一种毒杀线虫的药物

1.本发明涉及线虫防治技术领域，特别是涉及一种毒杀线虫的药物。


背景技术：

2.甲基丁香酚主要存在于细辛、肉豆蔻等中药材的提取物中，是一种已知化合物可以从市场上购买，结构式如式(1)所示：
[0003][0004]
植物寄生线虫是农业生产上的重要病原物之一，也是一种高度专化型的植物固定内寄生线虫。通常造成寄主植株根部肿大，呈瘤状或根结状并导致病根腐烂，地上部分表现为植株矮小，叶片枯黄，萎蔫而死，严重降低农作物产量及质量。线虫病在全球范围内每年对农业生产造成的经济损失超过1000亿美元。二龄幼虫对植物根部具有很强的侵染性，线虫找到寄主植物的根后，从根冠部位表皮侵入并将其唾液注射在根部，使受侵染的细胞发育成“巨型细胞”，最终在根部表面形成明显的根瘤。线虫逐渐蜕皮发育为成虫，雄虫发育完成后离开寄主根部，雌虫在根内组织中以寄生方式生存。当环境适宜时，雌虫以孤雌生殖或者两性交配进行产卵，卵再次孵化为二龄幼虫，并侵染植株。常用防治线虫的手段主要包括农业防治、物理防治、化学防治以及生物防治。其中化学防治在生产中使用的最为广泛，但其缺点是农产品中农药残留超标，对人和动物造成毒害作用，并且它们能够破坏臭氧层(如溴甲烷)进而加剧环境污染。开发一种针对植物寄生线虫的高效、环保的天然生物制剂具有十分重要的意义。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种毒杀线虫的药物，以解决上述现有技术存在的问题，甲基丁香酚是一种天然植物化合物，对秀丽隐杆线虫有很好的毒杀效果，抑制秀丽隐杆线虫的寿命、产卵数以及乙酰胆碱酯酶活性，具有低毒、安全和环境友好的特性，是目前少有的优秀杀虫剂的替代品，具有很好的杀线虫效果。
[0006]
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
[0007]
本发明的技术方案之一：甲基丁香酚在制备毒杀线虫的药物中的应用。
[0008]
更进一步地，所述甲基丁香酚可以从许多中药材中提取获得，是一种天然植物化合物。
[0009]
更进一步地，所述中药材包括细辛或肉豆蔻。
[0010]
进一步地，所述线虫为植物寄生线虫。
[0011]
进一步地，所述线虫为秀丽隐杆线虫。
[0012]
秀丽隐杆线虫是一种生活在土壤生态系统中的线性动物，通体透明、结构简单，成虫体长约为1mm，通常以各种细菌为食。秀丽隐杆线虫是第一个进行全基因组测序的生物，对环境改变敏感，一旦受到外界环境的肋迫，会表现出严重的行为、生长发育和生殖缺陷。且其在进化上与植物寄生线虫关系最近，因此，本发明采用秀丽隐杆线虫作为植物寄生线虫进行研究。
[0013]
进一步地，所述甲基丁香酚在制备抑制秀丽隐杆线虫的寿命、产卵数或乙酰胆碱酯酶活性的药物中的应用。
[0014]
进一步地，所述甲基丁香酚在制备防治药用植物、果树园艺作物或蔬菜作物线虫病害的药物中的应用。
[0015]
本发明的技术方案之二：一种毒杀线虫的药物，包括上述的甲基丁香酚。
[0016]
进一步地，还包括分散介质、分散剂、乳化剂、润湿剂、增稠剂、ph缓冲剂、消泡剂、防冻剂、崩解剂、粘结剂或填料中的一种或多种。
[0017]
更进一步地，所述分散剂为体积分数为5％的吐温80。
[0018]
更进一步地，所述甲基丁香酚与体积分数为5％的吐温80的比例为10mg：1～10ml。
[0019]
进一步地，所述药物的剂型包括乳油、水分散粒剂、粉剂、可分散油悬浮剂、悬浮剂、微乳剂、颗粒剂或微胶囊剂。
[0020]
本发明公开了以下技术效果：
[0021]
本发明的甲基丁香酚对线虫的具有毒杀作用，对秀丽隐杆线虫有很好的毒杀效果，抑制秀丽隐杆线虫的寿命、产卵数以及乙酰胆碱酯酶活性。
[0022]
本发明的甲基丁香酚对植物寄生线虫有防治作用，同时甲基丁香酚具有低毒、安全和环境友好的特性，是目前少有的优秀杀虫剂的替代品，具有很好的杀线虫效果。
[0023]
本发明的甲基丁香酚是从植物中提取的天然化合物，具有低毒性，低残留，对人类和环境的安全性的特点；可应用于人参、西洋参、三七等药用植物线虫病的防治，也可应用于大田作物小麦、玉米、水稻、马铃薯等植物线虫病的防治；蔬菜作物白菜、番茄、黄瓜等植物线虫病的防治。较好的解决了现有的杀线剂毒性大、环境污染、在作物中的残留等问题，提高了农业生产的安全性。
附图说明
[0024]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]
图1为甲基丁香酚对秀丽隐杆线虫乙酰胆碱酯酶(ache)活性的影响图。
具体实施方式
[0026]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0027]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发
明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0028]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0029]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0030]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0031]
以下实施例采用的秀丽隐杆线虫为野生型秀丽隐杆线虫(caenorhabditis.elegans)n2型，购买。
[0032]
实施例1
[0033]
(1)药物配制：取10mg甲基丁香酚(市售的甲基丁香酚标准品)加入1ml体积分数为5％吐温80水溶液，用涡旋搅拌器涡旋搅拌，配制成浓度为10mg/ml的甲基丁香酚母液。
[0034]
(2)将步骤(1)制备得到的甲基丁香酚母液用溶剂稀释，配制成浓度分别为200mg/l、400mg/l、600mg/l、800mg/l的甲基丁香酚溶液。
[0035]
溶剂的制备方法为：取1.18g的kcl和1.5g的nacl加蒸馏水定容至500ml，121℃高压灭菌，放置室温后取100ml加入5ml的吐温80混合均匀得到溶剂。
[0036]
(3)线虫的制备：用m9缓冲液将ngm培养基中的秀丽隐杆线虫成虫冲洗置于1.5ml的离心管中，4000rpm离心留沉淀，冲洗3次后，再加入1ml的裂解液(1ml体积分数为1％的次氯酸钠+1ml 5mm的氢氧化钠，用前混匀)，剧烈震荡至显微镜下看到虫体破裂即可，离心弃上清，用m9冲洗数次，于缓冲液中20℃孵育过夜，第二天即可得到同期化的线虫，将得到的同期化线虫在ngm培养基培养平皿上培养至l4期。收集同期化的l4期线虫，用于试验分析。
[0037]
ngm培养基培养平皿的制备：准确称取nacl 1.50g，琼脂粉8.50g，胰蛋白胨1.25g，再加入12.5ml 1m pbs缓冲液，蒸馏水定容至500ml，121℃高压蒸汽灭菌20min，在恒温水浴锅中冷却至55℃，在超净工作台中，将其加入0.5ml 1m cacl2溶液、0.5ml 1m mgso4溶液、0.5ml 5mg/ml胆固醇乙醇溶液，混合均匀后倒板，得到培养平皿。
[0038]
a.1m磷酸缓冲液(ph＝6)的配制：精确称取21.66g磷酸二氢钾和9.33g磷酸氢二钾，加入200ml蒸馏水，置于37℃震荡器中下充分溶解，常温放置。
[0039]
b.1m氯化钙溶液的配制：取1.11g氯化钙于50ml离心管中，加入10ml蒸馏水，在121℃条件下灭菌20min，4℃保存。
[0040]
c.1m硫酸镁溶液的配制：取2.4647g mgso4于50ml离心管中，加入10ml蒸馏水，在121℃条件下灭菌20min，4℃保存。
[0041]
d.5mg/ml胆固醇贮备液的配制：称取50mg胆固醇，加无水乙醇10ml，充分溶解后，
用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，4℃保存。
[0042]
(4)取96孔细胞培养板，分成5组，第1组为空白对照，其余4组为甲基丁香酚组，在第1组的每个培养孔中加入150μl步骤(2)中的溶剂，其余4组，每组的每个培养孔中分别加入150μl浓度为200、400、600、800mg/l的甲基丁香酚溶液；然后向每个孔中挑入30条同步化后的l4期线虫，置于20℃生化培养箱培养24h后，在体视显微镜下判断线虫死亡存活情况，用铂丝针轻触秀丽隐杆线虫有反应即视为存活，无反应为死亡，实验重复3次。根据数据结果，采用spss软件计算半数致死浓度(lc
50
)，结果见表1。
[0043]
表1甲基丁香酚对秀丽隐杆线虫的室内毒力测定
[0044]
药剂lc
50
(mg/l)置信区间(mg/l)甲基丁香酚423417～429
[0045]
从表1中可以看出，甲基丁香酚对秀丽隐杆线虫半数致死浓度(lc
50
)为423mg/l，置信区间为417～429mg/l，对线虫有较好的毒杀作用。
[0046]
实施例2
[0047]
(1)药物配制：取10mg甲基丁香酚(市售的甲基丁香酚标准品)加入1ml体积分数为5％吐温80水溶液，用涡旋搅拌器涡旋搅拌，配制成浓度为10mg/ml的甲基丁香酚母液。
[0048]
(2)将步骤(1)制备得到的甲基丁香酚母液用溶剂稀释，配制成浓度分别为42.3mg/l、4.23mg/l、0.423mg/l的甲基丁香酚溶液。
[0049]
溶剂的制备方法为：取1.18g的kcl和1.5g的nacl加蒸馏水定容至500ml，121℃高压灭菌20min，放置室温后取100ml加入5ml的吐温80混合均匀得到溶剂。
[0050]
(3)线虫的制备：用m9缓冲液将平板中的秀丽隐杆线虫成虫冲洗置于1.5ml的离心管中，4000rpm离心留沉淀，冲洗3次后，再加入1ml的裂解液(1ml体积分数为1％的次氯酸钠+1ml 5mm的氢氧化钠，用前混匀)，剧烈震荡至显微镜下看到虫体破裂即可，离心弃上清，用m9冲洗数次，于缓冲液中20℃孵育过夜，第二天即可得到同期化的线虫，将得到的同期化线虫在ngm培养基培养平皿上培养至l3期。收集同期化的l3期线虫，用于试验分析。
[0051]
(4)取96孔细胞培养板，分成4组，第1组为空白对照，第2组为甲基丁香酚低剂量组，第3组为甲基丁香酚中剂量组，第4组为甲基丁香酚高剂量组；在第1组的每个培养孔中加入150μl步骤(2)中的溶剂，在第2组的每个培养孔中加入150μl浓度为0.423mg/l的甲基丁香酚溶液，在第3组的每个培养孔中加入150μl浓度为4.23mg/l的甲基丁香酚溶液，在第4组的每个培养孔中加入150μl浓度为42.3mg/l的甲基丁香酚溶液；然后向每个孔中挑入8条同步化后的l3期线虫，线虫生长至l4期后，转移到ngm培养基培养平皿中，每个培养基中放入1条，每24h转移1次，直至线虫产卵期结束并记录线虫繁殖的总量，实验重复3次，结果见表2。
[0052]
表2甲基丁香酚对秀丽隐杆线虫产卵数的影响
[0053]
组别剂量(mg/l)产卵数(个)对照
‑‑‑‑‑
260.50
±
6.16甲基丁香酚低剂量242.83
±
8.99甲基丁香酚中剂量223.00
±
12.99甲基丁香酚高剂量150.00
±
8.79
[0054]
从表2中可以看出，甲基丁香酚高中低剂量对秀丽隐杆线虫产卵数均有抑制作用，
且呈剂量依赖性。高剂量的甲基丁香酚给药后的产卵数相较于对照降低了42.42％，具有明显的抑制线虫产卵的作用。
[0055]
实施例3
[0056]
(1)药物配制：取10mg甲基丁香酚(市售的甲基丁香酚标准品)加入1ml体积分数为5％吐温80水溶液，用涡旋搅拌器涡旋搅拌，配制成浓度为10mg/ml的甲基丁香酚母液。
[0057]
(2)将步骤(1)制备得到的甲基丁香酚母液用溶剂稀释，配制成浓度分别为42.3mg/l、4.23mg/l、0.423mg/l的甲基丁香酚溶液。
[0058]
溶剂的制备方法为：取1.18g的kcl和1.5g的nacl加蒸馏水定容至500ml，121℃高压灭菌20min，放置室温后取100ml加入5ml的吐温80混合均匀得到溶剂。
[0059]
(3)线虫的制备：用m9缓冲液将平板中的秀丽隐杆线虫成虫冲洗置于1.5ml的离心管中，4000rpm离心留沉淀，冲洗3次后，再加入1ml的裂解液(1ml体积分数为1％的次氯酸钠+1ml 5mm的氢氧化钠，用前混匀)，剧烈震荡至显微镜下看到虫体破裂即可，离心弃上清，用m9冲洗数次，于缓冲液中20℃孵育过夜，第二天即可得到同期化的线虫，将得到的同期化线虫在ngm培养基培养平皿上培养至l4期。收集同期化的l4期线虫，用于试验分析。
[0060]
(4)取6孔细胞培养板，分成4组，第1组为空白对照，第2组为甲基丁香酚低剂量组，第3组为甲基丁香酚中剂量组，第4组为甲基丁香酚高剂量组；在4组的培养孔中分别加入12.5mg/l的5
‑
fudr，然后在第1组的每个培养孔中加入3ml步骤(2)中的溶剂，在第2组的每个培养孔中加入3ml浓度为0.423mg/l的甲基丁香酚溶液，在第3组的每个培养孔中加入3ml浓度为4.23mg/l的甲基丁香酚溶液，在第4组的每个培养孔中加入3ml浓度为42.3mg/l的甲基丁香酚溶液；然后向每个孔中挑入8条同步化后的l4期线虫，处理4d后，用k.basal溶液将线虫冲洗至离心管中，于4℃1000r/min离心5min，去除上清液，重复清洗2～3次。加0.5ml k.basal溶液重悬线虫，并于冰浴条件下破碎2min。于4℃2000r/min离心10min，取上清液按照试剂盒(厂家：苏州科铭生物技术有限公司)说明书步骤测定线虫体内的ache酶，实验重复3次，结果见图1。
[0061]
k.basal溶液的配置方法：取5.85g的nacl、1.31g的k2hpo4·
3h2o和6g的kh2po4，加入蒸馏水定容至1l，121℃高压灭菌得到k.basal溶液。
[0062]
从图1中可以看出，甲基丁香酚高中低剂量对秀丽隐杆线虫ache酶均有抑制作用，且呈剂量依赖性。高剂量的甲基丁香酚给药后的ache酶相较于对照减少了77.09％，具有明显的抑制线虫ache酶的作用。
[0063]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。