对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的甜瓜植物的制作方法

1.本发明涉及对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性并具有所需农艺性状的甜瓜(cucumis melo)植物。本发明还提供了生产该种植物的方法，以及检测和/或选择该种植物的方法。


背景技术：

2.许多病原体，如枝孢属(cladosporium)、单囊壳白粉菌(podosphaera xanthii)或蚜虫(aphids)，可以在甜瓜(cucumis melo)的培养物中定殖。
3.黄瓜黑星病菌(cladosporium cucumerinum ellis and arthur)是一种真菌，在世界上许多地方，它会导致疮痂病侵袭几种葫芦科植物(如黄瓜和甜瓜)的叶子和果实。在过去的50年中，黄瓜中系统地引入了非常高水平的单基因抗性，但在甜瓜中没有描述抗性。该病主要发生在凉爽潮湿的环境中，例如，它在法国西南部广泛存在，那里的生产者经常使用杀真菌剂。
4.白粉病(pm)是一种叶部病害，由两种主要病原体引起：菊科高氏白粉菌(golovinomyces cichoracearum)和单囊壳白粉菌。在大多数国家，单囊壳白粉菌占主导地位，而菊科高氏白粉菌可在温带地区引起疾病。在法国，尽管存在这两种病原体，但单囊壳白粉菌仍是最常见的物种。在甜瓜上，已描述了五个单囊壳白粉菌品种(即品种px-1、px-2、px-3、px-5、px-3-5)和两个菊科高氏白粉菌品种。
5.瓜蚜，即瓜蚜(aphis gossypii glover)是一种昆虫害虫，广泛定殖于经济上重要的寄主植物，例如葫芦科植物，它是主要害虫。瓜蚜(a.gossypii)对葫芦科植物的定殖会导致发育迟缓和严重的叶片卷曲，从而导致植物死亡。瓜蚜也是一种有效的病毒载体，因此有助于病毒性疾病的传播。自1970年代以来，已经描述了抗性甜瓜种质，并且已经确定了负责抗性的主要基因，即vat基因(dogimont等人，cucurbitaceae 2008，第ix届eucarpia葫芦科遗传学和育种会议论文集(proceedings of the ixth eucarpia meeting on genetics and breeding of cucurbitaceae)；dogimont等人.，2014，the plant journal，80，993-1004)，并渗入到商业甜瓜品系中。然而，已证明vat基因与坏死反应(松弛性坏死)有关(pitrat和lecoq，1982，agronomie，2：503-508)。
6.到目前为止，在法国生产的夏恩泰品种中存在对几种单囊壳白粉菌和瓜蚜品种的抗性。赋予对单囊壳白粉菌的第1、2、3和5品种抗性的两个独立的基因座pmv.1和pmxii.1已使用源自抗性甜瓜种质pi 124112和易感甜瓜“vedrantais”之间杂交的ril群体得以鉴定(perchepied等人，2005，the american phytopathological society，vol.95(5)：556-565)。此外，fukino等人，2008，theor.appl.genet.，118(1)：165-75，通过使用源自抗性ar5哈密瓜育种系与易感日本栽培品种“earl's favorite(harukei 3)”之间杂交的ril对连锁群(lg)ii(或lg2)和lgxii(lg12)检测到两个赋予单囊壳白粉菌品种a和b具有pm抗性的qtl。已发现本研究中lgii上的qtl与cmbr8和cmbr120标记物密切相关。
7.fazza等人，2013，crop breeding and applied biotechnology，13：349-355，还
公开了赋予甜瓜种质pi 414723中单囊壳白粉菌品种1、3和5抗性的qtl在lgii(lg2)中两个连锁基因座上的映射。然而，pi 414723种质是一种具有不良农艺性状的印度种质，例如成熟时果肉苍白、粉状和柔软，空腔大、成熟时果皮高度黄化/橙色，以及糖含量低(6
°
brix)(burger等人，2010，horticultural reviews，36，165-198)。fazza等人还公开了lgii含有其他抗病基因，例如赋予对小西葫芦黄化花叶病毒(zymv)抗性的zym基因。然而，已在zym/zym纯合植物上观察到叶/茎/果实坏死条纹表型(pitrat和lecoq，1984，euphytica，33(1)：57-61，us20140059712)。因此，需要获得对pm具有抗性而没有与zym基因的存在相关的有害坏死作用的植物。
8.此外，fukino等人鉴定的cmbr8标记物未在fazza等人中映射，并且cmbr120标记物与在lgii上鉴定的它们的qtl相距甚远，表明fukino等人的qtl和fazza等人的qtl位于lgii的不同部分。无论如何，今天由于甜瓜基因组中基因映射标记物的密度低，很难知道这种抗性qtl的精确位置。因此，存在对单囊壳白粉菌的不同品种(race)具有抗性的qtl的多样性，需要对其进行精确定位以确定它们是否具有潜在的可组合性，从而能够将它们组合成一株甜瓜植物。
9.随着用于地面消毒的植物保护产品的减少，可以预见与地面有关的所有疾病的发病率都会增加。因此，还需要开发多抗性栽培品种，例如对枝孢属、单囊壳白粉菌和蚜虫具有抗性的栽培品种，以具有控制病原体影响的更加可接受和更经济的手段。


技术实现要素：

10.本发明人已经能够在甜瓜(cucumis melo)植物中渗入赋予对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)抗性以及结合所需的农艺性状、优选地没有与zym基因相关的任何坏死表型的数量性状基因座(qtl)。因此，在第一实施方式中，本发明提供了一种对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜植物，其中所述植物：
[0011]-包含：
[0012]
(i)赋予对疮痂病具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2(lgii)和/或连锁群5(lg5或lgv)上，
[0013]
(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2(lgii)和/或lg5(lgv)上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和
[0014]
(iii)在lg5(lgv)上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物，和
[0015]-具有商业上可接受的果实品质。
[0016]
优选地，这样的植物不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0017]
在一些实施方式中，存在于lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的所述qtl位于由标记物cm_mu45136_209(也称为mu45136_209，seq id no：1)和标记物cm_mu45398_32(也称为mu45398_32，seq id no：9)限定的染色体区域内。
[0018]
在一些实施方式中，存在于lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的所述qtl位于由标记物lg5-m1(seq id no：13)和标记物cm_mu44050_58(也称为mu44050_58，seq id no：20)限定的染色体区域内。
[0019]
在一些实施方式中，存在于lg2上的赋予对pm具有抗性的所述qtl位于由标记物cmbr120(其可通过使用具有seq id no：24和25的引物鉴定)和标记物cm_mu47536_461(也
名为mu47536_461，seq id no：30)限定的染色体区域内。
[0020]
在一些实施方式中，存在于lg5上的赋予对pm具有抗性的所述qtl位于由标记物cm_mu45437_855(也称为mu45437_855，seq id no：34)和标记物lg5-m3(seq id no：42)限定的染色体区域内。
[0021]
在一些实施方式中，对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性的甜瓜植物是品系mtyvvc721，其种子的代表性样品已保藏在ncimb，保藏号为ncimb43317。
[0022]
还提供了根据本发明的甜瓜(c.melo)植物的细胞。
[0023]
进一步提供了从根据本发明的甜瓜植物获得的植物部分。在一些实施方式中，所述植物部分是种子、果实、繁殖材料、根、花、根状茎或接穗。
[0024]
本发明还提供了甜瓜(c.melo)植物的种子，其在生长成为根据本发明的植物时产生。
[0025]
还提供了抗疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)的甜瓜(c.melo)杂交植物，可通过将甜瓜植物与根据本发明的抗性植物杂交获得。
[0026]
本发明还提供了检测和/或选择对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜(c.melo)植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0027]
a)检测是否存在：
[0028]
(i)赋予对疮痂病具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，
[0029]
(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和
[0030]
(iii)在lg5上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物，
[0031]
b)选择作为对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的植物，已检测存在赋予对疮痂病具有抗性的所述至少一个qtl，赋予对pm具有抗性的所述至少一个qtl，和赋予对蚜虫具有抗性的所述vat基因类似物的甜瓜植物。
[0032]
还提供了一种或多种标记物用于检测对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜(c.melo)植物的用途，其中所述一种或多种标记物位于以下染色体区域中的至少一种中：
[0033]-在lg2上由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域，
[0034]-在lg5上由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域，
[0035]-在lg2上由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域，
[0036]-在lg5上由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域，或
[0037]-在vat基因类似物中。
[0038]
本发明还提供了一种根据本发明的甜瓜(c.melo)抗性植物作为育种配偶体在获得对黑星病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性、并且优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型的甜瓜植物的育种程序中的用途。
[0039]
还提供了一种生产甜瓜(c.melo)种子的方法。在一些实施方式中，该方法包括将根据本发明的甜瓜(c.melo)植物与其自身或与另一种甜瓜植物杂交，并收获所得种子。
[0040]
还提供了一种在被疮痂病、蚜虫和白粉病侵染的环境中增加可收获的甜瓜(c.melo)植物数量的方法，包括在所述环境中生长对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性
的甜瓜植物，该甜瓜植物：
[0041]
包含：
[0042]
(i)赋予对疮痂病具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，
[0043]
(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和
[0044]
(iii)在lg5上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物，和
[0045]-具有商业上可接受的果实品质。
[0046]
优选地，这种植物不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0047]
还提供了一种保护田地免受疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)侵染和/或传播的方法，包括生长对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性的甜瓜植物，该甜瓜植物包括：
[0048]
(i)赋予对疮痂病具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，
[0049]
(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和
[0050]
(iii)在lg5上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物，和
[0051]-具有商业上可接受的果实品质，和
[0052]-优选地，不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0053]
还提供了一种对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜植物用于控制田间因疮痂病、蚜虫和pm侵染的用途，其包括：
[0054]
(i)赋予对疮痂病具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，
[0055]
(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和
[0056]
(iii)在lg5上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物，和
[0057]-具有商业上可接受的果实品质，
[0058]-优选地，不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0059]
还提供了一种用于生产对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜小植株或植物的方法，该方法包括：
[0060]
i.体外培养根据本发明的甜瓜植物的分离的细胞或组织以产生对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜微型植株，和
[0061]
ii.任选进一步使甜瓜微型植株经受体内培养阶段以发育成对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜植物。
[0062]
还提供了一种在受疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)侵染的环境中提高甜瓜植物产量的方法，包括生长对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性并且任选地不具有与zym基因相关的任何坏死表型的甜瓜植物，其中所述植物在其基因组中包含(i)赋予对疮痂病具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和(iii)在lg5上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物。
[0063]
还提供了一种在受疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)侵染的环境中提高甜瓜植物产量的方法，包括：
[0064]
a.鉴定对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜植物，在该甜瓜植物的基因组中包含(i)赋予对枝孢属具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和(iii)在lg5上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物，和
[0065]
b.在所述受侵染的环境中生长所述抗性甜瓜植物。
[0066]
定义
[0067]
如本文所用，术语“植物部分”是指植物的任何部分，包括但不限于枝条、根、茎、种子、果实、叶、花瓣、花、胚珠、枝条、叶柄、节间、花粉、雄蕊、根状茎、接穗等。
[0068]
如本文所用，术语“数量性状基因座(qtl)”是指可包含一个或多个基因或调控序列的基因组区域。qtl例如可以包含一种或多种基因，其产物赋予遗传抗性或耐受性。或者，qtl可以例如包含调控基因或序列，其产物影响植物基因组中其他基因座上的基因表达，从而赋予抗性或耐受性。本发明的qtl可以通过使用一种或多种分子基因组标记物指示它们在相应病原体抗性种质的基因组中的遗传位置来定义。一个或多个标记物依次指示特定基因座。基因座之间的距离通常通过同一染色体上基因座之间的频率或互换来衡量。两者相距越远，它们之间发生互换的可能性就越大。相反，如果两个基因座靠得很近，则它们之间发生互换的可能性较小。通常，一个厘摩(cm)等于基因座(标记物)之间1％的重组。当一个qtl可以被多个标记物指示时，终点标记物之间的遗传距离指示qtl的大小。
[0069]
术语“抗性”由isf(国际种子联合会)蔬菜和观赏作物科定义，用于描述植物对害虫或病原体的反应，以及蔬菜种子行业的非生物胁迫。
[0070]
具体而言，抗性是指与在类似环境条件和害虫或病原体压力下的易感植物品种相比，植物品种限制特定害虫或病原体的生长和发育和/或它们造成的损害的能力。抗性品种在严重的害虫或病原体压力下可能会表现出一些疾病症状或损害。
[0071]“耐受性”是指植物品种承受生物和非生物胁迫而不会对生长、外观和产量造成严重后果的能力。
[0072]
如本文所用，术语“易感”是指不能限制特定害虫或病原体的生长和发育的植物。
[0073]
如本文所用，术语“子代”或“子代”是指从一种或多种亲本植物或其子代的无性或有性繁殖产生的作为子代的任何植物。例如，子代植物可以通过亲本植物的克隆或自交或通过两个亲本植物杂交获得，并且包括自交以及f1或f2或更进一步的世代。f1是指至少有一个亲本首次作为某性状的供体产生的第一代子代，而第二代(f2)或子代(f3、f4等)的子代则是由f1’s、f2s等的自交中产生的样本。因此，f1可能(并且通常)是两个纯种亲本之间杂交产生的杂交种(纯种是一种性状的纯合子)，而f2可能(并且通常是)是由所述f1杂交种的自授粉产生的子代。
[0074]
如本文所用，术语“杂交”、“杂交”是指将一株植物上一朵花的花粉(人工或自然地)施加到另一株植物上一朵花的胚珠(柱头)的过程。
[0075]
如本文所用，术语“杂合子”是指具有存在于至少一个基因座处的不同等位基因(给定基因或序列的形式)的二倍体或多倍体细胞或植物。
[0076]
如本文所用，术语“杂合的”是指在特定基因座处存在不同的等位基因(给定基因或序列的形式)。
[0077]
如本文所用，术语“纯合子”是指在所有同源染色体上的一个或多个基因座处具有相同等位基因的个体细胞或植物。
[0078]
如本文所用，术语“纯合”是指在同源染色体区段中存在一个或多个基因座相同的等位基因。
[0079]
如本文所用，术语“杂种(hybrid)”是指由在一个或多个基因上不同的亲本之间的杂交产生的任何个体细胞、组织或植物。
[0080]
如本文所用，术语“近交系”或“品系”是指相对纯种的品系。
[0081]
如本文所用，术语“表型”是指个体细胞、细胞培养物、生物体(例如植物)或生物体群的可观察特征，其由个体基因构成(即基因型)与环境之间的相互作用产生。
[0082]
如本文所用，术语“基因渗入”、“基因渗入”和“基因渗入”是指一个物种、品种或栽培品种的基因通过杂交而转移到另一个物种、品种或栽培品种的基因组中的过程。杂交可以是自然的或人工的。该过程可以任选地通过与轮回亲本回交来完成，在这种情况下，渗入是指通过种间杂交种与其亲本之一的重复回交，一个物种的基因渗入另一个物种的基因库。基因渗入也可以描述为稳定整合到受体植物基因组中的异源遗传物质。
[0083]
如本文所用，术语“分子标记物”是指用于可视化核酸序列特征差异的方法中的指示剂。此类指标的实例包括限制性片段长度多态性(rflp)标记物、扩增片段长度多态性(aflp)标记物、单核苷酸多态性(snp)、插入突变、微卫星标记物(ssr)、序列特征扩增区域(scar)、切割扩增多态序列(caps)标记物或同工酶标记物或本文描述的标记物的组合，其定义了特定的遗传和染色体位置。等位基因附近分子标记物的映射是本领域技术人员可以使用常用分子技术非常容易地进行的程序。
[0084]
如本文所用，术语“引物”是指能够与扩增靶退火以允许dna聚合酶附着的寡核苷酸，从而当置于诱导引物延伸产物合成的条件下时，即在核苷酸和聚合剂(如dna聚合酶)的存在下，在合适的温度和ph下，作为dna合成的起始点。引物优选是单链的以实现最大的扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在聚合剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括引物的温度和组成(a/t和g/c含量)。一对双向引物由一个正向引物和一个反向引物组成，如pcr扩增等dna扩增领域中常用的那样。
[0085]“疮痂病”是指由名为枝孢属的子囊菌纲(室内和室外霉菌)真菌引起的真菌病。枝孢属物种的非限制性实例包括秀丽枝孢霉(cladosporium elegans)、枝孢霉属枝孢霉类(cladosporium cladosporioides)、卡氏枝孢霉(cladosporium caryigenum)、芭蕉枝孢霉(cladosporium musae)、芸苔枝孢霉(cladosporium brassicae)、黄瓜黑星病菌(cladosporium cucumerinum)和尖孢枝孢霉(cladosporium oxysporum)。优选地，枝孢属物种是黄瓜黑星病菌(也称为cladosporium cucumerinum ellis and arthur)。病害症状可出现在植物的所有部分，包括叶、叶柄、茎和果实。叶片病变开始时呈淡绿色、水浸状区域，逐渐变成灰色至白色并变得有棱角。通常，病斑周围环绕着淡黄色的光晕，病斑中心撕裂，在叶子上留下参差不齐的洞。在果实上，长出小(1/8英寸)、灰色、略微凹陷、渗出的胶状斑点，类似于昆虫“叮咬”。后来，斑点扩大，最后变成明显的凹陷腔。随着果实成熟，火山口
状凹陷会形成不规则的疮痂状外观，并可能渗出胶状物质(https://extension.illinois.edu/hortanswers/detailproblem.cfm？pathogenid＝141)。
[0086]“白粉病”是指由白粉菌目真菌引起的真菌病害。优选地，白粉病由菊科高氏白粉菌(也称为菊苣白粉菌(erysiphe cichoracearum)dc)和/或单囊壳白粉菌(也称为褐斑病菌(sphaerotheca fuliginea)或红粉霉(oidium erysiphoides))引起。更优选地，白粉病是由单囊壳白粉菌引起的。在一些实施方式中，白粉病是由单囊壳白粉菌品种px-1、px-2、px-3、px-5和/或px3-5引起的。该病害的特征是茎、叶柄、上部和/或下部叶面以及果实上出现白色或淡黄色病斑。当疾病进展时，病变会变大变致密。随着病变扩大，受影响的组织产生分生孢子，斑点呈粉状。这种真菌的孢子形成可能会导致植物组织的细胞破坏，以及光合作用效率的损失，从而导致植物的能量性能降低(https://cuccap.org/disease-management/melon/powdery-mildew/).
[0087]“蚜虫”是指寄生在广泛的经济上重要的寄主植物(如葫芦科植物)上的昆虫害虫，它是葫芦科植物的主要害虫。蚜虫对葫芦科植物的寄生会导致发育迟缓和严重的叶片卷曲，从而导致植物死亡。蚜虫也是有效的病毒载体，因此有助于病毒性疾病的传播。优选地，所述蚜虫属于棉蚜种。
[0088]“vat基因类似物”是指dogimont等人，cucurbitaceae 2008，第ix届eucarpia葫芦科遗传学和育种会议论文集，avignon(france)，may 21-24th，2008，pp.219-228中描述的负责对蚜虫，更优选对pi 414723种质的棉蚜具有抗性的主要基因。vat基因类似物位于lg5上(dogimont等人，2014，the plant journal，80，993-1004)。在一些实施方式中，vat基因类似物包含或由5897bp的核苷酸序列组成，该核苷酸序列与更新于2015年3月24日的genbank编号km513660.1下引用的vat基因编码的核酸序列(seq id no：46)具有99.8％的同一性。在一些实施方式中，vat基因类似物编码具有1473个氨基酸的氨基酸序列的多肽，其与更新于2014年10月27日的genbank编号aiu36098.1下引用的vat蛋白(seq id no：47)具有99.6％的同一性，即vat基因类似物编码一种多肽，其相对于更新于2014年10月27日的genbank编号aiu36098.1中引用的vat蛋白(seq id no：47)具有6个不同的氨基酸。vat基因类似物的鉴定可如专利申请fr 2849863中所述，使用具有序列5'-ctcccactcagaattggtaggtgcc-3'(seq id no：48)的正向引物me-vate-f和具有序列5'-ccttagaagaagatgaagtctccc-3'(seq id no：49)的反向引物me-vate-r。使用上述引物对，检测到1723bp的片段表明存在vat基因类似物。
[0089]
在本技术的上下文中，使用全局比对计算同一性百分比(即，比较两个序列的整个长度)。比较两个或多个序列的同一性的方法是本领域众所周知的。例如可以使用《needle》程序，其使用needleman-wunsch全局比对算法(needleman和wunsch，1970 j.mol.biol.48：443-453)在考虑它们的整个长度时找到两个序列的最佳比对(包括间隙)。例如，needle程序可在ebi.ac.uk world wide web网站上获得。根据本发明的同一性百分比优选地使用emboss：needle(全局)程序计算，其中“gap open”参数等于10.0，“gap extend”参数等于0.5以及blosum62矩阵。
[0090]
在本发明的上下文中，标记物lg2-m1、cm_mu47536_461、lg2-m2、cm_mu47380_465、lg2-m3、cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cm_mu45437_855和lg5-m3的dna链和等位基因的命名和定位可以按照lllumina开发的top/bot
方法来执行(https://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_topbot.pdf)。
[0091]
snp名称中的cm后缀在下文中可以省略，但指的是甜瓜的相同标记物。
[0092]
在本技术的上下文中，由两个标记物x和y(例如snp)限定的染色体区域是指位于这两个标记物的位置之间并包含所述标记物的染色体部分，因此该染色体区域的核苷酸序列以对应于标记物x的核苷酸开始并以对应于标记物y的核苷酸结束，即标记物包含在它们限定的区域内。
[0093]“与zym基因相关的坏死表型”是指pitrat和lecoq，1984，euphytica，33(1)：57-61中在zym基因纯合存在下所描述的坏死表型。更具体地，这样的坏死表型对应于叶表皮中坏死斑点的出现，其在叶上逐渐扩展并且可以导致叶或茎的完全干燥。
[0094]“商业上可接受的果实品质”是指具有果肉颜色从橙色到红色品红色的夏朗德甜瓜(charentais)、沙滩蜜瓜(western shipper)、蛤蟆甜瓜(harper)或意大利香瓜(italian cantaloup)类型的果实(即具有l*c*h值的比色：60《l《65，40《c《50和66《h75，由minolta比色计测量)，果肉硬度平均值为4kg/0.5cm2+/-2(由penefel测量)，白利糖度为至少11
°
，与vedrantais品种相同的果实直径/空腔大小比率，以及在+12℃下果实保存大于8天。具有商业上可接受的果实品质的果实的实例可以是来自hm-clause的hugo、alonso或felino品种的果实。
[0095]
通过关联或遗传关联，更具体地说是遗传连锁，应理解遗传标记物的多态性(例如snp标记物的特定等位基因)和感兴趣的表型同时发生，即一起遗传，更常见比偶然发生所预期的要多，即由于它们的基因组接近，等位基因和负责表型的遗传序列之间存在非随机关联。
[0096]
序列表
[0097]
seq id no：1显示标记物cm_mu45136_209的侧翼序列。
[0098]
seq id no：2显示了用于检测cm_mu45136_209标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0099]
seq id no：3显示了用于检测cm_mu45136_209标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0100]
seq id no：4显示了用于cm_mu45136_209标记物检测的通用反向引物的序列。
[0101]
seq id no：5显示了标记物lg2-m4的侧翼序列。
[0102]
seq id no：6显示了用于检测lg2-m4标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0103]
seq id no：7显示了用于检测lg2-m4标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0104]
seq id no：8显示了用于lg2-m4标记物检测的通用反向引物的序列。
[0105]
seq id no：9显示了标记物cm_mu45398_32的侧翼序列。
[0106]
seq id no：10显示了用于检测cm_mu45398_32标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0107]
seq id no：11显示了用于检测cm_mu45398_32标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0108]
seq id no：12显示了用于cm_mu45398_32标记物检测的通用反向引物的序列。
[0109]
seq id no：13显示了标记物lg5-m1的侧翼序列。
[0110]
seq id no：14显示了用于cmctn2标记物检测的正向引物的序列。
[0111]
seq id no：15显示了用于cmctn2标记物检测的反向引物的序列。
[0112]
seq id no：16显示了标记物cm_mu46579_322的侧翼序列。
[0113]
seq id no：17显示了用于检测cm_mu46579_322标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0114]
seq id no：18显示了用于检测cm_mu46579_322标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0115]
seq id no：19显示了用于cm_mu46579_322标记物检测的通用反向引物的序列。
[0116]
seq id no：20显示了标记物cm_mu44050_58的侧翼序列。
[0117]
seq id no：21显示了用于检测cm_mu44050_58标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0118]
seq id no：22显示了用于检测cm_mu44050_58标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0119]
seq id no：23显示了用于cm_mu44050_58标记物检测的通用反向引物的序列。
[0120]
seq id no：24显示了用于cmbr120标记物检测的正向引物的序列。
[0121]
seq id no：25显示了用于cmbr120标记物检测的反向引物的序列。
[0122]
seq id no：26显示了标记物lg2-m1的侧翼序列。
[0123]
seq id no：27显示了用于检测lg2-m1标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0124]
seq id no：28显示了用于检测lg2-m1标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0125]
seq id no：29显示了用于lg2-m1标记物检测的通用反向引物的序列。
[0126]
seq id no：30显示了标记物cm_mu47536_461的侧翼序列。
[0127]
seq id no：31显示了用于检测cm_mu47536_461标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0128]
seq id no：32显示了用于检测cm_mu47536_461标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0129]
seq id no：33显示了用于cm_mu47536_461标记物检测的通用反向引物的序列。
[0130]
seq id no：34显示了标记物cm_mu45437_855的侧翼序列。
[0131]
seq id no：35显示了用于检测cm_mu45437_855标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0132]
seq id no：36显示了用于检测cm_mu45437_855标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0133]
seq id no：37显示了用于cm_mu45437_855标记物检测的通用反向引物的序列。
[0134]
seq id no：38显示了用于lg5-m2标记物检测的正向引物的序列。
[0135]
seq id no：39显示了用于lg5-m2标记物检测的反向引物的序列。
[0136]
seq id no：40显示了用于cmtan139标记物检测的正向引物的序列。
[0137]
seq id no：41显示了用于cmtan139标记物检测的反向引物的序列。
[0138]
seq id no：42显示了标记物lg5-m3的侧翼序列。
[0139]
seq id no：43显示了用于检测lg5-m3标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0140]
seq id no：44显示了用于检测lg5-m3标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0141]
seq id no：45显示了用于lg5-m3标记物检测的通用反向引物的序列。
[0142]
seq id no：46代表在genbank编号km513660.1下引用的vat基因的基因组序列。
[0143]
seq id no：47代表genbank编号aiu36098.1下引用的vat蛋白的氨基酸序列。
[0144]
seq id no：48显示了用于扩增vat基因类似物的正向引物的序列。
[0145]
seq id no：49显示了用于扩增vat基因类似物的反向引物的序列。
[0146]
seq id no：50显示了标记物lg2-m2的侧翼序列。
[0147]
seq id no：51显示了用于检测lg2-m2标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0148]
seq id no：52显示了用于检测lg2-m2标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0149]
seq id no：53显示了用于lg2-m2标记物检测的通用反向引物的序列。
[0150]
seq id no：54显示了标记物cm_mu47380_465的侧翼序列。
[0151]
seq id no：55显示了用于检测cm_mu47380_465标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0152]
seq id no：56显示了用于检测cm_mu47380_465标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0153]
seq id no：57显示了用于cm_mu47380_465标记物检测的通用反向引物的序列。
[0154]
seq id no：58显示了标记物lg2-m3的侧翼序列。
[0155]
seq id no：59显示了用于检测lg2-m3标记物的易感等位基因的正向引物的序列。
[0156]
seq id no：60显示了用于检测lg2-m3标记物的抗性等位基因的正向引物的序列。
[0157]
seq id no：61显示了用于lg2-m3标记物检测的通用反向引物的序列。
附图说明
[0158]
图1：该图包括说明实施例中使用的不同甜瓜品系和种质的图片-一张外部照片和一张内部照片。
[0159]
图2：该图是lg2的基因图谱的代表图，如diaz等人，2011年所公开的，lg2的基因图谱上已经添加了本发明的标记物，以及相应的qtl。pm代表抗白粉病；scab代表抗疮痂病，zymv代表抗西葫芦黄花叶病毒。
[0160]
图3：该图是lg5基因图谱的代表图，如diaz等人，2011年所公开的，lg5基因图谱上已经添加了本发明的标记物，以及相应的qtl。pm代表抗白粉病；scab代表抗疮痂病。
具体实施方式
[0161]
因此，根据第一实施方式，本发明涉及一种对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜(c.melo)植物，其中所述植物：
[0162]-包含：
[0163]
(i)赋予对疮痂病具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，
[0164]
(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和
[0165]
(iii)在lg5上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物，和
[0166]-具有商业上可接受的果实品质。
[0167]
根据一优选的实施方式，该植物不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0168]“赋予对疮痂病具有抗性的一个或多个qtl”，必须理解为至少1、2、3、4、5个或更多个赋予对疮痂病具有抗性的qtl，即至少1、2、3、4、5个或更多存在于lg2上的qtl和/或至少1、2、3、4、5或更多个存在于lg5上的qtl。
[0169]“赋予对pm具有抗性的一个或多个qtl”，必须理解为至少1、2、3、4、5个或更多个赋予对pm具有抗性的qtl，即至少1、2、3、4、5个或更多个存在于lg2上的qtl和/或至少1、2、3、4、5或更多个存在于lg5上的qtl，所述赋予对lg2和/或lg5上的pm具有抗性的qtl不同于赋予对疮痂病具有抗性的qtl。
[0170]
在一些实施方式中，存在于lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的所述qtl位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内。
[0171]
在一些实施方式中，存在于lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的所述qtl位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内。
[0172]
在一些实施方式中，存在于lg2上的赋予对pm具有抗性的所述qtl位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内。
[0173]
在一些实施方式中，存在于lg5上的赋予对pm具有抗性的所述qtl位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内。
[0174]
优选地，根据本发明的甜瓜植物包含如上文所定义的qtl的任何组合，具有商业上可接受的果实品质并且不具有任何坏死表型。例如，根据本发明的甜瓜植物可以包含以下与对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性相关的qtl的组合：
[0175]
(a)位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的lg2上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物；
[0176]
(b)位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的lg5上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因；
[0177]
(c)位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的lg5上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物；
[0178]
(d)位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的lg2上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物；
[0179]
(e)位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的lg2上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物；
[0180]
(f)位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的lg5上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物；
[0181]
(g)位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的lg2上的赋予对pm具有抗性的qtl，位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的lg5上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物；
[0182]
(h)位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的lg2上的赋予对pm具有抗性的qtl，位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的lg5上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物；或
[0183]
(i)位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的lg2上的赋予对pm具有抗性的qtl，位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的lg5上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物。
[0184]
因此，在一特别优选的实施方式中，根据本发明的甜瓜植物：
[0185]-包含位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的lg2上的赋予对pm具有抗性的qtl，位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的lg5上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物，
[0186]-具有商业上可接受的果实品质，和
[0187]-不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0188]
在一些实施方式中，lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的所述qtl通过cm_mu45136_209、lg2-m4(seq id no：5)和/或cm_mu45398_32标记物检测来鉴定；或由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的任何其他标记物来鉴定。在一些实施方式中，cm_mu45136_209、lg2-m4和/或cm_mu45398_32标记物的检测通过扩增进行，优选通过pcr，使用可用于扩增cm_mu45136_209、lg2-m4和cm_mu45398_32标记物中的每一个的抗性/易感等位基因的特异性引物进行。
[0189]
具体而言，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg2上的cm_mu45136_209标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，一种对易感等位基因具有特异性。可以选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：1组成的核酸，或包括
在seq id no：1的第209位的[t/c]多态性的其片段。例如，通过扩增由序列seq id no:1或其互补序列组成的核酸来检测标记物cm_mu45136_2009的易感等位基因的正向引物可以由序列5'-acaaatttcttggagctgcaagactta-3'(seq id no：2)组成，通过扩增由序列seq id no:1或其互补序列组成的核酸来检测标记物cm_mu45136_209的抗性等位基因的正向引物可以由序列5'-caaatttcttggagctgcaagacttg-3'(seq id no：3)组成，并且通用反向引物可以由序列5'-tatcatcggttcttgtctcaagaaggaaa-3'(seq id no：4)组成。使用由序列seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4组成的引物，检测由序列seq id no：1组成的扩增产物的第209位的互补链中的鸟嘌呤(g)而不是腺嘌呤(a)，或胞嘧啶(c)而不是胸腺嘧啶(t)，表明lg2上存在赋予对疮痂病具有抗性的qtl(见下表1)。
[0190]
具体而言，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg2上的lg2-m4标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，一种对易感等位基因具有特异性。可以选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：5组成的核酸，或包括在seq id no：5的第61位的[g/a]多态性的其片段。例如，通过扩增由序列seq id no：5组成的核酸来检测标记物lg2-m4的易感等位基因的正向引物可以由序列5'-ttcacaccatttgtaagtttgaactttg-3'(seq id no：6)，通过扩增由序列seq id no：5组成的核酸来检测标记物lg2-m4的抗性等位基因的正向引物可以由序列5'-gttttcacaccattgtaagtttgaacttta-3'(seq id no：7)组成，并且通用反向引物可以由序列5'-gcacgtatgataacgagttctttagtgtt-3'(seq id no：8)组成。使用由序列seq id no：6、seq id no：7和seq id no：8组成的引物检测由序列seq id no：5组成的扩增产物的第61位的腺嘌呤(a)而不是鸟嘌呤(g)，表明lg2上存在赋予对疮痂病具有抗性的qtl(见下表1)。
[0191]
具体而言，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg2上的cm_mu45398_32标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，一种对易感等位基因具有特异性。可以选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：9组成的核酸，或包括在seq id no：9的第32位的[t/c]多态性的其片段。例如，通过扩增由序列seq id no：9组成的核酸来检测标记物cm_mu45398_32的易感等位基因的正向引物可以由序列5'-caaaacagggttgttccgctttact-3'(seq id no：10)组成，通过扩增由序列seq id no：9组成的核酸来检测标记物cm_mu45398_32的抗性等位基因的正向引物可以由序列5'-aaaacagggttgttccgctttacc-3'(seq id no：11)组成，并且通用反向引物可以由序列5
’‑
cgtcttcttcttcttcttctttgttgcta-3'(seq id no：12)组成。使用由序列seq id no：10、seq id no：11和seq id no：12组成的引物检测由序列seq id no：9组成的扩增产物的第32位的胞嘧啶(c)而不是胸腺嘧啶(t)，表明lg2上存在赋予对疮痂病具有抗性的qtl(见下表1)。
[0192]
在一些实施方式中，lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的所述qtl通过lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322和/或cm_mu44050_58标记物检测来鉴定；或由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的任何其他标记物来鉴定。在一些实施方式中，lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322和/或cm_mu44050_58标记物的检测通过扩增进行，优选通过pcr，使用可用于扩增lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322和/或cm_mu44050_58标记物中的每一个的抗性/易感等位基因的特异性引物进行。
[0193]
具体而言，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg5上的lg5-m1标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，一种对易感等位基因具有特异性。可以
选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：13组成的核酸，或包括在seq id no：13的第36位的[t/c]多态性的其片段(见下表1)。可用于例如kaspar测定的适当引物可由技术人员容易地设计。使用允许检测seq id no：13的第36位的[t/c]多态性的引物，检测由序列seq id no：13组成的扩增产物的第36位的互补链中的鸟嘌呤(g)而不是腺苷(a)，或胞嘧啶(c)而不是胸腺嘧啶(t)，表明lg2上存在赋予对疮痂病具有抗性的qtl(见下表1)。
[0194]
具体而言，lg5上cmctn2标记物的检测是通过使用正向引物和反向引物的pcr进行的，所述正向引物和反向引物可用于扩增cmctn2标记物的抗性/易感等位基因。在一些实施方式中，所述pcr之后是用限制酶消化扩增产物或对扩增产物进行测序。具体地，用于扩增cmctn2标记物的正向引物和反向引物可分别包含序列5'-ctgaaagcagtttgtgtcga-3'(seq id no：14)和5'-aaagaaggaagaggctgaga-3'(seq id no：15)。使用由seq id no：14和seq id no：15组成的引物，检测到195bp的扩增产物表明lg5上存在赋予对疮痂病具有抗性的qtl(见下表2)。
[0195]
具体而言，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg5上的cm_mu46579_322标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，一种对易感等位基因具有特异性。可以选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：16组成的核酸，或包括在seq id no：16的第51位的[t/c]多态性的其片段。例如，通过扩增由序列seq id no：16组成的核酸来检测标记物cm_mu46579_322的易感等位基因的正向引物可以由序列5'-tccgatcctcactggaactatct-3'(seq id no：17)组成，通过扩增由序列seq id no：16组成的核酸来检测标记物cm_mu46579_322的抗性等位基因的正向引物可以由序列5'-ccgatcctcactggaactatcc-3'(seq id no：18)组成，以及通用反向引物可以由序列5'-cagcctcatcgactgtgaacttcat-3'(seq id no：19)组成。使用由序列seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19组成的引物，检测由序列seq id no：16组成的扩增产物的第51位的互补链中的鸟嘌呤(g)而不是腺嘌呤(a)，或胞嘧啶(c)而不是胸腺嘧啶(t)，表明lg5上存在赋予对疮痂病具有抗性的qtl(见下表1)。
[0196]
具体而言，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg5上的cm_mu44050_58标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，另一种对易感等位基因具有特异性。可以选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：20组成的核酸，或包括在seq id no：20的第58位的[t/c]多态性的其片段。例如，通过扩增由序列seq id no：20组成的核酸来检测标记物cm_mu44050_58的易感等位基因的正向引物可以由序列5'-gcgttgctttcatggcgagcttt-3'(seq id no：21)组成，通过扩增由序列seq id no：20组成的核酸来检测标记物cm_mu44050_58的抗性等位基因的正向引物可以由序列5'-cgttgctttcatggcgagcttc-3'(seq id no：22)组成，以及通用反向引物可以由序列5'-ctgtggaacggagaagctcaaagaa-3'(seq id no：23)组成。使用由序列seq id no：21、seq id no：22和seq id no：23组成的引物，检测由序列seq id no：20组成的扩增产物的第58位的互补链中的鸟嘌呤(g)而不是腺嘌呤(a)，或胞嘧啶(c)而不是胸腺嘧啶(t)，表明lg5上存在赋予对疮痂病具有抗性的qtl(见下表1)。
[0197]
在一些实施方式中，lg2上的赋予对pm具有抗性的所述qtl通过cmbr120、lg2-m1(seq id no：26)和/或cm_mu47536_461标记物检测来鉴定；或由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的任何其他标记物来鉴定。在一些实施方式中，
cmbr120、lg2-m1和/或cm_mu47536_461标记物的检测通过扩增进行，优选通过pcr，使用可用于扩增cmbr120、lg2-m1和/或cm_mu47536_461标记物中的每一个的抗性/易感等位基因的特异性引物进行。
[0198]
具体而言，lg2上的cmbr120标记物的检测是通过使用正向引物和反向引物的pcr进行的，其可用于扩增cmbr120标记物的抗性/易感等位基因。在一些实施方式中，所述pcr之后是用限制酶消化扩增产物或对扩增产物进行测序。具体地，用于扩增cmbr120标记物的正向引物和反向引物可分别包含序列5'-ctggccccctcctaaactaa-3'(seq id no：24)和5'-caaaaagcatcaaaatggttg-3'(seq id no：25)。使用由seq id no：24和seq id no：25组成的引物，检测到165bp的扩增产物表明在lg2上存在赋予对pm具有抗性的qtl(见下表2)。
[0199]
具体而言，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg2上的lg2-m1标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，一种对易感等位基因具有特异性。可以选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：26组成的核酸，或包括在seq id no：26的第69位的[c/t]多态性的其片段。例如，通过扩增由序列seq id no：26或其互补序列组成的核酸来检测标记物lg2-m1的易感等位基因的正向引物可以由序列5'-cctcatttgggccccggg-3'(seq id no：27)组成，通过扩增由序列seq id no：26或其互补序列组成的核酸来检测标记物lg2-m1的抗性等位基因的正向引物可以由序列5'-aatcctcatttgggccccgga-3'(seq id no：28)组成，并且通用反向引物可以由序列5'-tcatggcttctgatactcgttctgatat-3'(seq id no：29)组成。使用由序列seq id no：27、seq id no：28和seq id no：29组成的引物，检测由序列seq id no：26组成的扩增产物的第69位的互补链中的腺嘌呤(a)而不是鸟嘌呤(g)，或胸腺嘧啶(t)而不是胞嘧啶(c)，表明在lg2上存在赋予对pm具有抗性的qtl(见下表1)。
[0200]
特别是，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg2上的cm_mu47536_461标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，一种对易感等位基因具有特异性。可以选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：30组成的核酸，或包括在seq id no：30的第51位的[a/t]多态性的其片段。例如，通过扩增由序列seq id no：30组成的核酸来检测标记物cm_mu47536_461的易感等位基因的正向引物可以由序列5'-atgtacaagattttgataatgtgattgataca-3'(seq id no：31)组成，通过扩增由序列seq id no：30组成的核酸来检测标记物cm_mu47536_461的抗性等位基因的正向引物可以由序列5'-atgtacaagattttgataatgtgattgatact-3'(seq id no：32)组成，并且通用反向引物可以由序列5'-cgaagaatattagctgagcctttgatgtt-3'(seq id no：33)组成。使用由序列seq id no：31、seq id no：32和seq id no：33组成的引物，检测由序列seq id no：30组成的扩增产物的第51位的胸腺嘧啶(t)而不是腺嘌呤(a)，表明lg2上存在赋予对pm具有抗性的qtl(见下表1)。
[0201]
在一些实施方式中，lg5上的赋予对pm具有抗性的所述qtl通过cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和/或lg5-m3标记物检测来鉴定；或由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的任何其他标记物来鉴定。在一些实施方式中，cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和/或lg5-m3标记物的检测通过扩增进行，优选通过pcr，使用可用于扩增cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和/或lg5-m3标记物中的每一个的抗性/易感等位基因的特异性引物进行。
[0202]
具体而言，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg5上的cm_mu45437_
855标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，一种对易感等位基因具有特异性。可以选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：34组成的核酸，或包括在seq id no：34的第51位的[g/a]多态性的其片段。例如，通过扩增由序列seq id no：34组成的核酸来检测标记物cm_mu45437_855的易感等位基因的正向引物可以由序列5'-aaagtttctgtgtattaaatctgaactcg-3'(seq id no：35)组成，通过扩增由序列seq id no：34组成的核酸来检测标记物cm_mu45437_855的抗性等位基因的正向引物可以由序列5'-aattaaagtttctgtgtattaaatctgaactca-3'(seq id no：36)组成，并且通用反向引物可以由序列5'-cagagcacgtttcgaaggcacatat-3'(seq id no：37)组成。使用由序列seq id no：35、seq id no：36和seq id no：37组成的引物，检测由序列seq id no：34组成的扩增产物的第51位的腺嘌呤(a)而不是鸟嘌呤(g)，表明lg5上存在赋予对pm具有抗性的qtl(见下表1)。
[0203]
具体而言，lg5上的lg5-m2标记物的检测是通过使用正向引物和反向引物的pcr进行的，正向引物和反向引物可用于扩增lg5-m2标记物的抗性/易感等位基因。在一些实施方式中，所述pcr之后是用限制酶消化扩增产物或对扩增产物进行测序。具体地，用于扩增lg5-m2标记物的正向引物和反向引物可分别包含序列5'-cactttctaataatgtttggaaaagag-3'(seq id no：38)和5'-gagaatgtctctttatctac-3'(seq id no：39)。使用由seq id no：38和seq id no：39组成的引物，检测到178bp的扩增产物表明在lg5上存在赋予对pm具有抗性的qtl(参见下表2)。
[0204]
具体而言，lg5上cmtan139标记物的检测是通过pcr使用正向引物和反向引物进行的，正向引物和反向引物可用于扩增cmtan139标记物的抗性/易感等位基因。在一些实施方式中，所述pcr之后是用限制酶消化扩增产物或对扩增产物进行测序。特别地，用于扩增cmtan139标记物的正向引物和反向引物可分别包含序列5'-cgtagaagacacacataatg-3'(seq id no：40)和5'-gaactagaaccacaaatcac-3'(seq id no：41)。使用由seq id no：40和seq id no：41组成的引物，检测到134bp的扩增产物表明在lg5上存在赋予对pm具有抗性的qtl(见下表2)。
[0205]
具体而言，使用两种正向引物以及一种通用反向引物检测lg5上的lg5-m3标记物，两种正向引物中一种对抗性等位基因具有特异性，一种对易感等位基因具有特异性。可以选择所述两个正向引物以便能够扩增包含或由seq id no：42组成的核酸，或包括在seq id no：42的第51位的[c/t]多态性的其片段。例如，通过扩增由序列seq id no：42或其互补序列组成的核酸来检测标记物lg5-m3的易感等位基因的正向引物可以由序列5'-cagtcacagaatttgtagtagacttatag-3'(seq id no：43)组成，通过扩增由序列seq id no：42或其互补序列组成的核酸来检测标记物lg5-m3的抗性等位基因的正向引物可以由序列5'-cagtcacagaatttgtagtagacttataa-3'(seq id no：44)组成，并且通用反向引物可以由序列5'-agagtttctttctaacgggcattgagatt-3'(seq id no：45)组成。使用由序列seq id no：43、seq id no：44和seq id no：45组成的引物，检测由序列seq id no：42组成的扩增产物的第51位的互补链中的腺嘌呤(a)而不是鸟嘌呤(g)，或胸腺嘧啶(t)而不是胞嘧啶(c)，表明在lg5上存在赋予对pm具有抗性的qtl(见下表1)。
[0206]
在一些实施方式中，所述与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物通过具有序列5'-ctcccactcagaattggtaggtgcc-3'(seq id no：48)的正向引物me-vate-f和具有序列5'-ccttagaagaagatgaagtctccc-3'(seq id no：49)的反向引物me-vate-r的扩增产物来鉴定。
使用这对引物，检测到1723bp的片段表明存在vat基因类似物。
[0207]
赋予对疮痂病和白粉病(pm)具有抗性的等位基因由上文定义的标记物扩增，如表1和表2所述。
[0208]
[0209]
[0210]
[0211][0212]
表2：由标记物lg5-m3、cmtan139、cmtcn2、cmbr120和mevate扩增的抗性等位基因。
[0213]
在一些实施方式中，赋予对疮痂病、pm和蚜虫具有抗性的所述qtl通过以下检测来鉴定：
[0214]-(1)cm_mu45136_209的等位基因c、lg2-m4的等位基因a和cm_mu45398_32的等位基因c，
[0215]-(2)lg5-m1的等位基因c、cmctn2的195bp的等位基因、cm_mu46579_322的等位基因c和cm_mu44050_58的等位基因c，
[0216]-(3)cmbr120的165bp的等位基因、lg2-m1的等位基因t和cm_mu47536_461的等位基因t，
[0217]-(4)cm_mu45437_855的等位基因a、lg5-m2的178bp的等位基因、cmtan139的134bp的等位基因和lg5-m3的等位基因t，或
[0218]-(5)me_vate的1723bp的等位基因。
[0219]
在赋予对疮痂病、pm和蚜虫具有抗性的qtl可以通过表1和表2中描述的特定等位基因鉴定的范围内，本发明的植物优选地包含如上文所定义的等位基因的任何组合，具有商业上可接受的果实品质并且任选地没有任何坏死表型。例如，根据本发明的甜瓜植物可以包含以下与对疮痂病、pm和蚜虫具有抗性相关的等位基因的组合：
[0220]
i)等位基因的组合(1)、(3)和(5)，
[0221]
ii)等位基因的组合(2)、(4)和(5)，
[0222]
iii)等位基因的组合(1)、(4)和(5)，
[0223]
iv)等位基因的组合(2)、(3)和(5)，
[0224]
v)等位基因的组合(1)、(2)、(3)和(5)，
[0225]
vi)等位基因的组合(1)、(2)、(4)和(5)，
[0226]
vii)等位基因的组合(1)、(3)、(4)和(5)，
[0227]
viii)等位基因的组合(2)、(3)、(4)和(5)，或
[0228]
ix)等位基因的组合(1)、(2)、(3)、(4)和(5)。
[0229]
因此，在一特别优选的实施方式中，根据本发明的甜瓜植物：
[0230]-包含上文定义的等位基因的组合ix)，
[0231]-具有商业上可接受的果实品质，和
[0232]-任选地不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0233]
在一些实施方式中，所述一种或多种与枝孢属、蚜虫和白粉病抗性相关的qtl选自mtyvvc721品系的植物基因组中存在的那些，其种子保藏在ncimb保藏号43317下。
[0234]
在一些实施方式中，所述一种或多种与对枝孢属、蚜虫和白粉病的抗性相关的qtl如在对应于保藏材料mtyvvc721(ncimb保藏号43317)的植物基因组中发现的那样。
[0235]
在一些实施方式中，根据本发明的甜瓜植物是品系mtyvvc721，其种子保藏在ncimb保藏号43317下。
[0236]
在一些实施方式中，根据本发明的植物可以是从保藏在保藏号为43317下的ncimb的甜瓜品系mtyvvc721的保藏种子生长的植物的后代或子代。从保藏的种子长出的植物确实对疮痂病、蚜虫和白粉病具有纯合抗性，它们具有商业上可接受的果实品质，并且没有与zym基因相关的任何坏死表型，即因此它们在其基因组中的lg2和lg5上携带有在纯合状态下与如上文定义的疮痂病、蚜虫和白粉病的抗性相关的qtl；没有携带与zym基因相关的任何坏死表型。它们可用于通过杂交和自交和/或回交在另一个背景中转移lg2和lg5上的所述qtl，而不转移与zym基因相关的任何坏死表型。从保藏的种子获得的植物子代可由本领域技术人员鉴定，例如通过使用标记物cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cmbr120、lg2-m1、cm_mu47536_461、cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139、lg5-m3和/或me-vate来鉴定。优选地，这样的子代由至少2个，更优选至少3个所述标记物鉴定；根据一优选实施方式，至少一个标记物与lg2或lg5上的抗疮痂病相关的qtl相关，至少一个标记物与lg2或lg5上的抗白粉病相关的qtl相关；第三种标记物可以是与抗蚜虫相关的标记物，例如me-vate。
[0237]
对疮痂病、蚜虫和白粉病的抗性有利地通过与易感(商业)品系(例如v
é
drantais品系)比较来确定。优选地，如实施例1.1中详述的那样基于植物在单叶阶段的接种试验来测定对枝孢属的抗性。优选地，如实施例1.2中详述的那样基于在单叶阶段的接种试验，或基于在分离的叶片上施用喷洒试验来测定对pm的抗性。优选地，如现有技术中所公开的那样测定对蚜虫的抗性。
[0238]
根据第二方面，本发明涉及根据本发明的植物的部分。
[0239]
在一些实施方式中，植物的一部分是植物细胞。因此，本发明提供了根据本发明的甜瓜植物的细胞，即植物细胞：
[0240]-包含：
[0241]
(i)与疮痂病抗性相关的一种或多种qtl，其中所述一种或多种qtl映射到连锁群2(lg2)和/或连锁群5(lg5)，
[0242]
(ii)与白粉病抗性相关的一种或多种qtl，其中所述一种或多种qtl映射到lg2和/或lg5，并且不同于(i)中的所述一种或多种qtl，和
[0243]
(iii)与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物。
[0244]
lg2和lg5上的所述qtl的不同特征已经结合本发明的第一方面进行了定义，并且经过必要的修改后适用于本发明的这一方面。因此，所述qtl优选选自存在于对应于保藏材料mtyvvc721(ncimb保藏号43317)的植物基因组中的那些。在一些实施方式中，lg2和lg5上的赋予对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的所述qtl在对应于保藏材料mtyvvc721(ncimb保藏号43317)的植物基因组中发现。
[0245]
在一些实施方式中，lg2和lg5上的赋予对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的所述qtl如本发明的第一方面中所定义。
[0246]
在一些实施方式中，赋予对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的等位基因如表1和2中所述。
[0247]
在一些实施方式中，根据本发明的植物部分包含如本发明第一方面所定义的等位基因的组合i)至ix)。
[0248]
在一些实施方式中，如上文所述的等位基因的组合如在对应于保藏材料mtyvvc721(ncimb保藏号43317)的植物基因组中发现的那样。
[0249]
本发明的植物细胞可以具有再生长为完整植物的能力，所述植物具有商业上可接受的果实品质，并且不具有任何坏死表型。
[0250]
或者，本发明还涉及不可再生的植物细胞，因此不能长成完整的植物。
[0251]
优选地，根据本发明的植物细胞包含位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl，位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的lg2上的赋予对pm具有抗性的qtl，位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的lg5上的赋予对pm具有抗性的qtl，以及与lg5上的蚜虫抗性相关的vat基因类似物。
[0252]
根据另一种实施方式，植物部分是根据本发明的植物的任何其他部分，它可以特别是种子、繁殖材料、根、花、果实、根状茎或接穗。
[0253]
前面部分中结合本发明的第一方面详述的所有实施方式也是根据本发明的第二方面的优选实施方式。
[0254]
本发明更具体地涉及甜瓜植物的种子，其在生长成对如上所定义的疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的甜瓜植物时产生。这样的种子因此是“本发明的植物的种子”，即生长为本发明植物的种子。本发明还涉及来自本发明植物的种子，即自交或杂交后从此类植物获得的种子，但条件是从所述种子获得的植物对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性，这是因为如上所定义的lg2和lg5上的qtl赋予了所述抗性，优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0255]
本发明还涉及根据本发明如上所定义的植物的可再生细胞的组织培养物；优选地，可再生细胞来源于本发明的胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、茎、叶柄、根、根尖、果实、种子、花、子叶和/或下胚轴，因此在它们的基因组中包含lg2和lg5上的赋予对如上所述的疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的qtl。
[0256]
组织培养物将优选地能够再生具有前述甜瓜植物的生理学和形态学特征的植物，并且能够再生具有与前述甜瓜植物基本相同的基因型的植物。本发明还提供了从本发明的组织培养物再生的甜瓜植物。
[0257]
本发明还提供了上文定义的植物或来自上文定义的组织培养物的原生质体，所述原生质体在其基因组中包含lg2和lg5上的赋予对如上所述的疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的qtl。
[0258]
前面部分中结合本发明的第一方面详述的所有实施方式也是根据本发明的第二方面的实施方式。
[0259]
根据第三方面，本发明还涉及如根据本发明的第一方面详述的甜瓜植物的用途，即抗疮痂病、蚜虫和白粉病，作为育种程序中的育种配偶体获得对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的甜瓜植物。实际上，根据第一方面的这样的甜瓜植物在其基因组中含有如上文定义的赋予所述抗性的qtl，优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型。通过将该植物与易感或抗性较差的植物杂交，因此可以将这些qtl转移给子代，从而赋予子代所需的表型。因此，根据本发明的植物可用作育种配偶体，用于渗入qtl，从而将所需表型赋予甜瓜植物或种质(即不渗入与zym基因相关的任何坏死表型)。本发明还针对保藏于ncimb的保藏号为43317的mtyvvc721的植物或种子的相同用途。所述植物也适合作为旨在赋予甜瓜植物或种质所需表型的育种程序中的基因渗入配偶体。
[0260]
在这样的育种程序中，显示所需表型或带有与所需表型连锁的序列的子代的选择可以有利地基于上文公开的标记物的等位基因进行。优选地，子代在存在一个或多个以下特定等位基因时选择：cm_mu45136_209的等位基因c、lg2-m4的等位基因a、cm_mu45398_32的等位基因c、lg5-m1的等位基因c、cmctn2的195bp的等位基因、cm_mu46579_322的等位基因c、cm_mu44050_58的等位基因c，cmbr120的165bp的等位基因，lg2-m1的等位基因t、cm_mu47536_461的等位基因t、cm_mu45437_855的等位基因a、lg5-m2的178bp的等位基因、cmtan139的134bp的等位基因、lg5-m3的等位基因t和me_vate的1723bp的等位基因。优选地，子代根据如本发明第一方面所定义的等位基因的组合i)至ix)的存在来选择。
[0261]
也可以在病原体侵染的条件下选择具有所需表型的子代，如在实施例的scab试验和/或pm试验部分中公开的，或使用技术人员熟知的其他测试。
[0262]
因此，根据本发明的植物，或以保藏号ncimb 43317保藏的植物，在用于获得对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性但优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型的商业甜瓜品系和品种的标记物辅助选择程序中特别有价值。
[0263]
为本发明的第一和第二方面描述的任何实施方式也适用于本发明的该方面。
[0264]
本发明还涉及所述植物在旨在鉴定、测序和/或克隆赋予所需表型的遗传序列的程序中的用途。
[0265]
针对本发明的前述方面描述的任何特定实施方式也适用于本发明的该方面，尤其是关于赋予感兴趣的表型的qtl的特征。
[0266]
根据另一个方面，本发明还涉及生产对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的甜瓜植物，尤其是商业植物的方法。用于生产具有这些特征的植物的方法或过程包括以下步骤：
[0267]
a)将根据本发明第一方面的植物(例如对应于保藏的种子(ncimb 43317)的植物)与易感或抗性较差的甜瓜植物杂交，其中所需的表型将被导入或改进，
[0268]
b)选择一种对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的植物，但优选在由此获得的子代中不具有与zym基因相关的任何坏死表型，或一种带有与对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性相关的qtl的植物，但优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型，
[0269]
c)任选地自花授粉一倍或数倍于步骤b)获得的抗性植物，并选择对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的植物，但优选地在由此获得的子代中不具有与zym基因相关的任何坏死表型，
[0270]
d)将步骤b)或c)中选择的抗性植物与易感的甜瓜植物(即对疮痂病、蚜虫和/或白粉病易感)回交，和
[0271]
e)选择对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的植物，但优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0272]
或者，该方法或过程可包括以下步骤：
[0273]
a1)将根据本发明第一方面的植物(例如对应于保藏的种子(ncimb 43317)的植物)与易感或抗性较差的甜瓜植物杂交，其中所需的表型将被导入或改进，从而产生f1群体，
[0274]
a2)f1群体自交以产生f2群体，
[0275]
b)选择抗性个体，并且优选在由此获得的子代中不具有与zym基因相关的任何坏死表型，
[0276]
c)任选地自花授粉一倍或数倍于步骤b)中获得的抗性植物，并选择与由此获得的子代中优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型的抗性植物，
[0277]
d)将步骤b)或c)中选择的抗性植物与易感的甜瓜植物(即对疮痂病、蚜虫和/或白粉病易感)回交，
[0278]
e)选择对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的植物，优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0279]
在一些实施方式中，可以在步骤b)、c)和e)中选择对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性，但不具有与zym基因相关的任何坏死表型的植物。
[0280]
步骤e)中选择的植物优选是商业植物，尤其是具有果肉颜色从橙色到红色品红色(red magenta)的夏朗德甜瓜(charentais)、沙滩蜜瓜(western shipper)、蛤蟆甜瓜(harper)或意大利香瓜(italian cantaloup)类型(即具有l*c*h值的比色：60《l《65、40《c《50和66《h75，由minolta比色计测量)，果肉硬度平均值为4kg/0.5cm2+/-2(由penefel测量)，白利糖度为至少11
°
，与vedrantais品种相同的果实直径/空腔大小比率，以及在+12℃下果实保存大于8天的植物。
[0281]
优选地，步骤d)和e)重复至少两次并且优选三次，不一定使用相同的易感甜瓜植物。所述易感甜瓜植物优选是育种系。
[0282]
自花授粉和回交步骤可以以任何顺序进行并且可以插入，例如回交可以在一次或几次自花授粉之前和之后进行，并且自花授粉可以设想在一次或几次回交之前和之后进行。
[0283]
在一些实施方式中，这样的方法有利地通过使用如上所述的用于在步骤b)、c)和/或e)中进行的一种或多种选择的标记物来进行，以选择对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的植物，优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0284]
在一些实施方式中，用于选择对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性且优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型的植物的标记物是：
[0285]-标记物cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、lg2-m1、cm_mu47536_461、cmbr120和me-vate中的一种或多种，或所有标记物cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、lg2-m1、cm_mu47536_461、cmbr120和me-vate，
[0286]-标记物lg5-m1、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cmctn2、cm_mu45437_855、lg5-m3、lg5-m2、cmtan139和me-vate中的一种或多种，或所有标记物lg5-m1、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cmctn2、cm_mu45437_855、lg5-m3、lg5-m2、cmtan139和me-vate，
[0287]-标记物cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、lg2-m1、cm_mu47536_461、cmbr120、lg5-m1、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cmctn2、cm_mu45437_855、lg5-m3、lg5-m2、cmtan139和me-vate中的一种或多种，或所有标记物cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、lg2-m1、cm_mu47536_461、cmbr120、lg5-m1、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cmctn2、cm_mu45437_855、lg5-m3、lg5-m2、cmtan139和me-vate。
[0288]
在一些实施方式中，在步骤b)、c)和/或e)中的任一个步骤选择的植物优选地基于存在如本发明第一方面中定义的等位基因的组合i)至ix)中的一种来选择。
[0289]
具有所需表型的子代的选择也可以在病原体侵染的条件下进行，尤其是在实施例的scab试验和/或pm试验部分中公开的，或者使用本领域技术人员熟知的其他试验。
[0290]
用于等位基因检测的方法可以基于允许在特定染色体上区分标记物的两个不同等位基因的任何技术。
[0291]
本发明还涉及通过这种方法获得或可获得的甜瓜植物。根据本发明的第一方面，这样的植物确实是对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的甜瓜植物。
[0292]
根据进一步的方面，本发明还涉及可通过杂交根据本发明的第一方面的抗性植物获得的杂种甜瓜植物，例如植物mtyvvc721，种子的代表性样品已保藏在ncimb保藏号43317；或通过上述方法与甜瓜植物(例如对疮痂病、蚜虫和白粉病易感的植物，或对疮痂病、蚜虫和白粉病感染具有不同水平抗性的植物)杂交获得的抗性植物。特别优选的杂交甜瓜植物是显示农艺学兴趣的任何性状或表型的植物。
[0293]
本发明还涉及一种获得对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的商业甜瓜植物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0294]-将通过使保藏的种子mtyvvc721(ncimb保藏号43317)或根据本发明第一方面的甜瓜植物发芽获得的植物与甜瓜植物(例如对疮痂病、蚜虫和白粉病易感的甜瓜植物)回交，
[0295]-选择对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的植物，优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0296]
第二步中的选择优选如上文针对本发明的其他方法所详述的那样进行。所述选择优选在标记物的一种或多种特定等位基因和如上所述的vat基因类似物的存在下进行，如在品系mtyvvc721中发现的。
[0297]
所选择的植物优选是商业植物，尤其是具有果肉颜色从橙色到红色品红色的夏朗德甜瓜、沙滩蜜瓜、蛤蟆甜瓜或意大利香瓜类型(即具有l*c*h值的比色：60《l《65、40《c《50和66《h75，由minolta比色计测量)，果肉硬度平均值为4kg/0.5cm2+/-2(由penefel测量)，白利糖度为至少11
°
，与vedrantais品种相同的果实直径/空腔大小比率，以及在+12℃下果实保存大于8天的植物。
[0298]
还提供了用于生产甜瓜植物种子的方法。在一些实施方式中，该方法包括将根据本发明的甜瓜植物与其自身或与另一甜瓜植物杂交，并收获所得种子。
[0299]
除了如本发明方法中详述的与对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性相关的qtl的渗入外，还可以通过基因工程将所述序列引入甜瓜背景中，以获得对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性的商业化的甜瓜植物。鉴定和克隆来自甜瓜的赋予所需表型的渗入qtl(特别是来自保藏物)，对于技术人员来说是常规的。
[0300]
根据另一方面，本发明提供了通过上述方法之一获得或可获得的植物。这样的植物确实是具有根据本发明的第一方面的所需表型的甜瓜植物，即对疮痂病、蚜虫和白粉病具有抗性并且优选不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0301]
应当指出，本发明的种子或植物可以通过不同的方法获得，特别是技术方法，例如uv诱变或基因工程，例如引导重组，并且不排他地通过本质上的生物学过程获得。
[0302]
根据这样的方面，本发明涉及一种甜瓜植物或种子，优选地是一种非天然存在的甜瓜植物或种子，其可以在其基因组中包含一个或多个突变，这为突变植物提供了对疮痂病、蚜虫和白粉病的抗性，其突变存在于例如植物的基因组中，该植物的代表性样品以保藏号ncimb 43317保藏在ncimb中。
[0303]
优选地，突变是(i)赋予对疮痂病具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和(iii)在lg5上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物的整合，以替代甜瓜植株的同源序列。甚至更优选地，突变是(i)将甜瓜基因组的lg2上的由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu15398_32限定的序列或其片段替换为存在于植物基因组中的lg2上的同源序列，该植物的代表性样品以保藏号ncimb 43317保藏在ncimb中，(ii)将甜瓜基因组的lg5上的由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的序列或其片段替换为存在于植物基因组中的lg5上的同源序列，该植物的代表性样品以保藏号ncimb 43317保藏在ncimb中，(iii)将甜瓜基因组的lg2上的由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的序列或其片段替换为存在于植物基因组中的lg2上的同源序列，该植物的代表性样品以保藏号ncimb 43317保藏在ncimb中，(iv)将甜瓜基因组的lg5上的由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的序列或其片段替换为存在于植物基因组中的lg5上的同源序列，该植物的代表性样品以保藏号ncimb 43317保藏在ncimb中，和(v)vat基因类似物，其中序列或其片段赋予对疮痂病、蚜虫和pm的组合抗性。
[0304]
在一种实施方式中，本发明涉及一种用于获得在其基因组中携带一个或多个突变的甜瓜植物或种子的方法，其为植物提供对疮痂病、蚜虫和pm的抗性。这种方法在实施例6中举例说明并且可以包括：
[0305]
a)用诱变剂处理待修饰的甜瓜植物的m0种子，以获得m1种子；
[0306]
b)利用由此获得的m1种子生长植物，以获得m1植物；
[0307]
c)通过m1植物的自花授粉生产m2种子；和
[0308]
d)任选地重复步骤b)和c)n次，以获得m2+n种子。
[0309]
m2+n种子长成植物并遭受疮痂病、蚜虫和pm侵染。存活的植物，或那些具有较轻的疮痂病、蚜虫和pm侵染症状的植物，繁殖一代或多代，同时继续选择它们对疮痂病、蚜虫和pm的抗性。在该方法中，步骤a)的m1种子可以通过ems诱变等化学诱变获得。其他化学诱变剂包括但不限于硫酸二乙酯(des)、乙撑亚胺(ei)、丙烷磺内酯、n-甲基-n-亚硝基氨基甲酸酯(mnu)、n-亚硝基-n-甲基脲(nmu)、n-乙基-n-亚硝基脲(enu)和叠氮化钠。或者，突变是通过辐射诱导的，辐射例如选自x射线、快中子、uv辐射。
[0310]
在本发明的另一个实施方式中，突变是通过基因工程诱导的。此类突变还包括赋予对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性的序列的整合，以及通过赋予对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性
的替代序列替换驻留序列。
[0311]
可以使用的基因工程手段包括使用所有这些被称为新育种技术的技术，这些技术是开发和/或用于通过基因变异在植物中创造新特性的各种新技术，目的是靶向诱变、靶向引入新基因或基因沉默(rddm)。此类新育种技术的实例包括通过使用锌指核酸酶(zfn)技术(zfn-1、zfn-2和zfn-3，见美国专利no.9,145,565，通过引用全部并入)、寡核苷酸定向突变(odm)、同源转基因(cisgenesis)和种内转基因(intragenesis)促进的靶向序列变化、rna依赖性dna甲基化(rddm，不一定改变核苷酸序列，但可以改变序列的生物活性)、嫁接(在gm根状茎上)、反向育种、农业渗透(农业渗透“狭义”、农业接种、花卉浸种)、35转录激活物样效应器核酸酶(talens，见美国专利no.8,586,363和9,181,535，通过引用全部并入)、crispr/cas系统(见美国专利no.8,697,359；8,771,945；8,795,965；8,865,406；8,871,445；8,889,356；8,895,308；8,906,616；8,932,814；8,945,839；8,993,233和8,999,641，均通过引用全部并入此处)、工程化巨核酶重组归巢内切酶，dna引导的基因组编辑(gao等人，nature biotechnology(2016)，doi:10.1038/nbt.3547，通过引用全部并入)和合成5基因组学)。今天的目标基因组编辑的一个主要部分，即新育种技术的另一个名称，是在基因组中预期进行修饰的选定位置诱导dna双链断裂(dsb)的应用。定向修复dsb允许定向基因组编辑。此类应用可用于产生突变(例如，靶向突变或精确的天然基因编辑)以及基因的精确插入(例如，顺式基因(cisgenes)、基因内基因(intragenes)或转基因)。导致突变的应用通常被认为是定点核酸酶(sdn)技术，如sdn1、sdn2和sdn3。对于sdn1，其结果是一种靶向的、非特异性的基因缺失突变：dna dsb的位置被精确选择，但宿主细胞的dna修复是随机的，并导致小的核苷酸缺失、添加或替换。对于sdn2，sdn被用于生成目标dsb，dna修复模板(与目标dsb dna序列相同的短dna序列，除了一个或几个核苷酸变化)用于修复dsb：这导致所需目的基因中的目标和预定点突变。对于sdn3，sdn与包含新dna序列(例如基因)的dna修复模板一起使用。这项技术的结果是将dna序列整合到植物基因组中。说明sdn3用途的最可能的应用是在选定的基因组位置插入顺基因(cisgenic)、基因内(intragenic)或转基因表达盒。欧洲委员会联合研究中心(jrc)前瞻性技术研究所于2011年发表的题为“新植物育种技术-最新技术和商业发展前景(new plant breeding techniques-state-of-the-art and prospects for commercial developmen)”的报告中对每一种技术都有完整的描述，该报告全文通过引用并入本文。
[0312]
本发明还提供了一种检测和/或选择对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性并且任选地不具有与zym基因相关的任何坏死表型的甜瓜植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0313]
(i)检测赋予对疮痂病具有抗性的至少一种qtl的存在，其中所述至少一种qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，
[0314]
(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和
[0315]
(iii)检测lg5上的与蚜虫抗性相关的vat基因类似物的存在，和
[0316]
(iv)任选地检测与zym基因相关的坏死表型的不存在。
[0317]
优选地，存在于lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的所述qtl位于由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内。在一些实施方式中，存在于lg2
上的所述qtl可通过扩增以下标记物中的任一种来鉴定：cm_mu45136_209、lg2-m4和cm_mu45398_32；或由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的任何其他标记物。
[0318]
优选地，存在于lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的所述qtl位于由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内。在一些实施方式中，存在于lg5上的所述qtl可以通过扩增以下标记物中的任一个来鉴定：lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322和cm_mu44050_58；或由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的任何其他标记物。
[0319]
优选地，存在于lg2上的赋予对pm具有抗性的所述qtl位于由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内。在一些实施方式中，存在于lg2上的所述qtl可以通过扩增以下标记物中的任何一个来鉴定：cmbr120、lg2-m1和cm_mu47536_461；或由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的任何其他标记物。
[0320]
优选地，存在于lg5上的赋予对pm具有抗性的所述qtl位于由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内。在一些实施方式中，存在于lg5上的所述qtl可通过扩增以下标记物中的任一种来鉴定：cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3；或由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的任何其他标记物。
[0321]
根据一优选的实施方式，根据本发明的植物在lg2上不包含纯合的zym基因。然而，本发明的植物可以杂合地包含这样的提供对马铃薯y病毒组特别是zymv具有抗性的基因。因此，本发明的方法或过程优选还包括检测zym基因是否存在的步骤。
[0322]
如本技术的实验部分，尤其是实施例5中详述的，提供抗性的zym基因的存在可以通过snp标记物lg2-m2(seq id no：50)、cm-mu47380_465(也称为mu47380_465，seq id no：54)和/或lg2-m3(seq id no：58)检测。优选地，存在于lg2上的赋予对zymv具有抗性的所述qtl或基因位于由标记物lg2-m2和lg2-m3限定的染色体区域内。在一些实施方式中，存在于lg2上的所述qtl可通过扩增以下标记物中的任一种来鉴定：lg2-m2、cm-mu47380_465和lg2-m3；或由标记物lg2-m2和标记物lg2-m3限定的染色体区域内的任何其他标记物。根据本发明，如果植物包含至少一个以下等位基因：lg2-m2的等位基因c、mu47380_465的等位基因g或lg2-m3的等位基因a，则选择植物。这些等位基因确实代表赋予马铃薯y病毒组抗性的qtl或基因的不存在，因此检测到一个或多个这些等位基因表明zym基因不是纯合存在的，从而确保不存在与zym基因相关的坏死表型。
[0323]
与zymv抗性相关的标记物和等位基因如表d中所述。表g中报告了可用于扩增标记物序列和区分snp的不同等位基因的潜在引物。
[0324]
在一些实施方式中，如果在待选植物的遗传物质样品中检测到如本发明的第一方面所定义的等位基因的组合i)至ix)中的任何一个，则选择植物。优选地，如果在待选植物的遗传物质样品中检测到如本发明的第一方面所定义的等位基因的组合ix)，则选择植物。
[0325]
优选地，除了如本发明的第一方面所定义的等位基因的组合i)至ix)之外，如果检测到代表不存在zym基因的等位基因之一，则植物被检测到。
[0326]
在一些实施方式中，标记物cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、lg5-m1、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、lg2-m1、cm_mu47536_461、cm_mu45437_855和/或lg5-m3通过扩增执行，例如通过pcr，对于每个标记物，使用一个可用于扩增抗性等位基因的正向引物、
一个可用于扩增易感等位基因的正向引物和一个通用反向引物。特别地，用于扩增所述标记物中的每一个的引物可以具有如本发明第一方面中所述的序列，并且在表g中详述。这同样适用于与上述zym基因相关的标记物；潜在引物在表g中公开。
[0327]
在优选的实施方式中，扩增如实施例中所述。在仍然优选的实施方式中，使用两步降落法进行扩增，其中将延伸和退火步骤结合到一个步骤中。退火阶段使用的温度决定了反应的特异性，从而决定了引物与dna模板退火的能力。降落pcr涉及taq聚合酶激活的第一步，然后是称为降落步骤的第二步，其涉及高退火温度并在每个pcr循环中逐渐降低退火温度，以及dna扩增的第三步。在降落的早期循环中较高的退火温度确保dna和引物之间只会发生非常特定的碱基配对，因此要扩增的第一个序列最有可能是感兴趣的序列。逐渐降低退火温度以提高反应效率。在高度特异性的早期降落循环中最初被扩增的区域将被进一步扩增并胜过可能在较低温度下发生的任何非特异性扩增。
[0328]
在另一个实施方式中，snp标记物的扩增按照kaspar测定中推荐的和实施例中说明的进行(见实施例5)，即通过pcr循环，包括在94℃下持续约15分钟的第一个变性步骤，在94℃下约20秒的至少10个循环，然后从65℃的第一个循环到57℃的最后一个循环降温约60秒，以及在94℃下约20秒，然后在57℃约60秒的约35个循环。根据所用引物的类型，技术人员可以很容易地调整该程序。
[0329]
在一些实施方式中，标记物lg5-m2、cmtan139、cmctn2、cmbr120和/或me_vate的检测通过扩增进行，例如，通过pcr，对于每个标记物，使用一个正向引物和一个反向引物。特别地，用于扩增每个所述标记物的引物可以具有如本发明第一方面所述的序列。
[0330]
本发明还涉及杂交甜瓜植物，其通过根据本发明第一方面的甜瓜植物，或通过本文上述公开的方法获得或可获得的抗性植物与以下甜瓜植物，例如对疮痂病、蚜虫和pm易感的甜瓜植物，或对疮痂病、蚜虫和pm具有不同水平抗性的甜瓜植物杂交获得或可获得。
[0331]
根据另一方面，本发明还提供与如上文所定义的赋予对疮痂病、蚜虫和/或白粉病(pm)具有抗性的lg2和/或lg5上的qtl相关的分子标记物。
[0332]
在一些实施方式中，与lg2上的赋予对疮痂病具有抗性的所述qtl相关的分子标记物是标记物cm_mu45136_209、lg2-m4和cm_mu45398_32中的一种或多种，或所有标记物cm_mu45136_209、lg2-m4和cm_mu45398_32，或标记物cm_mu45136_209、lg2-m4和cm_mu45398_32的组合，或由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32限定的染色体区域内的任何其他标记物。
[0333]
在一些实施方式中，与lg5上的赋予对疮痂病具有抗性的qtl相关的所述分子标记物是标记物lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322和cm_mu44050_58中的一种或多种，或所有标记物lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322和cm_mu44050_58，或标记物lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322和cm_mu44050_58的组合，或由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58限定的染色体区域内的任何其他标记物。
[0334]
在一些实施方式中，与lg2上的赋予对pm具有抗性的qtl相关的所述分子标记物是标记物cmbr120、lg2-m1和cm_mu47536_461中的一种或多种，或所有标记物cmbr120、lg2-m1和cm_mu47536_461，或标记物cmbr120、lg2-m1和cm_mu47536_461的组合，或由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域内的任何其他标记物。
[0335]
在一些实施方式中，与lg5上的赋予对pm具有抗性的qtl相关的所述分子标记物是
标记物cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3中的一种或多种，或所有标记物cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3，或标记物cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3的组合，或由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域内的任何其他标记物。
[0336]
上述标记物的序列描述于表1和2以及实施例中。
[0337]
还提供了一种分子标记物cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cmbr120、lg2-m1、cm_mu47536_461、cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3中的一种或多种，或所有标记物cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cmbr120、lg2-m1、cm_mu47536_461、cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3，或标记物cm_mu45136_209、lg2-m4和cm_mu45398_32、lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cmbr120、lg2-m1、cm_mu47536_461、cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3的组合用于检测对疮痂病、蚜虫和/或白粉病(pm)具有抗性的甜瓜植物的用途。所述用途还可另外包括使用一种或多种或所有snp标记物lg2-m2、cm-mu47380_和lg2-m3来检测不表现出与zym基因相关的坏死表型的甜瓜植物的用途。
[0338]
本发明还涉及根据本发明的赋予对疮痂病、蚜虫和/或白粉病(pm)具有抗性的与lg2(列表的第1个到第6个snp)和lg5(列表的第7个到第14个snp)上的qtl相关联的列表cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、cmbr120、lg2-m1、cm_mu47536_461、lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3中的至少一种标记物用于鉴定与所述qtl相关的替代分子标记物的用途，其中所述替代分子标记物是：
[0339]
·
在lg2上的由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32，或由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定的染色体区域，
[0340]
·
在lg5上的由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58，或由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定的染色体区域，
[0341]
·
距离本发明的14个标记物的基因组不到2兆碱基单位，即
[0342]
cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、cmbr120、lg2-m1、cm_mu47536_461、lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_322、cm_mu44050_58、cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3。
[0343]
替代分子标记物优选与所述qtl相关联，p值为0.05或更小，优选小于0.01。qtl将在保藏的种子ncimb 43317中找到。
[0344]
本发明还涉及一种用于鉴定与赋予对疮痂病、蚜虫和/或白粉病(pm)(当杂合或纯合存在时)具有抗性的qtl相关的分子标记物的方法，包括：
[0345]-鉴定染色体区域中的分子标记物：
[0346]
·
在lg2上的由标记物cm_mu45136_209和标记物cm_mu45398_32，或由标记物cmbr120和标记物cm_mu47536_461限定，
[0347]
·
在lg5上的由标记物lg5-m1和标记物cm_mu44050_58，或由标记物cm_mu45437_855和标记物lg5-m3限定，或
[0348]
·
距本发明的15个snp标记物的基因座不到2兆碱基单位，即cm_mu45136_209、lg2-m4、cm_mu45398_32、cmbr120、lg2-m1、cm_mu47536_461、lg5-m1、cmctn2、cm_mu46579_
322、cm_mu44050_58、cm_mu45437_855、lg5-m2、cmtan139和lg5-m3，和
[0349]
在从表现出所述抗性的植物产生的分离群体中确定所述分子标记物是否与对疮痂病、蚜虫和/或白粉病(pm)的抗性有关联或相关。
[0350]
该群体优选从保藏的种子ncimb 43317或其子代生长的植物中产生，表现出对本发明所述的疮痂病、蚜虫和/或白粉病(pm)的抗性。
[0351]
根据本发明赋予对疮痂病、蚜虫和/或白粉病(pm)具有抗性的上述lg2和lg5上的qtl是存在于mtyvvc721(ncimb 43317)中的qtl。
[0352]
遗传关联或连锁如上所定义；优选关联或连锁的p值优选小于0.05、最优选小于0.01或甚至更小。
[0353]
分子标记物和抗性表型在优选超过90％、优选超过95％的减数分裂中一起遗传。
[0354]
在进一步的方面中，本发明涉及用于生产对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜小植株或植物的方法，该方法包括：
[0355]
i.在体外培养根据本发明的甜瓜植物的分离的细胞或组织，以生产对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜微型小植株，和
[0356]
ii.任选地进一步使甜瓜微型小植株经受体内培养阶段，以发育成对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的甜瓜植物。
[0357]
用于生产微型小植株的分离的细胞或组织是在无菌条件下从待繁殖的本发明的甜瓜亲本植物获得的外植体。外植体包含或由例如子叶、下胚轴、茎组织、叶、胚、分生组织、节芽、芽尖或原生质体组成。外植体可以在放置在培养基上进行微繁殖之前进行表面灭菌。
[0358]
可适用于植物微繁殖的条件和培养基是植物栽培领域的技术人员所熟知的，并且例如在“植物组织培养繁殖，商业实验室手册和目录(plant propagation by tissue culture,handbook and directory of commercial laboratories),edwin f george和paul d sherrington编,exegetics ltd,1984”。
[0359]
微繁殖通常包括：
[0360]
i.腋芽生产：通过向芽培养基中添加细胞分裂素来诱导腋芽增殖，以产生优选具有最少愈伤组织形成的芽；
[0361]
ii.不定芽生产：向培养基中添加生长素诱导根形成，以产生能够转移到土壤中的小植株。或者，可以直接在土壤中诱导根系形成。
[0362]
小植株可以进一步经历体内培养阶段，通过在实验室条件下培养到土壤中，然后逐渐适应自然气候，发育成抗疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)的甜瓜植物。
[0363]
鉴于本发明的抗性植物限制由疮痂病、蚜虫和pm引起的损害能力，它们有利地生长在被蚜虫、枝孢属、单囊壳白粉菌和/或菊科高氏白粉菌侵染或可能被侵染的环境中，在这些条件下，本发明的抗性植物比易感植物产生更多适销对路的甜瓜。因此，本发明还涉及一种在被疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)侵染的环境中用于提高甜瓜植物产量或增加可收获甜瓜植物或果实数量的方法，包括在所述环境中生长如所定义的对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性的甜瓜植物，其在lg2和/或lg5上包含根据本发明的qtl或序列并赋予所述植物对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)的抗性。
[0364]
优选地，该方法包括选择或选择甜瓜植物的第一步骤，所述甜瓜植物包含赋予所述植物对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性的所述感兴趣序列，优选不具有与zym基因相关的任何
坏死表型。该方法也可以定义为一种提高甜瓜田、地道或温室生产力的方法，或一种减少甜瓜生产中化学品或杀真菌剂应用强度或数量的方法。
[0365]
本发明还涉及一种在疮痂病、蚜虫和pm侵染或感染的情况下减少甜瓜生产损失的方法，包括生产如上定义的甜瓜植物。
[0366]
本发明的抗性植物还能够限制引起疮痂病和pm的病原体以及蚜虫的生长，从而限制进一步植物的感染以及病原体和蚜虫的繁殖。因此，本发明还涉及一种用于保护田地、地道或温室或任何其他类型的生产园免受疮痂病、蚜虫和pm侵染，或至少限制侵染水平或限制疮痂病、蚜虫和pm蔓延的方法。这样的方法优选地包括生长本发明的抗性或耐受性植物的步骤，即在lg2和/或lg5上包含赋予对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性的序列的植物，优选地不具有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0367]
本发明还涉及根据本发明的对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性的甜瓜植物在田地、地道或温室或其他生产园中控制疮痂病、蚜虫和pm侵染的用途。
[0368]
qtl的所有优选特征如结合本发明的其他方面定义的，即它优选存在于mtyvvc721(ncimb保藏号43317)的种子中，并且它可通过如根据本发明定义的标记物识别。
[0369]
本发明还涉及一种在被疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)侵染的环境中提高甜瓜植物产量的方法，包括：
[0370]
a.鉴定对疮痂病、蚜虫和pm具有抗性的甜瓜植物，其基因组中包含(i)赋予对枝孢属具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于连锁群(lg)2和/或连锁群5(lg5)上，(ii)赋予对pm具有抗性的至少一个qtl，其中所述至少一个qtl存在于lg2和/或lg5上，并且不同于(i)中的所述至少一个qtl，和(iii)在lg5上的赋予对蚜虫具有抗性的vat基因类似物，和
[0371]
b.在所述受侵染的环境中生长所述抗性甜瓜植物。
[0372]
通过这种方法，如果甜瓜植物的产量增加，尤其是可以收获更多可销售的甜瓜，或生产更多的商品甜瓜，或获得更多的种子。
[0373]
在另一方面，本发明还涉及一种生产甜瓜的方法，包括：
[0374]
a)生长如前所定义的本发明的甜瓜植物；
[0375]
b)允许所述植物结果；和
[0376]
c)收获所述植物的果实，优选在成熟时和/或成熟前。
[0377]
关于甜瓜植物的所有优选实施方式已经在本发明的前述方面的上下文中公开。
[0378]
该方法可有利地包括将所述甜瓜加工成加工食品的进一步步骤。
[0379]
在整个本技术中，术语“包含”应解释为涵盖所有具体提到的特征以及可选的、附加的、未指定的特征。如本文所用，术语“包含”的使用还公开了其中除了具体提到的特征之外不存在特征的实施方式(即“由...组成”)。
[0380]
种子保藏
[0381]
来自根据本发明的甜瓜植物的种子(即来自mtyvvc721植物的种子)的代表性样品已由hm clause,s.a.(rue louis saillant，z.i.la motte，bp83，26802portes-l
è
s-valence cedex，france)，根据并满足《关于国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约》(“布达佩斯条约”)的要求，于2018年12月13日保藏在国家工业、食品和海洋细菌保藏中心(ncimb)(23 st machar drive,aberdeen,scotland,ab21 9ya,united kingdom)，
保藏号为43317。
[0382]
mtyvvc721种子的保藏由hm clause，s.a.(rue louis saillant，z.i.la motte，bp83，26802 portes-l
è
s-valence cedex，france)维持。
[0383]
实施例
[0384]
由于分子标记物，以下实验的目的是获得一种新的抗病性包，可用于育种系和商业杂交种，从连锁群5上的两个野生种质中积累两个抗性qtl(一个疮痂病抗性qtl和一个pm/vat抗性qtl)以及lg2上的两个抗性qtl(一个来自野生种质的pm抗性qtl和一个在夏朗德甜瓜品系中鉴定的疮痂病抗性qtl)，因此在2个连锁群上总共有四个抗性qtl。
[0385]
在标记物的帮助下，测试包括pm人工测试，自交和回交的许多循环(8个育种循环)，一些循环的植物数量很高(从24到100多个)，发明人成功地渗入了来自野生种质基因组的2个小染色体区域，并限制了与果实的形状和外皮颜色相关的连锁累赘的发生。
[0386]
为了将scab抗性引入优良育种系，发明人使用了野生地方品种，并且不得不丢弃与该地方品种相关的所有不良性状。这个瓜确实有一个不受欢迎的形状(见图1d)，并且肉色淡和空腔大。白利糖度也相当低，完全成熟时约为10-11
°
b，果肉在跃变期危机后迅速变得非常柔软。尽管如此，发明人已经能够恢复夏朗德精品系的内部品质、保质期潜力、果实外观和形状。此外，除了使用与2个连锁群(lg)载体(lg2和lg5)上的2个已鉴定qtl相关的侧翼标记物和非携带lg上的随机标记物外，还对回交植物进行人工病理学测试，使得恢复夏朗德背景成为可能。
[0387]
对于每个回交或自交周期，发明人使用这些不同的工具管理了100至300株植物，并进行了果实评估，以丢弃不良的植物(太长的形状、柔软和苍白的果肉、成熟时变为橙色的灰/绿色果皮...)，保持植物具有最理想的夏朗德精品系性状。
[0388]
由于侧翼标记物和大量用枝孢属测试筛选的植物，然后进行标记物分析，发明人从野生种质中渗入了一小部分基因组片段，避免了这些甜瓜种质的不良性状(空腔大小、果肉硬度、果肉颜色...)，以及本领域公开的与pm和scab抗性相关的坏死症状。
[0389]
1.材料与方法
[0390]
1.1枝孢属试验(或疮痂试验)
[0391]
用于测试的黄瓜黑星病菌菌株保存在-80℃。通过在接种前14天内培养真菌来制备接种物。
[0392]
对于每个测试品系或基因型，测试了20个不同的种子/植物，以及2个易感对照和两个抗性对照。
[0393]
该测试是在1叶生长阶段(即播种后约10至14天)的植物上进行的。对于接种，将分生孢子悬浮在水中并过滤，以达到每毫升104至105个分生孢子的浓度。通过将接种物喷洒在待测植物的叶子上来进行接种。然后在第一天在饱和湿度条件下，在对应于18℃夜间/22℃白天和14小时日光的条件下培养植物。
[0394]
接种后7天读数疮痂测试结果(1次读数)，并在1次读数后5天用1到9分的症状评分量表进行第二次读数，如下所示：
[0395] 抗性评分症状描述易感的(s)1植物死亡易感的(s)3影响植物叶部(叶、子叶、叶柄)的坏死病变(大于斑点)
中等的(ir)5在子叶和叶柄的顶端和开始处有几个坏死点抗性的(r)7顶点有几个坏死点抗性的(r)9无症状
[0396]
植物群体的疾病指数(di)是根据单个植物的抗性分数计算的，如下所示：
[0397]
di＝[(0
×
具有抗性评分为1的植物的nb)+(3
×
具有抗性评分为3的植物的nb)+(5
×
具有抗性评分为5的植物的nb)+(7
×
具有抗性评分为7的植物的nb)+(9
×
具有抗性评分为9的植物的nb)]/(9
×
植物总数)。
[0398]
如果di＝1，则所有植物是抗性的。
[0399]
如果di＝0，则所有植物是易感的。
[0400]
1.2.白粉病试验
[0401]
初始试验叶盘测定：
[0402]
不同的真菌可引起甜瓜的白粉病，包括单囊壳白粉菌(podosphaera xanthii,px)和菊科高氏白粉菌(golovinomyces cichoracearum var.cichoracearum,gc)。就这些真菌是专性真菌而言，它们被维持在易感的葫芦和甜瓜植物上，分别是tosca和edisto品种。
[0403]
当第二片叶子出现时(即播种后约11至13天)，对处于单叶生长阶段的植物进行测试。
[0404]
对于每个测试品系或基因型，测试了24种不同的种子/植物，以及8种不同的对照，从更易感到更抗性：v
é
drantais、nantais oblong、pmr45、wmr29、edisto47、pmr5、pi124112，mr1和pm1。
[0405]
为了接种，将绿皮西葫芦上的分生孢子悬浮在水中，以达到每毫升104至105个分生孢子的浓度。通过将接种物喷洒在待测植物的叶子上来进行接种。第二次接种在第一次接种后3天进行，也是通过将接种物喷洒在叶子上进行。
[0406]
结果读数：读数在接种后10天进行。第一次读数后5至6天进行第二次读数。
[0407]
症状等级如下(抗性评分)：
[0408][0409]
改进的测试分离的叶片测试：
[0410]
为了提高pm测试的速度，设计了第二个测试，应用于分离的叶片。对于该测试，同时测试研究中的子代的15种不同植物，每株植物进行两次重复(r1和r2)，每株植株进行两次测试(lect 1和lect 2)。对照植物在1或2株植物上进行测试，每株植物进行两次重复(r1和r2)，每株植株进行两次测试(lect 1和lect 2)。分离的单囊壳白粉菌品种(px1、px2、
px3、px5和px3-5)和菊科高氏白粉病品种1(gc)的接种是通过将每个品种喷洒在叶面圆盘上，在琼脂平板上涂布进行的。接种后第9天和第11天，每个圆盘中孢子形成发生两次，分别为读数1和读数2。评分量表(易感性评分量表)如下：0：无孢子形成(抗性)，1：轻度孢子形成《叶盘的10％(抗性)；3：孢子形成《叶盘的30％(中度)；5：孢子形成《叶盘的60％(中度)，7：孢子形成》叶盘的6％(易感)；9：叶盘的完全孢子形成(易感)。
[0411]
值得注意的是，根据该测试确定的易感性评分已经过调整，使其符合以下关系：
[0412]“易感性评分”＝9
‑“
抗性评分”。
[0413]
1.3.坏死试验：
[0414]
在高湿度的温室中测试坏死的发生。植物被分类为表现出坏死与否。
[0415]“与zym基因相关的坏死表型”是指pitrat和lecoq，1984，euphytica，33(1):57-61中描述的坏死表型。更具体地，这样的坏死表型对应于叶表皮中坏死斑点的出现，其在叶上逐渐扩展并且可以导致叶或茎的完全干燥。
[0416]
病毒分离与维护：
[0417]
通过用小葫芦黄化花叶病毒(zymv)分离株接种甜瓜植株，储存在-80℃下的塑料袋中或在+4℃下干燥的受感染叶片上，来评估坏死表型。接种源根据机械接种工艺在甜瓜小植株上繁殖。
[0418]
机械接种：
[0419]
接种物是通过用4ml含有0.2％二乙基二硫代氨基甲酸钠的0.03m na2hpo4缓冲液与金刚砂(7.5％)和活性炭(10％)研磨1g受感染的叶片制成的。在两个子叶上接种具有第一增殖叶的幼苗。
[0420]
试验在生长室内进行，光周期为24℃下白天14小时，20℃下夜间10小时。
[0421]
症状评价：
[0422]
当易感对照在接种后约10至14天出现症状时进行评估。
[0423]
一个“坏死”对照(携带fn基因)；测试中包含一个“镶嵌(mosaic)”对照(不携带基因)和抗性对照，以验证测试和检查病毒毒力。
[0424]
根据和顺序等级对叶子进行评价：1：植物死亡，植物完全枯萎；3：明显的叶脉分明；5：轻度镶嵌；7：幼叶上有淡淡的褪绿斑点；9：完全没有症状。
[0425]
几天后可以进行第二次评分以检查任何症状变化。
[0426]
1.4.甜瓜品种和品系
[0427]
夏朗德精品系c(图1b)属于甜瓜的厚皮甜瓜亚种(cucumis melo l.subsp.melo species)。该精品系易受单囊壳白粉菌品种px-1、px-2、px-3、px-5和px3-5的影响，成熟时果肉呈深橙色且结实，缝线呈深绿色，果皮黄化光滑，保质期长且糖度高(15-16
°
白利糖度)。
[0428]
夏朗德精品系a(图1a)属于甜瓜的厚皮甜瓜亚种(cucumis melo l.subsp.melo species)。该精品系易受黄瓜黑星病菌的影响，并能耐受白粉病，成熟时果肉呈橙色且结实，缝线呈深绿色，果皮很少发黄，呈浅网状，保质期长且糖度高(15-16
°
白利糖度)。
[0429]
夏朗德杂交种b属于甜瓜的厚皮甜瓜亚种(cucumis melo l.subsp.melo species)。该杂交种具有较高的内在品质(良好的橙色果肉，白利糖度高(15-16
°
)，网密度高，早熟且保质期长。
[0430]
甜瓜种质pm1(图1e)属于甜瓜的苦瓜变种(cucumis melo sp.momordica)。该变种对单囊壳白粉菌品种px-1、px-2、px-3、px-5和px3-5具有抗性，成熟时果肉苍白柔软，空腔大，成熟时果皮高度黄化/橙化，糖含量低(10
°
白利糖度)。
[0431]
甜瓜种质sc1(图1d)属于甜瓜的厚皮甜瓜亚种(cucumis melo l.subsp.melo species)。这种陆地种对黄瓜黑星病菌具有抗性，成熟时果肉呈浅橙色，柔软，空腔大，呈肋状，果皮高度黄化，糖含量低(10
°
白利糖度)。
[0432]
夏朗德精品系f(图1c)属于甜瓜的厚皮甜瓜亚种(cucumis melo l.subsp.melo species)。该精品系易受scab和pm的影响。该精品系是雌雄同株系，圆整，网状，具有漂亮的深绿色缝线，内部质量中等，果肉橙色，中等硬度，平均白利糖度12-14℃，属于早熟系，果皮黄化。
[0433]
1.5.dna提取和基因分型方案
[0434]
dna纯化
[0435]
根据制造商的说明，使用植物试剂盒(macherey nagel)从第一片嫩叶组织中自动分离基因组dna。
[0436]
ssr基因分型根据本领域技术人员熟知的方法进行。
[0437]
合适的引物公开于下表e中。
[0438]
snp基因分型也根据众所周知的方法进行，特别是通过kaspar测定法(kbioscience competitive allele-specific polymerase chain reaction assay)测定等位基因。kbioscience的这种snp基因分型测定基于竞争性等位基因特异性pcr(每个等位基因一个引物)和fret(荧光共振能量转移)，无需分离步骤即可检测snp。
[0439]
为每个snp准备了kaspar混合物，包括两个竞争性等位基因特异性正向引物和一个通用反向引物。kasp检测混合物特异于要靶向的snp。kasp测定混合物与待测dna样本以及包含通用fret盒、rox
tm
被动参考染料、taq聚合酶、游离核苷酸和mgcl2的kasp master在优化的缓冲溶液中混合。
[0440]
pcr循环如下：
[0441]
第1步：变性：94℃、15分钟
[0442]
第2步：94℃、20秒，65-57℃、60秒(-0.8℃标准循环)，10个循环第3步：94℃、20秒，57℃、60秒，35个循环，
[0443]
第4步：15℃
[0444]
已在pherastar微孔板测读器(pherastar plate reader)上检测到等位基因荧光，并使用具有预定义簇分配参数的klustercaller软件对fam/vic等位基因进行解释。
[0445]
2.标记物辅助的夏朗德甜瓜pm1种质中白粉病抗性的基因渗入
[0446]
利用qtl建立了育种计划，以开发对单囊壳白粉菌不同品种具有高水平抗性的甜瓜品系。为了避免这种甜瓜品系的遗传漂移，通过从甜瓜种质pm1引入qtl(图1e)，使用分子标记物渗入抗性qtl，并与已知与提供白粉病(pm)抗性的qtl相关的不期望的农艺性状(尤其是成熟时果肉苍白和柔软、空腔大、成熟时果皮高度黄化/橙化和糖含量低(10
°
brix))断开关联。
[0447]
夏朗德精品系c(图1b)与甜瓜种质pm1杂交，这是一种已知具有抗性但具有不良农艺性状的甜瓜的苦瓜变种(cucumis melo sp.momordica)植物。将得到的f1种子发芽，从发
芽的种子中生长出植物，并且将得到的植物自交以产生f2种子/植物，用于进一步选择和育种。三百(300)株f2植物已经用本地分离株px3-5进行了pm叶盘分析。在抗性植物中，一组约50个标记物微卫星(ssr)已用于选择f2植物。这些标记物集中在lg2和lg5上，这些标记物在文献中已知甜瓜的苦瓜变种(cucumis melo sp.momordica)中具有抗白粉病的qtl。已经选择了在纯合阶段在lg2和lg5上具有被疑似与pm抗性有关的qtl的f2植株。从300株f2植物中选择6株f2植物，并与夏朗德精品系c回交以获得bc1种子/植物。在这个杂合水平上，没有进行pm压力。仅对bc1植物进行了表型评估。已从内部和外部观察到bc1植物的果实。该植物具有圆形或不太椭圆形的果实，树皮颜色清晰，网状尽可能规则，果实结实、多彩、甜且无玻璃体，打开后在12℃下保存5天，在室温下保存2天。
[0448]
在随后的大多数选择阶段，都采用了相同的方法，其中植物的选择主要基于其农艺特征，并且已经去除了显示任何坏死因子的植物。
[0449]
此外，已经对大约50个微卫星(ssr)进行了基因分型，以计算这些bc1上的重复基因组的百分比和渗入片段的大小。已经选择了一个bc1植物群体，该群体具有较小的渗入片段、清晰的树皮和漂亮的深绿色绘图、深橙色果肉、结实和味美，以及可能的略微细长形状。将来自这种群体的bc1植物自交以产生f2bc1种子/植物。236株f2bc1植物已经用本地分离株px 3-5进行了pm测试。然后用ssr筛选了67株抗性植物，以选择在纯合或杂合阶段，在lg2和lg5上具有来自pm1的较短qtl/渗入的植物。从236株f2bc1植物中选择了5株f2bc2植物，并进行自交以产生f3bc1的种子/植物，或与夏朗德精品系c回交以获得bc2种子/植物。f3bc1子代通过叶盘测定提交给pm个体品种px 1/2/3/5/3-5，以验证所选植物的宽范围谱。所有测试的植物对所有这些品种都有很好的抗性。
[0450]
已经用相同的ssr筛选了一百七十(170)株bc2植物，以在载体连锁群(lg)上保留较短的pm1片段，在非载体连锁群上保留较高的重复基因组。从170株bc2植物中选出15株bc2，并进行自交，以产生f2bc2的种子/植物。f2bc2植物进行自交，产生f3bc2种子/植物，其与夏朗德精品系c回交，以获得bc3种子/植株。bc3植物自交产生f2bc3种子/植物，f2bc3种子/植物自交产生f3bc3种子或植物。f3bc3植株也进行自交以获得f4bc3种子/植株。在对单个品种px 1/2/3/5/3-5进行人工pm叶盘分析后，用每个载体lg上的3个ssr(lg2为cmag36、nr39和cmbr120，lg5为cntaan128、nr2和lg5-m2)分析了33个f4bc3子代。这样的分析表明，pm1抗性的qtl确实在lg2和lg5上，并且已通过育种计划固定，基本上基于表型选择。选择f4bc3的植物并与f系杂交(图1c)，以产生bc4种子/植物。这样的bc4植物已经自交4次，以产生f5植物，该植物可以用作lg2和lg5上抗pm的qtl的供体系。然而，在这个阶段，与lg2上的坏死因子的关联仍然存在，这是与水滴接触的植物坏死引起的过度反应的原因。
[0451]
3.标记物辅助的夏朗德甜瓜中sc1地方品种的疮痂病抗性的基因渗入
[0452]
利用野生种中存在的qtl建立育种计划，以开发对黄瓜黑星病菌具有高水平抗性的甜瓜品系。为了避免这种野生甜瓜品系的遗传漂移，通过从甜瓜种质sc1引入qtl(图1d)，使用分子标记物渗入抗性qtl，并断开与抗性相关的与不良农艺性状(尤其是成熟时果肉浅橙色和柔软、空腔大、罗纹形状、成熟时果皮高度黄化和糖含量低(10
°
brix))的关联。
[0453]
将夏朗德精品系a(图1a)与甜瓜种质sc1杂交。将所得f1种子发芽，从发芽的种子中生长出植物，并将所得植物与夏朗德精品系a回交，以产生bc1种子/植物，用于进一步选择和育种。96株bc1植物进行了scab试验(见实施例1.1)。在抗性植物中，一组分布在基因组
中且能够区分来自两个来源的基因组序列的36个分子标记物已用于选择具有最高精品基因组比率的bc1植物，即从sc1渗入的基因组序列最少。在所选的十几种bc1植物中，根据果实评估选出了3种个最好的bc1植物，并进行了自交以产生bc1l1种子/植株。24株bc1l1植物已进行scab试验，获得的与bc1植物和果实的表型评估相关的数据允许选择最佳的2-3株bc1植物以及随后的bc2子代。因此，最好的2-3株bc1植株与夏朗德精品系a回交，以产生bc2种子/植株。96株bc2植物接受了scab试验。在抗性植物中，相同的一组36个分子标记物已用于选择具有最高精品基因组比率的bc2植物。选择的bc2植物自交产生bc2l1种子/植物。本发明人通过一轮额外的回交进行了该过程，对要选择用于进一步步骤的植物的农艺特征施加了重要的选择压力，特别是果实形状、果肉颜色和硬度、空腔大小和成熟时的树皮颜色。此外，对于第三次回交，替代杂交系已被测试作为轮回亲本，以促进抗疮痂病的多样化，同时带来早熟、网状和肉质的内部质量。另外进行了两次自交，以保持对疮痂病抗性和农艺性状的选择压力。保留一个特定的品系，以与具有来自pm1的渗入qtl的材料(提供如实施例2中所选的白粉病抗性)组合。
[0454]
4.夏朗德甜瓜中pm1种质的白粉病抗性和sc1种质的疮痂病抗性的组合
[0455]
从来自pm1种质育种计划(见实施例2)的一个系与来自sc1育种计划(见实施例3)的一个系之间的杂交中产生f2植株。400株f2植物已进行scab测试，然后通过lg5上的标记物进行分析，以寻找可能破坏与导致果实质量差的序列(这些序列基本上是在lg5上发现的)关联的潜在重组事件。根据潜在重组事件及其在scab测试中的行为，保留了9株f2植物。对f3子代进行了选择，通过scab测试提交了200株f3植物/子代，并使用lg5和lg2上的标记物对鉴定为抗性的植物(约50％的植物)进行了筛选。每个子代保留13至16株f3植物。在每个家族中，评估了外部和内部的果实质量、每个f3植物的坏死行为及其在温室中的pm水平。保留的f3植物的f4子代已通过种族间pm测试和zymv测试进行了测试。本发明人获得的结果表明，f3pm抗性植物的坏死反应与zymv基因座密切相关。较少坏死的f3植物对zymv易感或分离。相反，所有的抗zymv的植物都是坏死的。
[0456]
因此，选择方案已在两个特定的f4子代上进行，分别对zymv易感(子代1607/003)和分离(子代1607/1007)。pm测试显示，第二组(见表a)的水平稍高，具有相同的坏死模式，即无坏死模式。编号为570的f5子代(从f4 1607/007中得到)已被选择用于进一步测试scab抗性。具体而言，编号为570的f5子代(来自f4 1607/003)的20株植物已经测试了scab抗性，以及两个抗性对照和两个易感对照。
[0457]
结果报告如下表b所示，并且说明在scab试验中，这些植物的疾病指数非常低。
[0458]
该f5子代的种子命名为mtyvvc721，通过自花授粉获得，抗pm和scab，于2018年12月13日以保藏号ncimb 43317保藏在ncimb。这些植物(见图1f中的说明性植物)具有与商业甜瓜品系基本相同的表型特征(见图1a、1b和1c中的说明性植物)。
[0459]
表a：pm分离的叶片测试的结果-易感性评分。
[0460][0461][0462]
pm分离的叶片测试获得的易感性评分结果(见实施例1.2)应用于两个子代1607/003和16/007的15株植物，以及抗性对照，即pm1基因渗入配偶体pmr5(两株植物，单囊壳白粉菌的某些菌株的对照)和易感对照，即v
é
drantais、nantais oblong。已知对至少一种菌株具有抗性的植物也已经过测试(edisto 47，pmr45)。nd＝不确定的。
[0463]
表b：scab测试的结果-疾病评分和疾病指数
[0464][0465]
疾病指数计算如下：
[0466]
di＝[(0
×
具有抗性评分为1的植物的nb)+(3
×
具有抗性评分为3的植物的nb)+(5
×
具有抗性评分为5的植物的nb)+(7
×
具有抗性评分为7的植物的nb)+(9
×
具有抗性评分
为9的植物的nb)]/(9
×
植物总数)。
[0467]
这些结果证实，保藏在ncimb的种子对pm和scab具有抗性。vat基因提供的对蚜虫的抗性也得到了证实。这些植物也具有商业上可接受的果实品质和外观(见图1f)，并且没有与zym基因相关的任何坏死表型。
[0468]
5.特定标记物的开发
[0469]
使用基因组扫描方法，沿着基因组均匀分布并覆盖了12条甜瓜染色体(对应于12个连锁群)的4500多个snp标记物已在一组品系上进行了基因分型。该小组包括zymv抗性系、pm抗性系、scab抗性系和易感系，以及最初的scab和pm抗性供体，即pm1和sc1，育种过程起点的易感系(即精品系a和c)，以及在不影响果实质量的情况下聚合scab和pmqtl的最终育种系(mtyvvc721及其子代)。数据分析允许识别lg2和lg5上的scab抗性qtl以及lg2和lg5上的pm抗性qtl的特异性标记物单倍型。
[0470]
表c中报告了lg2和lg5上的scab抗性qtl以及lg2和lg5上的pm抗性qtl的侧翼标记物以及这些侧翼标记物限定区域内的其他标记物。此外，标记物在甜瓜(dhl92)3.6.1版(garcia mas等人，2012)基因组装配件上的位置，可从以下地址http://cucurbitgenomics.org/organism/18获得，也记载在表c中。diaz等人，2011年还公开了相对于一些标记物的所述标记物的位置，也如图2(lg2)和图3(lg5)所示。
[0471]
此外，通过追踪已知在lg2上的pm抗性qtl附近的zymv基因，发明人已经证实，该基因不再存在于具有对应于保藏种子的基因组的植物中。因此，他们在分子水平上证实了在表型水平上观察到的重组事件，即通过重组丢失zymv基因导致植物没有坏死症状。用于检测zymv基因的存在或不存在的标记物以及它们在甜瓜基因组的同一版本上的物理位置也在表c中给出。ssr和snp基因分型已经如实施例1中详述的那样进行。
[0472]
表d详细说明了表c的snp标记物、多态性、与抗性qtl的存在相关的等位基因、围绕信息多态性的序列(即多态性核苷酸和3'和5'侧翼序列)以及随附序列列表中的相应seq id no。
[0473]
表e报告了表c的ssr标记物，用于扩增微卫星的正向和反向引物，以及代表抗性qtl(pm或scab抗性qtl)的存在的扩增片段长度。
[0474]
表f报告了表d和e的标记物，在基因分型的品系的组中发现的等位基因。
[0475]
表g描述了本发明人用于检测本发明中公开的snp等位基因的引物。
[0476]
表c：标记物列表
[0477]
这些列指示标记物的名称、标记物的类型(ssr或snp)、标记的抗性的类型、每个标记物在lg上的连锁群和甜瓜基因组版本3.6.1上的位置(对应于snp多态性核苷酸的位置；对于微卫星，给出的位置与用于扩增的引物序列有关)，以及标记物是否为抗性qtl的侧翼标记物。
[0478][0479]
表d：snp标记物
[0480]
该表报告了针对不同抗性鉴定的不同snp标记物，标记物的序列，包括多态性核苷酸。标题为“多态性r/s”的列表示多态核苷酸的两个等位基因，首先提到与抗性相关的等位基因(“抗性等位基因”)，第二个是代表易感性的等位基因。
[0481]
[0482][0483]
表e：ssr标记物
[0484]
该表报告了针对不同抗性鉴定的不同ssr标记物，可用于扩增微卫星区域的两个引物的序列以及扩增片段的长度，代表抗性qtl的存在。
[0485][0486]
[0487]
表f：亲本品系和保藏植物有关鉴定的标记物的基因分型
[0488][0489][0490]
表g：发明人使用kaspar技术和相应的seq id号检测snp等位基因的引物
[0491]
[0492][0493]
6.甲烷磺酸乙酯(ems)对甜瓜种子的遗传修饰
[0494]
用ems处理甜瓜植物的种子，方法是在室温下将约2000粒种子浸入0.5％(w/v)或0.7％ems的充气溶液中24小时。
[0495]
每ems剂量约有1500粒处理过的种子发芽，所产生的植物优选在温室中生长，例如3月至9月，以生产种子。
[0496]
成熟后，每处理一个品种，收获m2种子并在一个池中堆积。由此得到的m2种子池用作起始材料，以鉴定单个m2种子和对疮痂病、蚜虫和白粉病(pm)具有抗性的植物。
[0497]
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us20140059712