贝莱斯芽孢杆菌Bv-6在防治水稻褐飞虱中的应用

贝莱斯芽孢杆菌bv-6在防治水稻褐飞虱中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及贝莱斯芽孢杆菌bv-6在防治水稻褐飞虱中的应用。


背景技术：

2.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)作为一种生防细菌被广泛研究，但目前贝莱斯芽孢杆菌的相关报道主要集中在对作物的促生及病害防治方面。例如贝莱斯芽孢杆菌可以通过分泌植物激素等次生代谢产物对多种作物(如玉米，青葱，茄子，黄瓜等)有促生作用(sang et al.,2020；karina et al.,2020；anisa et al.,2020；moshe et al.,2020)。此外，贝莱斯芽孢杆菌还可以分泌丰原素，伊枯草菌素等抗生物质对多种植物病害(如苹果炭疽病，香蕉枯萎病，葡萄叶枯病等)有显著的防治效果(ping et al.,2021；young et al.,2021；sang et al.,2021)。但是，目前关于贝莱斯芽孢杆菌对害虫的防治报道相对较少。例如贝莱斯芽孢杆菌yc1000活菌体灌根能够诱导拟南芥植株产生系统抗性，增加叶片中活性氧及胼胝质的含量从而起到防治绿桃蚜的效果(rashid et al.,2017)；贝莱斯芽孢杆菌atr2摇培发酵液直接喷施蔬菜叶片能够有效杀死桃蚜，棉蚜，莴苣指管蚜等蚜虫(liang et al.,2022)；从自然死亡的二斑叶螨中分离得到的贝莱斯芽孢杆菌w1能够分泌杀虫活性物质从而有效的防治叶螨(li et al.,2021)。
3.褐飞虱是我国水稻产区的重要害虫，属于半翅目飞虱科，具有明显的迁飞习性。此外褐飞虱还能传播水稻病毒病，严重影响水稻产量与质量。
4.褐飞虱与蚜虫和叶螨虽然都属于农业生产中危害重大的刺吸式口器类害虫，但褐飞虱与蚜虫和叶螨在分类学及生活习性仍具有很大的区别。首先，它们的分类地位不同。褐飞虱属于昆虫纲半翅目飞虱科，而蚜虫属于昆虫纲半翅目蚜科，叶螨属于蛛形纲蜱螨目叶螨科。其次，它们的生活习性不同。褐飞虱是一种单食性害虫,只能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖。褐飞虱若虫分为五个龄期，成虫分为短翅及长翅两种类型，雌虫和雄虫交配后将卵产在叶鞘和叶片组织内，待温度适宜时孵化成幼虫。褐飞虱以成虫和若虫群集在稻株下部取食为害，严重时可引起稻株枯死倒伏,褐飞虱的侵害通常会减少水稻光合产物，阻碍植物生长，导致分蘖萎蔫。而蚜虫种类繁多，可以危害大多数农作物。蚜虫的生活史复杂，无翅雌虫可以进行孤雌生殖，雌蚜虫和雄蚜虫交配后，雌蚜虫产卵，以卵越冬。叶螨具有单食性、寡食性和多食性多种类型。叶螨的雌成虫繁殖时可将产卵器插入叶片，将叶片刺出许多小孔，产下单个、半透明、白色的椭圆形卵，待温度适宜时孵化出白色的叶螨幼虫。
5.目前，褐飞虱的防治主要依靠化学农药，例如噻嗪酮、毒死蜱、异丙威等。化学农药的长期使用不仅污染环境危害人畜健康，还容易使害虫产生抗药性从而加大防治的难度。而目前对褐飞虱具有杀虫活性的微生物农药还未见报道。前人已经报道的对蚜虫或叶螨具有杀虫活性的贝莱斯芽孢杆菌，例如贝莱斯芽孢杆菌yc1000，atr2和w1，均未报道这些菌株对褐飞虱具有杀虫活性。此外，关于其他类型具有杀虫或杀螨虫活性的芽孢杆菌，例如具备杀麦蚜虫活性的萎缩芽孢杆菌l193，具有杀柑橘叶螨活性的死亡谷芽孢杆菌nbif-001等也
均未报道其对褐飞虱具有杀虫活性(rodriguez,et al.,2018；周荣华等，2020)。因此，开发利用贝莱斯芽孢杆菌来防治褐飞虱是具有重要应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)bv-6在防治褐飞虱中的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)bv-6的保藏编号为cctcc no:m20191106。
7.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
8.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)bv-6在防治褐飞虱中的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)bv-6的保藏编号为cctcc no:m20191106。
9.本发明的应用过程是将含有贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)bv-6的任意剂型进行喷施即可。
10.所述的剂型包括贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)bv-6发酵液，或是可湿性粉剂。
11.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
12.本发明首次发现贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)bv-6发酵液及其可湿性粉剂对水稻重要害虫褐飞虱(nilaparvata lugens)有显著防效。
附图说明
13.图1为不同芽孢杆菌对水稻褐飞虱的防治效果结果示意图(48h)；
14.a图从左到右依次为喷施lb培养基，副炭疽芽胞杆菌(bacillus paranthracis)bp1，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)bs-1，贝莱斯芽孢杆菌菌株(bacillus velezensis)bv-10，贝莱斯芽孢杆菌菌株(bacillus velezensis)bv-12，贝莱斯芽孢杆菌菌株(bacillus velezensis)bv-6；
15.b图为对应a图各个处理死亡褐飞虱的图片，其中喷施芽孢杆菌后褐飞虱的死亡数量bv-6》bv-12》bs-1》bv-10》bp-1》lb。
16.图2为本发明贝莱斯芽孢杆菌bv-6对水稻褐飞虱的防治效果结果示意图(8d)；
17.其中经过bv-6发酵液喷施后的水稻植株上的褐飞虱虫口数量显著减少，水稻植株生长状况良好，并未发生枯萎现象，经过lb培养基喷施的ck对照处理，褐飞虱的虫口数量并未出现减退，水稻植株受褐飞虱危害后出现枯萎死亡现象。
18.图3为贝莱斯芽孢杆菌bv-6可湿性粉剂500倍稀释液对水稻褐飞虱的防治效果结果示意图(48h)；
19.经过贝莱斯芽孢杆菌bv-6可湿性粉剂500倍稀释液处理过后，褐飞虱出现死亡和虫体变黑现象。而无菌水对照处理的褐飞虱并未出现死亡及虫体变黑现象。f：虫子背部，b：虫子腹部。
具体实施方式
20.为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明实施例所涉及的技术方案，如未特别说明，
均为本领域常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
21.本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)bv-6，保藏编号为cctcc no:m20191106，已在cn 111254086a中公开，本发明使用的贝莱斯芽孢杆菌bv-6可湿性粉剂制备方法同该申请，制备得到的贝莱斯芽孢杆菌bv-6可湿性粉剂浓度为1
×
10
11
cfu/g。
22.所述的贝莱斯芽孢杆菌bv-6发酵液的制备方法为：在-80度冰箱中取出实验室保存的bv-6菌株，将bv-6划线于lb固体平板上活化，28℃培养24h后，挑取活化好的bv-6单菌落挑取到装有100ml ph 7的lb液体培养基的250ml锥形瓶中，28℃，180rpm摇培48h获得bv-6种子液，按5％接种量将种子液转接到盛有250ml ph 7的lb液体培养基的500ml锥形瓶中，在28℃，180rpm摇床中发酵48h得到bv-6摇培发酵液。
23.lb液体培养基配制(1l)：在950ml ddh2o中加入胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeast extract)5g，氯化钠10g，用1mol/l的naoh调节ph值至7.0，定容至1l。121℃高温高压灭菌20min，4℃储存。
24.实施例1：
25.不同芽孢杆菌菌株对水稻褐飞虱的防效试验
26.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)bs1、副炭疽芽胞杆菌(bacillus paranthracis)bp1、贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)菌株bv-10和bv-12，与贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)菌株bv-6做水稻褐飞虱防效对比试验。分别检测bs1，bp1，bv-10，bv-12和bv-6这五种芽孢杆菌的lb摇培发酵液(od＝0.6)对水稻褐飞虱的触杀活性，对照采用lb培养基处理。将水稻幼苗种植到塑料杯内(每杯30株)，取一周龄水稻幼苗18杯，共6个处理，每个处理三个重复。每杯水稻幼苗接种30头褐飞虱，然后分别均匀喷施每种芽孢杆菌发酵液10ml，对照处理喷施lb培养基10ml，48小时后统计水稻褐飞虱的死亡率，计算防治效果。
27.防治效果(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)*100％
28.对水稻褐飞虱的防治效果如下：贝莱斯芽孢杆菌菌株bv-6(防效71.6％)》贝莱斯芽孢杆菌菌株bv-12(防效25.91％)》枯草芽孢杆菌bs-1(防效19.99％)》贝莱斯芽孢杆菌菌株bv-10(防效4.73％)》副炭疽芽胞杆菌bp1(防效3.54％)(图1)。
29.实施例2：
30.活体水稻盆栽检测贝莱斯芽孢杆菌bv-6发酵液对褐飞虱的防治效果
31.取一周龄水稻幼苗六盆(每盆30株)，试验分为两个处理，处理一：每盆水稻幼苗接种100头褐飞虱后均匀喷施bv-6摇培发酵液(od值0.6)20ml；处理二：每盆水稻幼苗接种100头褐飞虱后均匀喷施lb培养基20ml。每个处理三个重复，水稻幼苗放置玻璃缸后用纱布封好，处理1d，3d，8d后统计虫体数量，并计算防治效果。在处理的第8d后分别统计对照和bv-6处理的水稻幼苗存活率。
32.虫口减退率(％)＝(防治前的活虫数-防治后的活虫数)/防治前的活虫数*100
33.防治效果(％)＝(处理组虫口减退率-对照组虫口减退率)/(1-对照组虫口率)*100％
34.水稻幼苗存活率(％)＝(存活水稻幼苗株数/总水稻幼苗株数)*100％
35.bv-6喷施后的水稻植株上的褐飞虱虫口数量显著减少，水稻植株生长状况良好，
并未发生枯萎现象，经过lb培养基喷施的ck处理，褐飞虱的虫口数量并未出现减退，水稻植株受褐飞虱危害后出现枯萎现象。经过bv-6发酵液处理1d后对水稻褐飞虱的防效为64.69％，3d后的防效为70.21％，8d后的防效为76.27％。在处理的第8d对照组水稻幼苗存活率为15.56％，经过bv-6处理的水稻幼苗存活率为100％，在处理的第10d对照组水稻幼苗全部枯死(存活率为0％)，经过bv-6处理的水稻幼苗存活率为100％(图2)。
36.实施例3：
37.贝莱斯芽孢杆菌bv-6可湿性粉剂对水稻褐飞虱的防效试验
38.检测贝莱斯芽孢杆菌bv-6可湿性粉剂(1
×
10
11
cfu/g)的500倍稀释液对水稻褐飞虱的防效，称取1g bv-6可湿性粉剂用500ml无菌水稀释配置成粉剂500倍稀释液，对照采用无菌水处理。取一周龄水稻幼苗六盆(每盆30株)，试验分为两个处理，处理一：每盆水稻幼苗接种30头褐飞虱后均匀喷施bv-6可湿性粉剂500倍稀释液20ml；处理二：每盆水稻幼苗接种100头褐飞虱后均匀喷施无菌水20ml。每个处理三个重复，水稻幼苗放置玻璃缸后用纱布封好，分别在24h，48h，72h后统计各个处理死亡率并计算防治效果。
39.防治效果(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)*100％
40.bv-6可湿性粉剂500倍稀释液对褐飞虱的24h，48h和72h防治效果分别为76.84％，86.77％，89.46％(图3)。