一种ε-聚赖氨酸微球载体及在少量精子冷冻保存中的应用

一种
ε-聚赖氨酸微球载体及在少量精子冷冻保存中的应用
技术领域
1.本发明属于辅助生殖技术领域，具体涉及一种ε-聚赖氨酸微球载体及在少量精子冷冻保存中的应用。


背景技术：

2.非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia，noa)患者的睾丸不能产生或仅产生极少量的精子，因此难以采用一般取精技术获取足够的精子，临床治疗相当困难，是导致男性不育的重要原因，影响约0.6％的男性或10.0％的不育男性。近年来，随着对noa认识以及研究的深入，睾丸细针穿刺抽吸术、睾丸切开取精术、显微睾丸切开取精术等取精技术发展日渐成熟，联合卵泡内单精子注射技术(icsi)，可使原本不育的noa患者获得自己的生物学后代。临床上icsi治疗周期的妊娠率为50.0％，为了获得妊娠部分患者有可能需要重复数次icsi治疗。临床上睾丸取精是一种有创手术，每次取精都会对睾丸产生损伤，有可能造成睾丸萎缩或功能下降，甚至完全丧失生精功能。因此无精症患者诊断性穿刺获得或icsi治疗周期剩余的少量活动精子(几个或十几个)需要进行冷冻保存，以便在女方取卵日时可以将其复苏进行icsi治疗，大大提高了非梗阻性无精症患者辅助生育治疗的灵活性和可靠性。因此微量精子冷冻保存是提高妊娠成功率的关键技术。
3.少量精子冷冻保存是辅助生殖领域的难题，目前还没有理想的冷冻保存方法在临床上使用。正在研究的少量精子冷冻保存方法有透明带法、薄片法、显微操作针法、微式麦管法等，这些方法都存在材料来源困难、伦理、污染及操作繁琐等问题，无法在临床上大规模推广应用。其中透明带法是较好的少量精子冷冻保存方法，透明带是包绕在卵母细胞外的一层糖蛋白，在卵子发生、卵子保护、阻止多精受精中具有重要作用。运用显微操作技术清除透明带中的内容物，可以作为冷冻保存载体使用，少量精子注入到空透明带内可以获得良好的冷冻保存效果。尽管透明带法冷冻保存精子回收率和活性都在70.0％以上，但该方法也存在一些问题，首先该方法使用的是哺乳动物或人卵透明带，材料来源困难(人卵透明带很难获得)，其次存在伦理争议(icsi治疗时宿主dna有与精子一起被注入人卵的风险)，而且还存在人畜共患病毒感染的危险，所以该方法很难在辅助生殖临床上广泛应用。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明提供一种ε-聚赖氨酸微球载体及在少量精子冷冻保存中的应用，本发明提供的ε-聚赖氨酸微球载体生物相容性良好，对精子活性不产生影响，并且不存在伦理及dna或外来异源性蛋白污染等问题。
5.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种ε-聚赖氨酸微球载体，由海藻酸钠和ε-聚赖氨酸制备而成，载体为中空微球，直径为50～180μm，外壳是海藻酸钠和ε-聚赖氨酸通过静电络合反应形成的聚电解质膜，内核是具有一定粘度的海藻酸钠溶液。
6.进一步的，所述海藻酸钠分子量为70.0～200.0kd，海藻酸钠中古洛糖醛酸：甘露糖醛酸质量比为1.0～3.0，溶液浓度为0.8～2.0wt％，溶液粘度为50.0～150.0mpa
·
s。
7.进一步的，所述ε-聚赖氨酸分子量为5.0～30.0kd，溶液浓度为0.01～0.5wt％。
8.本发明的进一步优选，所述海藻酸钠分子量为10.0～160.0kd，海藻酸钠中古洛糖醛酸：甘露糖醛酸为1.2～2.4，溶液浓度为1.0～1.6wt％，溶液粘度为60.0～120.0mpa
·
s。
9.本发明的进一步优选，所述-聚赖氨酸分子量为5.0～24.0kd，溶液浓度为0.05～0.3wt％。
10.进一步的，所述ε-聚赖氨酸微球载体制备方法包括如下步骤：
11.(1)海藻酸钠加入到生理盐水中高速搅拌使其完全溶解；
12.(2)海藻酸钠溶液以静电液滴法滴入浓度为0.1m氯化钙溶液中钙化30min，形成海藻酸钙凝胶珠；
13.(3)海藻酸钙凝胶珠加入到ε-聚赖氨酸溶液中(海藻酸钙凝胶珠与ε-聚赖氨酸溶液体积比为1:10)，万向摇床震荡使海藻酸钙凝胶与ε-聚赖氨酸进行交联反应，10min后结束交联反应，去离子水清洗去除ε-聚赖氨酸溶液；
14.(4)所述步骤(3)中产物加入到55.0mm的柠檬酸钠溶液中液化5min，液化微球内核形成中空结构，生理盐水清洗3次，即得中空的ε-聚赖氨酸微球载体。
15.本发明同时保护所述ε-聚赖氨酸微球载体在少量精子冷冻保存中的应用。
16.进一步的，所述ε-聚赖氨酸微球载体在少量精子冷冻保存中的应用中，保存精子为睾丸穿刺精子、附睾穿刺精子及严重少精和弱精症患者的精子，使用时精子保存在微球空腔内，每个载体装载精子数量为1～20个，优选为1～10个。
17.进一步的，所述ε-聚赖氨酸微球载体在少量精子冷冻保存中的应用中，微球载体保存在冻存管或麦氏管中，每个冻存管或麦氏管中保存微球载体数量为1～20个，优选1～10个，冻存管或麦氏管保存在液氮中。
18.本发明与现有技术相比的有益效果是：
19.1、本发明提供的ε-聚赖氨酸微球载体所用材料无毒、生物相容性良好，对装载精子活性无影响，有利于保持精子的活性。
20.2、本发明提供的ε-聚赖氨酸微球载体体积较小，在显微操作时很容易找到并抓取精子，有利于保持精子的活性。
21.3、本发明提供的ε-聚赖氨酸微球载体，外壳是聚电解质络合膜，流动性良好，易于icsi操作针穿刺，并且显微操作后能够快速愈合，不形成针眼，不会造成精子丢失。
22.4、本发明提供的ε-聚赖氨酸微球载体强度较高，冻存后形态不变，并保持完整，可以避免精子在冻存及复苏过程中的丢失，精子回收率高。
23.5、本发明提供的ε-聚赖氨酸微球载体制备条件温和，制备过程中不使用有机溶剂，可以避免因有机溶剂残留对冻存精子活性产生影响。
24.6、本发明提供的微球载体制备原料为ε-聚赖氨酸，由于ε-聚赖氨酸具有抑菌作用，可以有效防止微生物污染。
25.7、本发明提供的人造透明带制备工艺简单，易于放大和工业化生产。
附图说明
26.下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明
27.图1为实施例1制备的ε-聚赖氨酸微球载体显微镜下结构图；
28.图2为装载精子的ε-聚赖氨酸微球载体结构图(图2a为装载精子，图2b为取出精子)。
具体实施方式
29.下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
30.实施例1
31.1、本实施例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
32.(1)海藻酸钠加入到生理盐水中高速搅拌使其完全溶解；
33.(2)海藻酸钠溶液以静电液滴法滴入浓度为0.1m氯化钙溶液中钙化30min，形成海藻酸钙凝胶珠；
34.(3)海藻酸钙凝胶珠加入到ε-聚赖氨酸溶液中(海藻酸钙凝胶珠与ε-聚赖氨酸溶液体积比为1:10)，万向摇床震荡使海藻酸钙凝胶与ε-聚赖氨酸进行交联反应，10min后结束交联反应，去离子水清洗去除ε-聚赖氨酸溶液；
35.(4)上述微球载体加入到55.0mm的柠檬酸钠溶液中液化5min，完全液化微球内核形成中空结构，生理盐水清洗3次，即得中空微球载体。
36.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
37.(1)海藻酸钠：分子量为153.0kd，g/m比为1.63，溶液浓度为1.0wt％，溶液粘度为64.8mpa
·
s；
38.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.2wt％。
39.3、微球载体性质：
40.微球粒径：110μm；
41.膜厚度：30μm。
42.对比例1
43.1、本对比例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
44.同实施例1
45.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
46.(1)海藻酸钠：分子量为153.0kd，g/m比为1.63，溶液浓度为1.0wt％，溶液粘度为64.8mpa
·
s；
47.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.1wt％。
48.3、微球载体性质：
49.微球粒径：110μm；
50.膜厚度：20μm。
51.对比例2
52.1、本对比例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
53.同实施例1
54.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
55.(1)海藻酸钠：分子量为153.0kd，g/m比为1.63，溶液浓度为1.0wt％，溶液粘度为64.8mpa
·
s；
56.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.05wt％。
57.3、微球载体性质：
58.微球粒径：110μm；
59.膜厚度：10μm。
60.实施例2
61.1、本实施例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
62.同实施例1
63.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
64.(1)海藻酸钠：分子量为153k.0d，g/m比为1.63，溶液浓度为1.2wt％，溶液粘度为91.5mpa
·
s；
65.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.2wt％。
66.3、微球载体性质：
67.微球粒径：160μm；
68.膜厚度：30μm。
69.对比例3
70.1、本对比例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
71.同实施例1
72.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
73.(1)海藻酸钠：分子量为153.0kd，g/m比为1.63，溶液浓度为1.2wt％，溶液粘度为91.5mpa
·
s；
74.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.1wt％。
75.3、微球载体性质：
76.微球粒径：160μm；
77.膜厚度：20μm。
78.对比例4
79.1、本对比例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
80.同实施例1
81.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
82.(1)海藻酸钠：分子量为153.0kd，g/m比为1.63，溶液浓度为1.2wt％，溶液粘度为91.5mpa
·
s；
83.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.05wt％。
84.3、微球载体性质：
85.微球粒径：160μm；
86.膜厚度：10μm。
87.实施例3
88.1、本实施例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
89.同实施例1
90.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
91.(1)海藻酸钠：分子量为153.0kd，g/m比为1.63，溶液浓度为1.5wt％，溶液粘度为
138.3mpa
·
s；
92.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.2wt％。
93.3、微球载体性质：
94.微球粒径：120μm；
95.膜厚度：30μm。
96.对比例5
97.1、本对比例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
98.同实施例1
99.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
100.(1)海藻酸钠：分子量为153.0kd，g/m比为1.63，溶液浓度为1.5wt％，溶液粘度为138.3mpa
·
s；
101.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16kd，溶液浓度为0.1wt％。
102.3、微球载体性质：
103.微球粒径：120μm；
104.膜厚度：20μm。
105.对比例6
106.1、本对比例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
107.同实施例1
108.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
109.(1)海藻酸钠：分子量为153.0kd，g/m比为1.63，溶液浓度为1.5wt％，溶液粘度为138.3mpa
·
s；
110.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.05wt％。
111.3、微球载体性质：
112.微球粒径：120μm；
113.膜厚度：10μm。
114.实施例4
115.1、本实施例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
116.同实施例1
117.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
118.(1)海藻酸钠：分子量为167.0kd，g/m比为0.67，溶液浓度为1.0wt％，溶液粘度为74.9mpa
·
s；
119.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.2wt％。
120.3、微球载体性质：
121.微球粒径：120μm；
122.膜厚度：30μm。
123.对比例7
124.1、本对比例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
125.同实施例1
126.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
127.(1)海藻酸钠：分子量为167.0kd，g/m比为0.67，溶液浓度为1.0wt％，溶液粘度为74.9mpa
·
s；
128.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.1wt％。
129.3、微球载体性质：
130.微球粒径：120μm；
131.膜厚度：20μm。
132.对比例8
133.1、本对比例提供一种ε-聚赖氨酸微球载体，制备方法如下：
134.同实施例1
135.2、微球载体制备材料性质及制备条件：
136.(1)海藻酸钠：分子量为167.0kd，g/m比为0.67，溶液浓度为1.0wt％，溶液粘度为74.9mpa
·
s；
137.(2)ε-聚赖氨酸：分子量为16.0kd，溶液浓度为0.05wt％。
138.3、微球载体性质：
139.微球粒径：120μm；
140.膜厚度：10μm。
141.实施例5
142.精子冷冻保存实验研究
143.1、精子冷冻保存
144.吸取1滴精子培养液放置于培养皿中形成一个液滴(约0.5μl)，然后加入10.0ml矿物油覆盖液滴，吸取中空微球载体放入精子培养液液滴中，用显微注射针抓取1个活动精子置入1个冷冻保存载体中，用吸管吸取冷冻保存载体放入添加精子冻存液的冻存管中，液氮面上方4.0cm高度的液氮蒸汽预冷降温3min(降温速度20℃/min)后，将冻存管投入液氮中进行快速冷冻并保存。
145.2、冷冻保存精子复苏
146.自液氮罐中取出冻存管，37℃快速解冻，用吸管将含微球载体的冻存液从冻存管内取出，迅速加入到培养皿(含37℃的精子培养液5.0ml)中。显微镜下在冷冻保存载体内寻找精子，并用显微注射针显微操作针从冷冻保存载体内抓取精子转入另一个含精子培养基的培养皿中。
147.3、实验分组
148.实验分为空白组、实施例1组、对比例1组、对比例2组、实施例2组、对比例3组、对比例4组、实施例3组、对比例5组、对比例6组、实施例4组、对比例7组、对比例8组。每组选100个冷冻保存载体，每个载体内装载1个精子。
149.4、检测方法
150.(1)冷冻载体完整率检测
151.显微镜观察冷冻保存后载体形态，载体形态不变计为形态完整，载体变形或破裂计为形态破裂，载体完整率(％)＝(冷冻保存前形态完整载体数量-冷冻保存后形态完整载体数量)/冷冻保存前形态完整载体数量。
152.(2)精子回收率测定
153.显微镜下计数冷冻保存前和冷冻保存后精子的数量，精子回收率(％)＝(冷冻保存前精子数量-冷冻保存后精子数量)/冷冻保存前精子数量。
154.(3)精子活动率测定
155.显微镜下观察精子活动状况，计数冷冻保存前和冷冻保存后精子的数量，冷冻保存后精子活动率(％)＝(冷冻保存后回收精子总数量-冷冻保存后回收活动精子数量)/冷冻保存后回收精子总数量。
156.5、实验结果
157.表1
[0158][0159]
从表1实验结果看，载体强度与粒径与膜厚度相关，粒径越小、膜厚度越大载体强度越高，冷冻保存后载体完整率越高，精子回收率与载体完整率正相关，载体完整率越高精子回收率也越高，而精子活动率与载体完整率及精子回收率不相关，各实验组精子活动率都在80％左右。从载体制备条件看，载体粒径与海藻酸钠溶液浓度及粘度正相关，浓度及粘度越低粒径越小，但是浓度及粘度也不能太低，粘度太低将不能形成球形凝胶珠，所以应该采用适当的海藻酸钠浓度和粘度制备凝胶珠；载体膜厚度与ε-聚赖氨酸用量正相关，ε-聚赖氨酸用量越多，膜厚度越大，载体强度越高。载体强度还与海藻酸钠g/m比相关，g/m比越大载体强度越高，冷冻保存后载体完整率越高，分析原因主要是ε-聚赖氨酸只能与海藻酸钠分子中的古洛糖醛酸中的羧基进行络合反应形成聚电解质膜，不与甘露糖醛酸分子中的羧基反应，海藻酸钠分子中古洛糖醛酸含量越高能够参与反应的羧基量越多，形成的聚电解质络合膜强度就越高，冷冻保存后载体完整率也就越高。综上所述，本载体冷冻保存少量精子具有较高的载体完整率、精子回收率及精子活动率。
[0160]
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。