一种提高葡萄叶片抗病性及果实采后耐贮性的方法

1.本发明涉及葡萄种植贮存技术领域，具体而言，涉及一种提高葡萄叶片抗病性及果实采后耐贮性的方法。


背景技术：

2.葡萄以其汁多味美等特点深受广大消费者青睐。葡萄霜霉病是一种流行性真菌病害，多发于低温、多雨等条件下。葡萄染病后，叶片枯萎变黄，无法进行光合作用，同时染病会使果实颗粒小、霉烂、减产等。目前防治霜霉病的主要防治措施为化学性防治，但化学农药会对环境造成危害。随着可持续农业的发展，更有效且环保的新型霜霉病防治方法成为重中之重。另一方面，葡萄果实在采后贮运过程中极易发生落粒、失水、褐变和腐烂等现象，使得商品价值大大降低。合理利用保鲜贮藏技术可以提高葡萄果实耐贮性、延长葡萄供应期，从而提高鲜食葡萄经济效益。自然状态下影响葡萄果实耐贮性的内在因素主要有呼吸作用、水分代谢、内源激素和酶活性的变化等，外在因素主要为病菌侵染。葡萄贮藏期的主要病害为灰霉病、青霉病和酸腐病等真菌性病害，其中灰霉菌在低温条件下仍能生长繁殖，其发病力最强，严重时能给贮藏葡萄带来毁灭性的伤害。目前葡萄的保鲜技术有很多，如低温冷藏、辐射、so2类保鲜剂、臭氧保鲜等；其中低温和so2保鲜在农业生产中最为常用，但过量的so2会引起葡萄发生漂白、风味裂变伤害，并危害人体健康。因此，寻找和开发so2保鲜剂的替代品一直是科研人员的工作重点。
3.油菜素甾醇是在自然界中广泛存在的第六大类植物激素，具有高效、无毒、作用范围广等特点。油菜素内酯可以有效提高葡萄叶片抗霜霉病的能力和采后果实的耐贮性和品质，是一种天然的生物抑菌剂和保鲜剂。
4.发明申请(公告号cn112205459a)公开了一种葡萄流相防腐保鲜技术与装备，采前在叶片和果实表面喷施品质诱导剂，其中b组份溶剂组成为：br,吲哚乙酸，赤霉酸，油菜素内酯，meja和过氧化氢。该技术方案可显著提高葡萄贮藏期和品质。但是该技术相对复杂，需结合配套技术才能取得良好效果，包括采前品质调控、无伤采收、简易隧道高湿差压遇冷、相温库流相防腐保存、贮藏期间so2间歇流相熏脱，如此工艺复杂，提高了生产成本。
5.发明(公告号cn106720256b)公开了一种葡萄贮藏保鲜方法，葡萄采摘后使用抑霉唑硫酸盐处理葡萄，于
‑
1.0～1.0℃温度冷库中储存。本发明提高了葡萄的储存时间且不会破坏色泽和质感。该技术温度控制在0度左右，对冷库要求较高，功耗较大，提高了成本。且此种试剂只适用于采后处理，未能兼容到采前的品质调控。
6.发明(公告号cn107889879b)公开了一种葡萄绿色精准防腐保鲜方法，采前绿色保鲜剂喷雾处理，采后快速预冷，并1
‑
mcp处理，再经过一系列复杂工艺后，去掉外包装进行高浓度1
‑
mcp处理后商品化包装。本发明可显著减少葡萄霉腐率、提高品质。但是该技术工艺复杂，成本较高，且用时较长；包装前高浓度1
‑
mcp处理有溶剂残留，存在食品安全隐患；此绿色保鲜剂同样也不能适用于采前品质调控。


技术实现要素：

7.本发明在于提供一种提高葡萄叶片抗病性及果实采后耐贮性的方法，其能够缓解上述问题。
8.为了缓解上述的问题，本发明采取的技术方案如下：
9.本发明提供了一种提高葡萄叶片抗病性及果实采后耐贮性的方法，包括：
10.制备两类24
‑
表油菜素内酯溶液，第一类24
‑
表油菜素内酯溶液的内酯浓度为0.5mg
·
l
‑1，第二类24
‑
表油菜素内酯溶液的内酯浓度为0.4mg
·
l
‑1；
11.在夏季雨季来临前，选择天气晴朗的早上或傍晚用第一类24
‑
表油菜素内酯溶液喷施一次正在生长的葡萄叶片，若葡萄叶片有霜霉病，则隔天再喷施一次；
12.在采摘葡萄果实的前1周，禁止对葡萄灌水，将采摘的完整的葡萄果穗浸泡在第二类24
‑
表油菜素内酯溶液一分钟，待葡萄充分晾干后装于pe保鲜袋中，放于4℃或者20℃环境中贮藏。
13.在本发明的一较佳实施方式中，所述24
‑
表油菜素内酯溶液的制备方法是：采用乙醇溶解24
‑
表油菜素内酯，根据内酯浓度要求，将清水和溶解后的24
‑
表油菜素内酯按比例放于一起，并在室温下搅拌均匀，使24
‑
表油菜素内酯充分溶解混匀于水中。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果为：在采摘葡萄前，选用内酯浓度0.5mg
·
l
‑1的24
‑
表油菜素内酯溶液对葡萄叶片进行喷施，大大提高了葡萄叶片的抑菌抗病性，利于长出品质好且耐贮性较好的葡萄，选用内酯浓度0.4mg
·
l
‑1的24
‑
表油菜素内酯溶液对采摘后的葡萄进行浸泡，晾干后装袋在4℃或者20℃环境中贮藏，进一步大大的提高了葡萄耐贮性；本发明方法为目前所知的最优方法，工艺简单，大大的节约了成本，有利于广泛推广应用。
15.为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举本发明实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
17.图1表示了不同处理方式对葡萄叶片过氧化氢含量的影响；
18.图2表示了不同处理方式对葡萄叶片6种酶活性的影响；
19.图3表示了不同处理方式对葡萄叶片发病的影响；
20.图4表示了4℃和20℃下24
‑
表油菜素内酯处理后葡萄果实可溶性固形物和可滴定酸含量的变化；
21.图5表示了4℃和20℃下24
‑
表油菜素内酯处理后葡萄果实的落粒率、腐烂率、失重率的变化；
22.图6表示了4℃和20℃下24
‑
表油菜素内酯处理后葡萄果实的果刷拉力和果实硬度的变化；
23.图7表示了4℃和20℃下24
‑
表油菜素内酯处理后葡萄果实的呼吸强度和乙烯释放
量的变化；
24.图8表示了4℃和20℃下24
‑
表油菜素内酯处理后葡萄灰霉病的发病率和病情指数的变化。
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
26.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.本发明公开了一种提高葡萄叶片抗病性及果实采后耐贮性的方法，包括：在夏季雨季来临前(本试验地区时间通常为7月下旬)，选择天气晴朗的早上或傍晚用0.5mg
·
l
‑124
‑
表油菜素内酯溶液喷施一次正在生长的葡萄叶片，若葡萄叶片有霜霉病，则隔天再喷施一次。
28.为了对本发明方法的效果进行说明，现以赤霞珠离体葡萄叶片为试验材料，选择长势一致、良好的植株，带柄采集梢尖下第3
‑
6节位健康叶片，将采集的葡萄叶片用0.01％次氯酸钠溶液浸泡5
‑
10min后，用无菌水冲洗3遍，擦干后分为a、b、c三组，其中a组为对照组叶片，b、c组均为实验组叶片。配制内酯浓度为0.5mg
·
l
‑1的24
‑
表油菜素内酯(ebr)溶液，以及孢子浓度为5
×
105个
·
ml
‑1的霜霉菌孢子悬浮液备用。
29.记对a组葡萄叶片的处理方法为ck，包括：只接种霜霉菌，均匀喷施1ml霜霉菌孢子悬浮液至a组葡萄叶片，将处理后的叶片置于垫有湿润滤纸的培养皿中，置于白天温度22℃、湿度95％、光照强度1000lx和夜晚温度20℃、湿度90％、无光照的人工气候箱中。
30.记对b组葡萄叶片的处理方法为ebr2，包括：将霜霉菌孢子悬浮液于5000r
·
min
‑1下离心后，除去上层清液，并加入等体积0.5mg
·
l
‑1ebr溶液，保持孢子悬浮液浓度为5
×
105个
·
ml
‑1，摇匀后均匀喷施1ml至b组葡萄叶片；
31.记对c组葡萄叶片的处理方法为ebr1，包括：将c组葡萄叶片的叶柄斜剪，之后将c组葡萄叶片浸没在配置好的0.5mg
·
l
‑1ebr溶液中6h，之后向c组葡萄叶片均匀喷施1ml霜霉菌孢子悬浮液；
32.对于a、b、c三组葡萄叶片，在接种霜霉菌后16h、24h、72h、120h分别取样，进行发病率和病情指数统计(每组取15片叶)以及相关理化指标检测。
33.从图1可以看出，整个接种时间段内，各处理叶片过氧化氢含量总体呈现先升高后降低的趋势；与对照组处理方式(ck)相比，两种方式的ebr处理均使赤霞珠葡萄叶片过氧化氢含量显著降低，且先用ebr预处理后接种霜霉菌(ebr1)使叶片过氧化氢含量降低幅度较大，与用ebr处理同时接种霜霉菌(ebr2)的叶片过氧化氢含量相比呈显著性差异；ebr1和ebr2处理使叶片过氧化氢含量平均比ck降低15.74％和8.29％。
34.从图2a可以看出，整个接种时间段内，各处理叶片过氧化氢酶(cat)活性总体呈现
先升高后降低的趋势；与ck相比，两种方式的ebr处理均使赤霞珠叶片cat活性升高，且ebr1处理叶片cat活性升高幅度较大，与ck及ebr2叶片的cat活性相比呈显著性差异；ebr1和ebr2处理使叶片cat活性平均比ck升高35.31％和9.51％。
35.从图2b可以看出，整个接种时间段内，各处理叶片过氧化物酶(pod)活性总体呈现先升高后降低的趋势；与ck相比，两种方式的ebr处理均使赤霞珠葡萄叶片pod活性显著升高(除24h外)，且ebr1处理使叶片pod活性升高幅度较大，与ebr2处理叶片pod活性相比呈显著性差异；ebr1和ebr2处理使叶片pod活性平均比ck升高26.84％和17.68％。
36.从图2c可以看出，整个接种时间段内，各处理叶片超氧化物歧化酶(sod)活性总体呈现先升高后降低的趋势；与ck相比，两种方式的ebr处理均使赤霞珠葡萄叶片sod活性显著升高，且ebr1处理使叶片sod活性升高幅度较大(除16h外)，与ebr2处理叶片sod活性相比呈显著性差异；ebr1和ebr2处理使叶片sod活性平均比ck升高55.99％和50.40％。
37.从图2d可以看出，整个接种时间段内，各处理叶片苯丙氨酸解氨酶(pal)活性总体呈现先升高后降低的趋势，并在24h达到峰值；与ck相比，两种方式的ebr处理均使赤霞珠葡萄叶片pal活性显著升高(除16h外)，且ebr1处理使叶片pal活性升高幅度较大，与ebr2处理叶片pal活性相比呈显著性差异(除120h外)；ebr1和ebr2处理使葡萄叶片pal活性平均比ck升高30.60％和24.04％。
38.从图2e可以看出，整个接种时间段内，各处理叶片β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶活性总体呈现先升高后降低趋势，并于72h达到峰值；与ck相比，两种方式的ebr处理均使赤霞珠葡萄叶片β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶活性升高，且ebr1处理使叶片β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶活性升高幅度较大，与ebr2处理叶片β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶活性相比呈显著性差异(除120h)；ebr1和ebr2处理使葡萄叶片β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶活性平均比ck升高27.44％和27.51％。
39.从图2f可以看出，整个接种时间段内，各处理叶片几丁质酶活性总体呈现先升高后降低趋势；与ck相比，两种方式的ebr处理均使赤霞珠葡萄叶片几丁质酶活性显著升高(除24h外)，且ebr1处理使叶片的几丁质酶活性升高幅度较大，与ebr2处理叶片几丁质酶活性相比呈显著性差异(除72h外)；ebr1和ebr2处理使葡萄叶片几丁质酶活性平均比ck升高35.80％和30.46％。
40.从图3(a)可以看出，接种霜霉菌第5天(120h)，肉眼即可观察到受霜霉菌侵染的叶片上不同程度长出孢囊梗。从图3(b)可以看出，ebr1处理叶片发病率明显降低；从图3(c)可以看出，两种方式ebr处理均使叶片病情指数显著降低，且ebr1处理叶片病情指数降低幅度较大。
41.本发明方法，在采摘葡萄果实的前1周，禁止对葡萄灌水，如遇大雨，则顺延一周后采摘果实。短期贮藏果实。成熟度以9成为宜，着色在90％以上。手工采摘为宜，轻拿轻放，装入无伤周转箱里。将采摘的完整的葡萄果穗浸泡在0.4mg
·
l
‑124
‑
表油菜素内酯溶液一分钟，待葡萄充分晾干后装于pe保鲜袋中，放于4℃或者20℃环境中贮藏。
42.为了进一步对本发明方法的效果进行说明，选取72穗大小和成熟度基本一致的红地球葡萄，试验共设4种处理葡萄果实的方式，分别记为c1、c2、c3、c4，每种处理方式处理3组葡萄果实，每组红地球葡萄果实使用6穗。
43.c1中，果穗用0.4mg/lebr均匀浸泡1min，待葡萄自然晾干后装于pe保鲜袋中，于4℃冷库中贮藏，每15d采样一次，共采样4次，用于测定品质指标。
44.c2中，果穗用清水均匀浸泡1min，待葡萄自然晾干后装于pe保鲜袋中，于4℃冷库中贮藏，每15d采样一次，共采样4次，用于测定品质指标。
45.c3中，果穗用0.4mg/lebr均匀浸泡1min，待葡萄自然晾干后装于pe保鲜袋中，于20℃的培养箱(湿度为45％，不进行光照)中贮藏，每4d采样一次，共采样4次，用于测定品质指标。
46.c4中，果穗用清水均匀浸泡1min，待葡萄自然晾干后装于pe保鲜袋中，于20℃的培养箱(湿度为45％，不进行光照)中贮藏，每4d采样一次，共采样4次，用于测定品质指标。
47.另选择果粒健康，大小均匀的果穗用于灰霉菌侵染试验。将果粒从果穗上剪下(带0.5cm果梗)并混匀，试验共设4种处理葡萄果实的方式，分别记为c5、c6、c7、c8，每种处理方式处理3组葡萄果实，每组红地球葡萄果实使用70粒。
48.c5中，果粒用0.4mg/lebr均匀浸泡30s，待葡萄果粒自然晾干后置于垫有湿纸的铝盘里，6h后均匀地喷施10ml霉菌浓度为106cfu/ml的葡萄灰霉菌悬浮液。灰霉菌接种结束后，将铝盘用保鲜膜密封，并置于4℃冷库，每7d采样一次，共采样5次，用于测定灰霉病发病率、病情指数和抗氧化酶活性等相关指标。
49.c6中，果粒用清水均匀浸泡30s，待葡萄果粒自然晾干后置于垫有湿纸的铝盘里，6h后均匀地喷施10ml霉菌浓度为106cfu/ml的葡萄灰霉菌悬浮液。灰霉菌接种结束后，将铝盘用保鲜膜密封，并置于4℃冷库，每7d采样一次，共采样5次，用于测定灰霉病发病率、病情指数和抗氧化酶活性等相关指标。
50.c7中，果粒用0.4mg/lebr均匀浸泡30s，待葡萄果粒自然晾干后置于垫有湿纸的铝盘里，6h后均匀地喷施10ml霉菌浓度为106cfu/ml的葡萄灰霉菌悬浮液。灰霉菌接种结束后，将铝盘用保鲜膜密封，并置于20℃培养箱中，每3d采样一次，共采样5次，用于测定灰霉病发病率、病情指数和抗氧化酶活性等相关指标。
51.c8中，果粒用清水均匀浸泡30s，待葡萄果粒自然晾干后置于垫有湿纸的铝盘里，6h后均匀地喷施10ml霉菌浓度为106cfu/ml的葡萄灰霉菌悬浮液。灰霉菌接种结束后，将铝盘用保鲜膜密封，并置于20℃培养箱中，每3d采样一次，共采样5次，用于测定灰霉病发病率、病情指数和抗氧化酶活性等相关指标。
52.由图4可知，在葡萄贮藏初期，果实可溶性固形物含量保持稳定或出现小幅度升高，但随着贮藏时间的延长，葡萄果实可溶性固形物含量逐渐下降。在4℃和20℃贮藏条件下，与第二次采样相比，第四次采样的葡萄可溶性固形物下降幅度均为5.8％左右，ebr处理的葡萄果实可溶性固形物含量与ck之间无显著差异。由于呼吸作用消耗有机酸，因而贮藏期间可滴定酸含量逐渐下降，在第四次采样，4℃+ck、4℃+ebr、20℃+ck、20℃+ebr四组处理可滴定酸含量分别较贮藏第一次采样下降了23.0％、20.8％、13.5％、13.5％；但在4℃和20℃贮藏条件下，ebr处理果实可滴定酸含量与ck之间差异不显著。说明ebr处理对贮藏期间果实可溶性固形物与可滴定酸含量均无显著影响，可保持葡萄果实的品质。
53.由图5可知，在4℃贮藏条件下，贮藏第15d，葡萄出现轻微腐烂现象，ebr处理的葡萄果实腐烂率、落粒率和失重率与ck之间均无显著差异；随着贮藏到第30d时，ck与ebr处理葡萄腐烂率和落粒率均迅速升高，但与4℃对照相比，ebr处理可显著抑制葡萄的腐烂和落粒，腐烂率较ck降低了45.1％，落粒率降低了89.0％。随着贮藏时间延长，ebr作用效果逐渐减弱。贮藏末期(60d)，ebr处理组葡萄落粒率和失重率显著低于ck，分别较ck降低了41.2％
和31.2％，但腐烂率与ck之间差异不显著。在20℃贮藏条件下，贮藏16d内ebr处理的葡萄果实腐烂率均显著低于ck。在贮藏前12d，ebr处理的葡萄果实腐烂率低于5％，在贮藏末期(第16d)，ebr处理组腐烂率较ck降低46.5％；同时，在20℃贮藏条件下，ebr处理对贮藏前期(贮藏第4d与贮藏第8d)葡萄果实的落粒率和失重率无显著影响，但在贮藏第16d，ebr处理可显著降低落粒率和失重率，与ck相比，降低幅度分别为82.1％和17.3％。同时，贮藏第16d，20℃贮藏的葡萄腐烂率、落粒率、失重率均显著低于4℃贮藏的葡萄。
54.由图6可知，随着贮藏时间延长，葡萄果刷拉力和果实硬度均逐渐降低。在4℃贮藏条件下，前45d ebr处理葡萄果刷拉力和果实硬度与ck均无显著差异；在贮藏末期(第60d)，ck处理的果刷拉力和果实硬度迅速降低，而ebr处理使葡萄果刷拉力和果实硬度分别比ck提高18.4％和14.7％，且差异均达显著水平。在20℃贮藏条件下，贮藏前期ebr处理的葡萄果实果刷拉力与ck无显著差异；贮藏末期(16d)ebr处理组果刷拉力显著高于ck，提高幅度为8.1％；在整个贮藏阶段ebr处理使葡萄果实硬度均大于ck，但差异不显著。说明ebr处理可以提高贮藏葡萄果刷拉力和果实硬度，从而延长贮藏期、保证商品性。此外，贮藏第16d，20℃贮藏的果刷拉力和果实硬度均显著低于4℃贮藏的葡萄。葡萄果刷是浆果中的维管束，是向浆果输送营养的通道，具有固着果肉的作用，因此耐拉力强，则葡萄浆果不易脱落，耐运输和贮藏。硬度是指果肉抗压力的强弱，果肉的硬度与细胞之间原果胶的含量成正比。在采后随着贮藏时间的延长，硬度逐渐下降，主要是因为中胶层细胞之间的原果胶在原果胶酶或多聚半乳糖醛酸酶的作用下转变为果胶和果胶酸，它们进一步变为小分子糖以至细胞分离，引起果实组织变软。ebr处理能减缓贮藏期果实硬度的降低，是由于ebr抑制了果实的基础代谢。
55.由图7可知，随着贮藏时间的延长，葡萄果实呼吸强度和乙烯释放量出现不同程度的上升。在4℃的贮藏条件下，前30d内ebr处理使葡萄果实呼吸强度与ck间无显著差异，但在贮藏后30d，与ck相比，ebr处理使果实呼吸强度显著降低，在第60d时，ebr处理使葡萄果实呼吸强度比ck降低11.5％。在20℃贮藏条件下，在贮藏过程中ebr处理使果实的呼吸强度始终低于ck。在贮藏前8d，ebr处理的葡萄果实呼吸强度与ck无显著差异；但在贮藏后期，两者之间差异显著，在贮藏末期(第16d)ebr处理的葡萄果实呼吸强度较ck降低8.2％；在4℃和20℃的贮藏条件下，ebr和ck的乙烯释放量均无显著性差异。说明ebr处理可以有效抑制葡萄的呼吸作用，但对乙烯释放量无显著影响。同时，贮藏第16d，20℃贮藏的葡萄呼吸强度与乙烯释放量均显著高于4℃贮藏的葡萄。呼吸作用是果蔬贮藏期最重要的新陈代谢活动，降低果蔬采后的呼吸速率可显著提高果蔬的贮藏品质。与本试验研究结果一致，油菜素内酯处理可以抑制低温贮藏黄花菜的呼吸强度。
56.如图8所示，在接种灰霉菌后，红地球葡萄贮藏期间灰霉病发病率和病情指数逐渐上升，且前期升高速率较缓，后期升高速率加快。在4℃和20℃下，ebr处理使葡萄果实发病率和病情指数均显著低于ck，在贮藏末期病情指数比ck分别降低41.1％和50.5％。24
‑
表油菜素内酯可降低霜霉菌侵染下葡萄幼苗的发病率和病情指数。说明ebr处理与葡萄响应真菌病害的应答反应密切相关。贮藏第16d，20℃贮藏的葡萄灰霉病发病率和病情指数均显著高于4℃贮藏的葡萄。表明低温贮藏抑制灰霉病的发病。
57.综上所述，本发明方法使用24
‑
表油菜素内酯作为保鲜剂，高效、无毒，安全，既能抑菌又可保鲜，多效合一，多效并措，全面提高葡萄果实采前和采后果实品质，对浓度和处
理方式进行优化，选用最优方法，简化工艺，节约成本，有利于推广应用。
58.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。