杂交瘤细胞冻存液及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于细胞培养和保存技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞冻存液及其制备方法与应用。


背景技术：

2.细胞冻存，即使用现有的程序降温技术在-196℃的液氮中冷冻保存细胞，可使细胞暂时停止生长，并保留原有的细胞特性。此外，适度冻存一定数量的细胞可作为细胞种子使用，当细胞因操作或等其他原因发生污染，可使用冻存的细胞顺利的进行后续实验。
3.在进行细胞冻存的过程中需要加入适量的细胞冻存液，冻存液中的保护剂可减少冷冻过程中冰晶的形成降低细胞的损伤。同时，冻存液中含有细胞代谢所需的多种营养物质，能维持细胞的正常形态和生理功能。
4.传统的细胞冻存液使用90％胎牛血清(非渗透性保护剂)和10％dmso(渗透性保护剂)混合配制而成，使用这种配制方式均需要添加大量的血清。一方面，血清的纯化方式和产品批次不易控制，成本较高。另一方面，动物来源的血清包含氨基酸，维生素，微量元素，无机盐离子和激素等成分复杂，还有许多未知的成分未被鉴定出来易造成潜在的危险(这是血清使用过程中的缺点，已被科研工作者所熟知)。因此，单克隆抗体的生产中，杂交瘤细胞的培养大多使用无血清培养基，基于此无血清且化学成分明确的冻存液越来越受研发人员的青睐。


技术实现要素：

5.发明目的：针对当前杂交瘤细胞冻存的技术问题，本发明提供了一种无血清、成分明确、效果好的杂交瘤细胞冻存液，本发明还提供了该冻存液的制备方法和应用。
6.技术方案：为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明的杂交瘤细胞冻存液，包括无血清培养基、冻存保护剂、牛血清白蛋白(bsa)，还包括选自谷氨酰胺(l-gln)、维生素c、维生素e、胰岛素样生长因子1(igf-1)、表皮细胞生长因子(egf)中的一种或多种添加剂。
8.在一些技术方案中，所述无血清培养基包括但不限于rpmi-1640培养基、dmem高糖培养基、dmem低糖培养基、imdm培养基，或以上培养基和f12培养基组成的组合中的一种或多种。
9.在一些技术方案中，所述无血清培养基选自dmem/f12培养基、dmem、mem中的一种或多种。
10.在一些技术方案中，所述冻存保护剂为渗透性保护剂，包括但不限于dmso、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、氨基酸或其组合，用于在细胞复苏时，促进细胞外水分进入胞内，以缓解渗透性肿胀引起的损伤。
11.在另一些技术方案中，所述冻存保护剂为非渗透性保护剂，包括但不限于蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白或其组合。非渗透性保护剂可以通过稀释降低胞外电解质的浓度，
减少溶质损伤；还可以通过结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶的形成。
12.在另一些技术方案中，所述冻存保护剂为渗透性保护剂和非渗透性保护剂的组合。
13.在一些技术方案中，所述冻存保护剂为二甲基亚砜(dmso)。
14.在一些技术方案中，所述杂交瘤细胞冻存液，包括以下体积百分含量的各个组分：dmem/f12培养基60.0％-90.0％，优选70％-85％，更优选72.5-82.5％；二甲基亚砜(dmso)3.0-10.5％，优选4.0-9.0％，更优选5.0-8.0％；牛血清白蛋白(bsa)6-35％，优选8-25％，更优选10-20％；所述冻存液还包括选自谷氨酰胺(l-gln)、维生素c、维生素e、胰岛素样生长因子1(igf-1)、表皮细胞生长因子(egf)中的一种或多种的添加剂。
15.在一些技术方案中，所述杂交瘤细胞冻存液，包括以下体积百分含量的各个组分：dmem/f12培养基72.5-82.5％、二甲基亚砜(dmso)7.5％、牛血清白蛋白(bsa)10-20％；所述冻存液还包括添加剂谷氨酰胺(l-gln)、维生素c、维生素e、胰岛素样生长因子1(igf-1)和表皮细胞生长因子(egf)。
16.在一些技术方案中，所述谷氨酰胺(l-gln)在冻存液中的浓度选自3-10mm，优选4-8mm，更优选4.0mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm。
17.在一些技术方案中，所述维生素c在冻存液中的浓度选自30-80mg/l，优选40-60mg/l，更优选40mg/l、45.0mg/l、50.0mg/l、55.0mg/l、60.0mg/l。
18.在一些技术方案中，所述维生素e在冻存液中的浓度选自20-100mg/l，优选40-80mg/l，更优选40mg/l、45.0mg/l、50.0mg/l、55.0mg/l、60.0mg/l、65.0mg/l、70.0mg/l、75.0mg/l、80.0mg/l。
19.在一些技术方案中，所述胰岛素样生长因子1(igf-1)在冻存液中的浓度选自40-110ng/ml，优选50-100ng/ml，更优选50.0mg/l、55.0mg/l、60.0mg/l、65.0mg/l、70.0mg/l、75.0mg/l、80.0mg/l、85.0mg/l、90.0mg/l、95.0mg/l、100.0mg/l。
20.在一些技术方案中，所述表皮细胞生长因子(egf)在冻存液中的浓度选自20-110ng/ml，优选25-100ng/ml，更优选25mg/l、30mg/l、35mg/l、40mg/l、45mg/l、50mg/l、55mg/l、60mg/l、65mg/l、70mg/l、75mg/l、80mg/l、85mg/l、90mg/l、95mg/l、100mg/l。
21.本发明还公开了所述杂交瘤细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
22.(1)取配方量的dmem/f12培养基和二甲基亚砜dmso制成混合液a，涡旋混合均匀，冷藏避光备用；
23.(2)取混合液a，加入配方量的牛血清白蛋白(bsa)、维生素c、维生素e、谷氨酰胺(l-gln)、胰岛素样生长因子1(igf-1)和表皮细胞生长因子(egf)，制成混合液b，涡旋混合均匀，确保添加剂完全溶解；
24.(3)混合液b无菌过滤。
25.在一些技术方案中，所述无菌过滤采用的是0.22μm滤器进行过滤。
26.本发明还公开了所述杂交瘤细胞冻存液在细胞冷冻保存中的应用。相较于传统配方，本发明冻存液在用于冻存cho、293细胞时，复苏后细胞存活率低。
27.在一些技术方案中，所述细胞冻存液适用于杂交瘤细胞，配制完成后，于4℃保存。
28.有益效果：相比较于现有技术，本技术冻存液存在以下优势：(1)本冻存液配方明确，使用bsa替代fbs，不含血清，安全性高，解决了传统血清引入未知病原菌带来的潜在风
险；(2)使用本配方成本低、来源广泛，可大量配制，操作简单；(3)本发明通过添加添加剂，达到了传统杂交瘤细胞冻存液相当的冻存效果，可广泛用于杂交瘤细胞的冻存。
附图说明
29.图1是实施例1冻存液与对比例1冻存的细胞复苏0-48h的活细胞密度；
30.图2是实施例1、2和3，对比例1、2、3、4、5、6和7的48h细胞活力。
具体实施方式
31.为详细说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实验对本发明进行详细、清晰和完整的阐述。显然，所描述的实例并不是实验的全部过程。
32.本发明的无血清的杂交瘤细胞冻存液配置方法及步骤如下：
33.(1)无菌超净台内吸取适量体积的dmem/f12培养基和dmso制成混合液a，涡旋仪混合均匀后4℃恒温冰箱内避光备用。
34.(2)取一定体积的上述混合液a，将牛血清白蛋白(bsa)、维生素c、维生素e、谷氨酰胺(l-gln)、胰岛素样生长因子1(igf-1，赛默飞phg0078)和表皮细胞生长因子(egf，赛默飞phg0311l)按合适比例加入制成混合液b，涡旋仪混合均匀确保添加剂完全溶解(以上试剂除特殊标明外均购置sigma公司，下同)。
35.(3)使用0.22μm滤器，对上述混合液b进行无菌过滤，菌检完成后转移至4℃恒温冰箱避光保存备用。
36.实施例1
37.1、一种无血清杂交瘤细胞冻存液
38.此冻存液包括：dmem/f12培养基在杂交瘤细胞冻存液的占比82.5％，二甲基亚砜(dmso)在杂交瘤细胞冻存液的占比为7.5％，牛血清白蛋白(bsa)在杂交瘤细胞冻存液中的占比为10％，谷氨酰胺(l-gln)在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为6mm，维生素c在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为40mg/l，维生素e在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为40mg/l，胰岛素样生长因子1(igf-1)在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为50ng/ml，表皮细胞生长因子(egf)在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为25ng/ml。
39.2、此无血清杂交瘤细胞冻存液的制备方式及操作步骤：
40.(1)超净台中吸取82.5ml的dmem/f12培养基，7.5ml二甲基亚砜(dmso)制成混合液a，涡旋仪混合均匀后4℃冰箱避光备用。
41.(2)取混合液a，加入牛血清白蛋白(bsa)10ml，谷氨酰胺(l-gln)87.6mg，维生素c 4mg，维生素e 4mg，胰岛素样生长因子1(igf-1)5μg，表皮细胞生长因子(egf)2.5μg等制成混合液b，涡旋仪混合均匀4℃冰箱避光备用。
42.(3)使用0.22μm滤器，对上述混合液b进行无菌过滤。
43.(4)超净台内将过滤除菌的混合液b转移至混合液a中，使用涡旋仪混合均匀；待菌检合格后进行下一步工作。
44.3、杂交瘤细胞冻存液的应用，包括以下步骤：
45.(1)杂交瘤细胞的来源：小鼠杂交瘤细胞(crl-1606，atcc下同)，经elisa间接法检测小鼠杂交瘤细胞为阳性(可大量表达人纤连蛋白单克隆抗体)，该细胞连续传代3次，待生
长稳定后用于细胞冻存。
46.(2)超净台中吸取20μl杂交瘤细胞悬液进行细胞计数，吸取合适体积的细胞悬液离心取细胞沉淀。
47.(3)将细胞沉淀加入上述配制的杂交瘤细胞冻存液中，移液枪轻轻吹打制成冻存悬液，以1.0
×
10^7个/ml的密度分装于冻存管并标注相关信息。
48.(4)使用程序降温盒(通用)进行梯度降温，最后在液氮中长期保存。
49.实施例2
50.1、一种无血清杂交瘤细胞冻存液
51.此冻存液包括：dmem/f12培养基在杂交瘤细胞冻存液的占比为77.5％，二甲基亚砜(dmso)在杂交瘤细胞冻存液的占比为7.5％，牛血清白蛋白(bsa)在杂交瘤细胞冻存液中的占比为15％，谷氨酰胺(l-gln)在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为6mm，维生素c在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为50mg/l，维生素e在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为60mg/l，胰岛素样生长因子1(igf-1)在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为50ng/ml，表皮细胞生长因子(egf)在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为50ng/ml。
52.2、此无血清杂交瘤细胞冻存液的制备方式及操作步骤：
53.(1)超净台中吸取77.5ml的dmem/f12培养基，7.5ml二甲基亚砜(dmso)制成混合液a，涡旋仪混合均匀后4℃冰箱避光备用。
54.(2)取混合液a，加入牛血清白蛋白(bsa)15ml，谷氨酰胺(l-gln)87.6mg，维生素c 5mg，维生素e 6mg，胰岛素样生长因子1(igf-1)5μg，表皮细胞生长因子(egf)5μg等制成混合液b，涡旋仪混合均匀4℃冰箱避光备用。
55.(3)使用0.22μm滤器，对上述混合液b进行无菌过滤。
56.(4)超净台内将过滤除菌的混合液b转移至混合液a中，使用涡旋仪混合均匀；待菌检合格后用进行下一步工作。
57.3、杂交瘤细胞冻存液的应用，包括以下步骤：
58.(1)超净台中吸取20μl杂交瘤细胞悬液进行细胞计数，吸取合适体积的细胞悬液离心取细胞沉淀。
59.(2)将细胞沉淀加入上述配制的杂交瘤细胞冻存液中，移液枪轻轻吹打制成冻存悬液，以1.0
×
10^7个/ml的密度分装于冻存管并标注相关信息。
60.(3)使用程序降温盒进行梯度降温，最后在液氮中长期保存。
61.实施例3
62.1、一种无血清杂交瘤细胞冻存液
63.此冻存液包括：dmem/f12培养基在杂交瘤细胞冻存液的占比为72.5％，二甲基亚砜(dmso)在杂交瘤细胞冻存液的占比为7.5％，牛血清白蛋白(bsa)在杂交瘤细胞冻存液中的占比为20％，谷氨酰胺(l-gln)在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为6mm，维生素c在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为60mg/l，维生素e在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为80mg/l，胰岛素样生长因子1(igf-1)在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为100ng/ml，表皮细胞生长因子(egf)在杂交瘤细胞冻存液中的浓度为100ng/ml。
64.2、此无血清杂交瘤细胞冻存液的制备方式及操作步骤：
65.(1)超净台中吸取72.5ml的dmem/f12培养基，7.5ml二甲基亚砜(dmso)制成混合液
a，涡旋仪混合均匀后4℃冰箱避光备用。
66.(2)取混合液a，加入牛血清白蛋白(bsa)20ml，谷氨酰胺(l-gln)87.6mg，维生素c 6mg，维生素e 8mg，胰岛素样生长因子1(igf-1)10μg，表皮细胞生长因子(egf)10μg等制成混合液b，涡旋仪混合均匀4℃冰箱避光备用。
67.(3)使用0.22μm滤器，对上述混合液b进行无菌过滤。
68.(4)超净台内将过滤除菌的混合液b转移至混合液a中，使用涡旋仪混合均匀；待菌检合格后用进行下一步工作。
69.3、杂交瘤细胞冻存液的应用，包括以下步骤：
70.(1)超净台中吸取20μl杂交瘤细胞悬液进行细胞计数，吸取合适体积的细胞悬液离心取细胞沉淀。
71.(2)将细胞沉淀加入上述配制的杂交瘤细胞冻存液中，移液枪轻轻吹打制成冻存悬液，以1.0
×
10^7个/ml的密度分装于冻存管并标注相关信息。
72.(3)使用程序降温盒进行梯度降温，最后在液氮中长期保存。
73.对比例1
74.冻存液配方为:87.5％dmem/f12+7.5％dmso+5％bsa+6mm l-gln+40mm vc+40mm ve+50ng/ml igf-1+25ng/ml egf，即使用87.5％dmem/f12和5％的bsa。
75.上述冻存液除了配方不同外，其余操作步骤与实施例1一致。
76.对比例2
77.冻存液配方为:82.5％dmem/f12+7.5％dmso+10％海藻糖+6mm l-gln+40mm vc+40mm ve+50ng/ml igf-1+25ng/ml egf，即使用10％海藻糖。
78.上述冻存液除了配方不同外，其余操作步骤与实施例1一致。
79.对比例3
80.冻存液配方为:82.5％dmem/f12+7.5％dmso+10％羟乙基淀粉+6mm l-gln+40mm vc+40mm ve+50ng/ml igf-1+25ng/ml egf，即使用10％羟乙基淀粉。
81.上述冻存液除了配方不同外，其余操作步骤与实施例1一致。
82.对比例4
83.冻存液配方为:90％fbs+10％dmso+6mm l-gln(传统细胞冻存液)，即仅使用90％fbs，不使用其他添加剂。
84.上述冻存液除了配方不同外，其余操作步骤与实施例1一致。
85.对比例5
86.冻存液配方为:82.5％dmem/f12+7.5％dmso+10％fbs+6mm l-gln，即仅使用10％fbs，不使用其他添加剂。
87.上述冻存液除了配方不同外，其余操作步骤与实施例1一致。
88.对比例6
89.冻存液配方为:92.5％dmem/f12+7.5％dmso+6mm l-gln(空白对照)，即不含bsa，维生素c，维生素e，igf-1和egf等添加剂。
90.上述冻存液除了配方不同外，其余操作步骤与实施例1一致。
91.对比例7
92.冻存液配方为:100％dmem/f12+6mm l-gln(空白对照)，即不含dmso，bsa，维生素
c，维生素e，igf-1和egf等添加剂。
93.上述冻存液除了配方不同外，其余操作步骤与实施例1一致。
94.计数结果与分析
95.冻存一周后对细胞进行复苏，经恒温摇床(西雷)培养10min，24h，48h后活细胞计数(台盼蓝活细胞染色)，细胞活力如表1所示。
96.表1复苏后细胞的活力
[0097][0098]
从表格中不难发现，利用本发明杂交瘤细胞冻存液冻存杂交瘤细胞，实例1、2和3的细胞活力明显上升且细胞复苏后的活率在85％以上，且与对比例4、5的传统冻存液冻存效果无明显差异，这说明使用本发明配制的冻存液适合杂交瘤细胞的冻存；与实施例1相比，对比例1中使用5％bsa后细胞活力下降；与实施例1相比，对比例2使用10％海藻糖达不到细胞冻存的效果；与实施例1相比，对比例3使用10％羟乙基淀粉达不到细胞冻存的效果；对比例7结果显示，缺乏dmso杂交瘤细胞复苏后活率显著下降。
[0099]
细胞活力检测：冻存一周后对细胞进行复苏，经恒温摇床培养10min、24h和48h后进行活细胞计数，细胞密度如图1所示。从图1中可以看出，利用本发明的冻存液进行杂交瘤细胞冻存，实例1、2和3的活细胞密度显著上升，且与对比例4、5无差异，这说明使用本发明配制的冻存液适合复苏的杂交瘤细胞生长；对比例1结果显示，使用5％bsa冻存细胞，复苏后的杂交瘤细胞的生长减慢；对比例2结果显示，使用10％海藻糖冻存细胞，复苏后的杂交瘤细胞不能正常生长；对比例3结果显示，使用10％羟乙基淀粉冻存细胞，复苏后的杂交瘤细胞不能正常生长；对比例6结果显示，冻存液中缺乏bsa，复苏后的杂交瘤细胞不能正常生长；对比例7的结果显示，冻存液中缺乏dmso后细胞的密度显著下降。
[0100]
最后所应当说明的是，以上实施例仅展示一部分用结果以说明本发明的技术方案并非全部，而非对本发明保护范围的限制，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。