一种胞外多聚物抑制剂及其应用

1.本发明涉及膜污染清除技术领域，具体涉及一种胞外多聚物抑制剂及其应用。


背景技术：

2.细菌生物膜广泛存在于各种食品和食品加工表面，细菌生物膜不仅可以引起食源性疾病爆发，与食品腐败也有着显著的相关性，其严重制约了食品工业的健康发展。生物膜是细菌在生长过程中，为了适应生存环境，由细菌自身分泌的多糖、dna、蛋白质等胞外多聚物(extracellular polymeric substances，eps)组成的一个具有三维立体空间结构的生态群落。在生物膜的保护下，细菌呈现出比浮游细菌高达1000倍的耐药能力，显著增加食品安全风险。因此，急需寻找一种对细菌生物膜有效作用的生物活性物质。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明提出一种胞外多聚物抑制剂及其应用，该胞外多聚物抑制剂可安全高效地清除食源性细菌生物膜的形成。
4.为了实现上述目的，本发明的实施例在一方面提出了一种胞外多聚物抑制剂，其包括：环腺苷酸，5
′‑
胞苷酸和5
′‑
腺苷酸。
5.根据本发明实施例的一种胞外多聚物抑制剂，通过环腺苷酸、5
′‑
胞苷酸和5
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腺苷酸三者的协同配合，可通过作用于生物膜形成关键蛋白从而抑制食源性细菌产生胞外多聚物进而抑制生物膜的形成。
6.可选地，所述环腺苷酸的浓度为0.625mg/ml～2.5mg/ml，所述5
′‑
胞苷酸的浓度为0.5mg/ml～2mg/ml，5
′‑
腺苷酸0.5mg/ml～2mg/ml。
7.本发明的实施例在另一方面提出了上述胞外多聚物抑制剂在清除食源性细菌生物膜中的应用。
8.根据本发明实施例的胞外多聚物抑制剂在清除食源性细菌生物膜中的应用，采用上述的胞外多聚物可抑制食源性细菌产生胞外多聚物进而抑制生物膜的形成。
9.可选地，所述食源性细菌包括食源性致病菌或食源性致腐菌。
10.可选地，所述食源性细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌、波罗海希瓦氏菌。
11.可选地，包括：向食源性细菌生物膜中投加所述胞外多聚物和二氧化氯溶液。
12.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
13.图1为根据本发明实施例的胞外多聚物对生物膜的清除效果；
14.图2为根据本发明实施例的胞外多聚物对食源性细菌的杀菌效果。
具体实施方式
15.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
16.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
17.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
18.本发明的室温均为25℃。
19.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
20.实施例1
21.(1)用无菌水配制环腺苷酸母液，浓度为10mg/ml。
22.(2)用无菌水配制5
′‑
胞苷酸母液，浓度为10mg/ml。
23.(3)用无菌水配制5
′‑
腺苷酸母液，浓度为10mg/ml。
24.(4)用无菌水配制二氧化氯母液，浓度为20mg/ml。
25.(5)将过夜培养的大肠杆菌以1:100接种到含有lb培养基的培养皿中，震荡48h，进行生物膜培养。
26.(6)倒掉培养液，用无菌水清洗两遍，再加入胞外多聚物抑制剂和二氧化氯溶液，使得体系中环腺苷酸最终浓度为2.0mg/ml，5
′‑
胞苷酸为1.0mg/ml，5
′‑
腺苷酸为0.5mg/ml，二氧化氯溶液为0.05mg/ml；常温轻轻震荡反应0.5h，完成生物膜的清除。
27.实施例2
28.(1)用无菌水配制环腺苷酸母液，浓度为10mg/ml。
29.(2)用无菌水配制5
′‑
胞苷酸母液，浓度为10mg/ml。
30.(3)用无菌水配制5
′‑
腺苷酸母液，浓度为10mg/ml。
31.(4)用无菌水配制二氧化氯母液，浓度为20mg/ml。
32.(5)将过夜培养的金黄色葡萄球菌以1:100接种到含有lb培养基的培养皿中，震荡48h，进行生物膜培养。
33.(6)倒掉培养液，用无菌水清洗两遍，再加入胞外多聚物抑制剂和二氧化氯溶液，使得体系中环腺苷酸最终浓度为2.5mg/ml，5
′‑
胞苷酸为1.5mg/ml，5
′‑
腺苷酸为1mg/ml，二氧化氯溶液为0.05mg/ml；常温轻轻震荡反应0.5h，完成生物膜的清除。
34.实施例3
35.(1)用无菌水配制环腺苷酸母液，浓度为10mg/ml。
36.(2)用无菌水配制5
′‑
胞苷酸母液，浓度为10mg/ml。
37.(3)用无菌水配制5
′‑
腺苷酸母液，浓度为10mg/ml。
38.(4)用无菌水配制二氧化氯母液，浓度为20mg/ml。
39.(5)将过夜培养的荧光假单胞菌以1:100接种到含有lb培养基的培养皿中，震荡48h，进行生物膜培养。
40.(6)倒掉培养液，用无菌水清洗两遍，再加入胞外多聚物抑制剂和二氧化氯溶液，使得体系中环腺苷酸最终浓度为1.5mg/ml，5
′‑
胞苷酸为1.0mg/ml，5
′‑
腺苷酸为1.5mg/ml，二氧化氯溶液为0.025mg/ml；常温轻轻震荡反应0.5h，完成生物膜的清除。
41.实施例4
42.(1)用无菌水配制环腺苷酸母液，浓度为10mg/ml。
43.(2)用无菌水配制5
′‑
胞苷酸母液，浓度为10mg/ml。
44.(3)用无菌水配制5
′‑
腺苷酸母液，浓度为10mg/ml。
45.(4)用无菌水配制二氧化氯母液，浓度为20mg/ml。
46.(5)将过夜培养的波罗的海希瓦氏菌以1:100接种到含有lb培养基的培养皿中，震荡48h，进行生物膜培养。
47.(6)倒掉培养液，用无菌水清洗两遍，再加入胞外多聚物抑制剂和二氧化氯溶液，使得体系中环腺苷酸最终浓度为1.25mg/ml，5
′‑
胞苷酸为1.0mg/ml，5
′‑
腺苷酸为1.25mg/ml，二氧化氯溶液为0.025mg/ml；常温轻轻震荡反应0.5h，完成生物膜的清除。
48.对比例1
49.(1)将过夜培养的大肠杆菌以1:100接种到含有lb培养基的培养皿中，震荡48h，进行生物膜培养。
50.(2)倒掉培养液，用无菌水清洗两遍，再加入0.05mg/ml的二氧化氯溶液；常温轻轻震荡反应0.5h。
51.对比例2
52.(1)将过夜培养的大肠杆菌以1:100接种到含有lb培养基的培养皿中，震荡48h，进行生物膜培养。
53.(2)倒掉培养液，用无菌水清洗两遍，再加入0.05mg/ml的二氧化氯溶液；常温轻轻震荡反应0.5h。
54.对比例3
55.(1)将过夜培养的大肠杆菌以1:100接种到含有lb培养基的培养皿中，震荡48h，进行生物膜培养。
56.(2)倒掉培养液，用无菌水清洗两遍，再加入0.025mg/ml的二氧化氯溶液；常温轻轻震荡反应0.5h。
57.对比例4
58.(1)将过夜培养的大肠杆菌以1:100接种到含有lb培养基的培养皿中，震荡48h，进行生物膜培养。
59.(2)倒掉培养液，用无菌水清洗两遍，再加入0.025mg/ml的二氧化氯溶液；常温轻轻震荡反应0.5h。
60.试验例
61.对上述实施例1～4和对比例1～4进行生物膜清除效果和杀菌效果测试：
62.生物膜测试：倒掉生物膜清除上清液，轻柔地用无菌水清洗两遍，将培养皿置于80
℃烘箱烘干，加入0.1％结晶紫溶液，染色10min。吸净染液，用无菌水清洗两遍，将培养皿置于80℃烘箱烘干。加入95％乙醇进行溶解，在595nm下测吸光度。
63.杀菌测试：倒掉生物膜清除上清液，轻柔地用无菌水清洗两遍，用细胞刮刀将粘附在培养皿底的细菌收集起来，通过梯度稀释涂布法计算生物膜中存活的细菌菌落数。
64.其中，对照组为仅有对应浓度的二氧化氯溶液。
65.结果如图1和图2所示，由图1可知，在胞外多聚物抑制剂的作用下，实施例1～4的生物膜均被显著清除；由图2可知，在胞外多聚物抑制剂的作用下，实施例1～4生物膜中的细菌数显著下降。
66.综上，根据本发明的实施例制得的胞外多聚物抑制剂具有很好的生物膜清除效果和杀菌效果，市场前景广阔。
67.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
68.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。