纯培养液106cfu(超声破碎)、细菌培养液和100μl阴性对照(无热原水))分别加入到96孔无菌无热原白板相应孔中，通常需要两复孔或三复孔。加样后的96孔板在37
±
1℃的培养箱中，预热10
‑
20min。
[0062]
(2
‑
3)底物试剂制备前，提前30min取出荧光底物溶液、测定缓冲液和rfc酶溶液，使各试剂温度平衡至室温；配制底物试剂，按照5:4:1的比例混合荧光底物溶液、测定缓冲液和rfc酶溶液，轻轻地充分混合，切勿漩涡混合。
[0063]
(2
‑
4)加入底物试剂及荧光检测：取出预热的96孔板，使用八通道移液器向所有样品孔中加入底物试剂，100μl/孔；底物试剂加入后，立即读取时间点零小时的荧光值；将微孔板放在37
±
1℃的培养箱中，孵育一小时后进行时间点一小时的荧光值读数。
[0064]
3.生物热源风险评估：
[0065]
内毒素工作标准溶液浓度为5eu/ml、0.5eu/ml、0.05eu/ml、0.005eu/ml，以内毒素工作标准品溶液浓度的对数为横坐标，净δrfu的对数为纵坐标绘图并进行线性拟合，线性方程为y＝0.9612x+8.2233，r2>0.99，具有良好线性关系(图1)。
[0066]
检测了通过四级屏蔽体系处理后的集装箱系统尾排水中生物热源风险，以其它模式来源(3处养殖水，1处水源水和矿泉水)作为对照。如图2所示，其中矿泉水的内毒素浓度最低，仅为0.001eu/ml，其次为四级屏蔽系统处理后的集装箱系统尾排水中生物热源浓度为0.012eu/ml，四级屏蔽系统处理后的集装箱系统尾排水生物热源与矿泉水中浓度在一个数量级、相差不大，如图3所示，而来源于广州土塘养殖水、广州土塘尾排水中的内毒素浓度高达7.2eu/ml、27.2eu/ml。
[0067]
北京自来水、室内养殖水、江苏兴化河蟹养殖场的养殖水、嗜水气单胞菌纯培养液106cfu(超声破碎)中内毒素浓度为别为9.1eu/ml、15.94eu/ml、13.36eu/ml、37.91eu/ml，其中养殖水中的内毒素较高，主要原因可能是养殖过程中动植物本身携带细菌，外界环境污染也容易引起微生物污染。由此可见，集装箱系统中四级屏蔽系统中上层富氧水及进水中臭氧可以抑制病原甚至将其灭杀，还可以阻断细菌、真菌和病毒等水平传播，最大限度减低生物热源风险。
[0068]
综上可知，本发明采用基于四级屏障体系可有效控制受控式集装箱尾排水中由于致病性细菌产生的内毒素
‑
生物热源风险，使得集装箱尾水中的细菌内毒素含量减少至0.012eu/ml，该生物热源防控技术体系能从技术源头能最大限度保障养殖水产品质量安全，从而保障水环境生态安全。
[0069]
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。