一种降低烟草黑胫病发病率的烟草间作轮作种植方法与流程

1.本发明涉及烟草种植技术领域，特别涉及降低烟草黑胫病发病率的烟草间作轮作种植方法。


背景技术：

2.由烟草寄生疫霉(phytophthora parasitic var.nicotianae)侵染引起的烟草黑胫病(tobacco black shank，tbs)是一种对烟草具有毁灭性影响的土传病害，可以危害几乎所有类型的烟草，严重影响了烟草的质量与产量，对烟草行业造成巨大的经济损失。已有研究表明烟草疫霉(p.parasitic var.nicotianae)是一种难以控制的土传病原体，在没有寄主植物的土壤中也能存活多年，即使抗性最强的品种也会受到病原菌侵染，因此难以通过抗病育种防治。施用化学农药防治烟草黑胫病会使病原菌产生抗药性，并且化学药剂在杀死病原菌的同时也会杀死多种有益微生物，破坏土壤微生态结构。多年烟草连作种植制度还会降低土壤的理化性质，使土壤中有益微生物种类数量呈现下降趋势而病原菌数量呈现上升趋势。
3.间作轮作是耕作制度中的重要农艺措施，可提高土壤肥力和团聚体稳定性，调控土壤微生物群落结构，抑制根际病原菌的生长，减缓病原菌对寄主植物的侵染。目前已有很多通过轮作防治烟草土传病害、改善土壤微生物群落的报道。例如，《万寿菊-烟草轮作调理植烟土壤细菌群落结构的作用》(黎妍妍等，2021)公开了将万寿菊与烟草轮作，能够提高烟株根际土壤细菌群落的丰富度和多样性，提升土壤中酸杆菌门(acidobacteria)和拟杆菌门(bacteroidetes)的相对丰度，多种有益菌属比例上升，有利于解决烟草连作障碍。例如，《大蒜与烤烟轮作对烟草黑胫病的防治效果及作用机理初探》(钏有聪等，2016)公开了将大蒜与烤烟轮作，通过大蒜的根系分泌的苯并噻唑、二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基二硫醚等抑菌物质，可有效抑制烟草黑胫病菌菌丝生长，从而降低烟草黑胫病的发生和危害。然而，并非所有作物轮作都能获得理想效果，例如《玄参与烟草轮作对根际土壤养分,酶活性及微生物群落结构的影响》(伍晓丽等，2022)公开了将烟草与玄参轮作，土壤微生物群落结构没有明显改善，还对土壤酶活和ph有不良影响。
4.此外，对于荞麦与其他植物的间作轮作，已经有了一定的研究成果。例如，《不同轮作模式对潮土团聚体及其有机碳分布的影响》(范倩玉等，2021)中公开了按照油菜-荞麦、玉米-荞麦、马铃薯-荞麦和燕麦-荞麦进行轮作，发现这4种轮作模式均提高了土壤大团聚体数量和稳定性，增加土壤的固碳能力，尤其是油菜-荞麦的轮作更有利于土壤固碳。《马铃薯间作栽培对土壤微生物群落结构与功能的影响》(刘亚军等，2018)公开了马铃薯-荞麦间作后，土壤细菌、放线菌生物量均有所提高，革兰氏阳性/阴性菌比值升高；土壤微生物群落的丰富度指数降低了13.7％，但均匀度和优势度指数分别增加了8.8％和3.4％。《马铃薯与蚕豆、荞麦间作对土壤的影响》(刘亚军等，2018)则公开了马铃薯-荞麦间作能显著提高土壤速效磷、全氮和有机质含量，增加根际土壤细菌比例，降低了放线菌比例，放线菌数量较单作相比显著下降36.5％。由此可见，荞麦与一些植物的间作轮作可有效防治作物病虫害，
调控土壤微生态环境。但上述这些研究仅仅是通过磷脂脂肪酸(plfa)等测定，揭示了各种农作物与荞麦轮作/间作栽培对土壤微环境和微生物的影响机制，并未涉及如何采用轮作间作方式减少烟草黑胫病的相关研究。
5.黑胫病为真菌性病害，病原菌在形态、侵染、传播等方面与其他植物病害存在较大差别。关于烟草黑胫病的防治，中国专利申请cn109302921a公开了通过集成技术，加入自制生物菌肥，极大地减少了烟草黑胫病的发生，在冬季进行深灌，在烟草黑胫病发病前期或初期用生物菌剂灌根进行防治，可以有效减少烟田病原菌，使连作烟田黑胫病逐年减轻。中国专利申请cn109863953a公开了利用香茅草与烤烟间作以控制烟草黑胫病发生，将香茅草种子和草木灰用少量人畜粪水充分拌匀后播种，把种子播到穴里，覆土；同年5月移栽烟苗，与香茅草苗间作种植；施用有机肥作为基肥，开花盛期追施液肥，最终使得烤烟黑胫病发病率和病情指数均明显下降。然而，上述专利申请均是将烟草与禾本科等作物间作防治烟草黑胫病，并未研究烟草与荞麦如何轮作和间作，实现烟草黑胫病的防治。


技术实现要素：

6.针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种降低烟草黑胫病发病率的烟草间作轮作种植方法，采用高通量测序方法研究荞麦-烟草的间作轮作效应，不仅涉及到土壤微生物群落结构的调控研究，更着重于对烟草黑胫病的防治，最终筛选出适于与烟草间作、轮作的荞麦，评估了烟荞间作轮作对烟草黑胫病发生的防治效果，检测了间作轮作后土壤中黑胫病菌的数量消减动态，有效降低了旱地田间烟草黑胫病的发病率。具体通过以下技术实现。
7.一种降低烟草黑胫病发病率的烟草间作轮作种植方法，具体步骤为：
8.s1、第一年提前对烟田进行整地、施底肥、起垄；按固定距离(一般为50-55cm)移栽烟苗；在烟苗行间种植荞麦；
9.s2、第一年完成烟草和荞麦采收后，清理烟田并进行深翻；再次进行整地、施底肥、起垄，进行第二次种植荞麦；
10.s3、在第二年完成第二次收割荞麦后，继续整地、施底肥、起垄；按固定距离种植荞麦和烟苗；如此反复进行烟草-荞麦的间作和轮作种植。
11.优选地，步骤s1中，烟苗和荞麦的田间布局比例为6:2，步骤s3中荞麦和烟苗的田间布局比例为6:2。
12.优选地，步骤s1中，在第一年的4月份，移栽烟苗前20-25天开始进行整地、施底肥、起垄，按照55-60cm移栽烟苗。
13.优选地，步骤s2中在第一年9月完成烟草和荞麦采收。
14.优选地，所述荞麦的播种量为8-10kg/亩。
15.优选地，所述荞麦为甜荞92-1。
16.本发明提供的烟草和荞麦的轮作间作方式，具体为：第一年4月进行烟草-荞麦间作，9月底烟草和荞麦收获后，单独种植荞麦；第二年4月荞麦收获后，再次种植烟草和荞麦，且烟草和荞麦的田间布局比例与上一年正好相反；9月底烟草和荞麦收获后，再次单独种植荞麦。后续年份以此类推。
17.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
18.1、本发明提供的烟草和荞麦的间作轮作方法，适用于旱地烟草种植；采用本方法种植的烟苗，在烟苗移栽后第45d、60d、75d时的烟草黑胫病病情指数分别下降了35.59％、36.22％、46.53％；经过荧光定量pcr检测，烟草根际土壤黑胫病病菌数量分别降低了41.21％、85.19％、94.76％。
19.2、采用本发明的种植方法，烟株根际土壤细菌群落sobs、shannon和chao1等多样性和丰富度指数显著提高；
20.烟草根际土壤生防菌(芽孢杆菌属bacillus)、功能菌(candidatus_solibacter、大豆根瘤菌属bradyrhizobiu)、降解菌(鞘氨醇单孢菌属sphingomonas、ramlibacter)等细菌菌属的比例显著增加，烟草根际土壤致病菌(劳尔氏菌属ralstonia、伯克霍尔德氏菌属burkholderia)等细菌菌属的比例显著减少。
附图说明
21.图1为实施例的烟草和荞麦间作的田间分布示意图；
22.图2为试验例2的引物标准曲线；
23.图3为第二年烟草移栽后不同天数的土壤中烟草黑胫病病菌dna的rt-qpcr扩增曲线；图中，a为45d；b为60d；c为75d；
24.图4为烟草移栽后60d，烟草-荞麦间作轮作对烟草黑胫病的防治作用对比；
25.图5为烟草移栽后75d，烟草-荞麦间作轮作对烟草黑胫病的防治作用对比。
具体实施方式
26.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
27.以下实施例和对比例进行的试验，2020-2021年间在湖北省恩施州宣恩县椒园镇凉风村开展，以云烟87为供试品种，所用的荞麦为甜荞92-1。将试验田均分为20个小区，每块试验田0.5亩，分别用于各实施例或对比例的试验。参照《烤烟高产优质栽培技术》(李雪梅，李自相，2019)进行。荞麦的种植及田间管理参照《荞麦的种植要求及高产种植技术》(高瑞红，刘玉红，2018)进行。
28.实施例
29.本实施例所进行的烟草和荞麦间作轮作种植方法，具体步骤为：
30.s1、第一年4月份，在移栽烟苗之前20天，清除田间烟杆、荞麦桩及杂草，按照烟草生产技术要求，开1.2m宽的高畦，行距1.1-1.2m，深8-10cm进行整地、施底肥(每667m2烟田施用50kg生物有机肥(河北德沃多肥料有限公司)、10kg复合肥(河北德沃多肥料有限公司)、10kg硫酸钾、15kg硝酸钾、2kg生物钾肥和1kg硫酸锌)、起垄；按大约55-60cm的固定株距移栽烟苗；在烟苗行间种植荞麦，烟苗和荞麦的田间布局比例为6:2；
31.s2、第一年完成烟草和荞麦采收后，清理清除田间烟杆、荞麦桩及杂草，并进行深翻；再次按照步骤s1的方法进行整地、施底肥(与烟草种植所用底肥相同)、起垄，进行第二次种植荞麦；荞麦的播种量为10kg/亩；
32.s3、在第二年完成第二次收割荞麦后，继续按照步骤s1的方法整地、施底肥、起垄；
种植荞麦和烟苗，荞麦和烟苗的田间布局比例为2:6；如此反复进行烟草-荞麦的间作和轮作种植。
33.对比例
34.本对比例所进行的烟草种植方法，采用烟草单作方法，连续种植(连作)两年，其具体步骤为：(1)第一年4月份，在移栽烟苗之前20天，清除田间烟杆、荞麦桩及杂草，开1.2m宽的高畦，行距1.1-1.2m，深8-10cm进行整地；按55-60cm株距移栽烟苗，管理方法同实施例1，9月底烟叶收获；(2)第二年4月份，整地，循环种植烟草。
35.试验例1：烟草黑胫病的的田间防治情况试验
36.在完成上述实施例和对比例的第二年的烟草移栽后(即第二年的4月份)，在第45d、60d、75d采用定点法，调查田间烟草黑胫病的发病情况。
37.烟草黑胫病病情分级按照中华人民共和国国家标准gb/t 23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》，并根据公式计算病情指数。计算结果如下表1所示。
38.病情指数＝∑(各级病株数
×
该病级值)/(调查总株数
×
最高级值)
×
100。
39.表1烟草黑胫病病情指数
[0040][0041]
田间试验结果表明，烟草—荞麦—荞麦—烟草间作轮作种植对烟草黑胫病的防治效果如表1所示，烟草—荞麦—荞麦—烟草间作轮作种植显著降低了烟草黑胫病的病情指数，在烟草移栽45d、60d、75d时病情指数分别下降了35.59％、36.22％、46.53％。
[0042]
试验例2：烟草根际土壤黑胫病病菌数量的消减情况试验
[0043]
根据ncbi数据库中烟草黑胫病病菌的para1基因并利用ncbi中的primer-blast设计特异性引物：
[0044]
tb166f：5
’‑
ccacggcaaaacctaca-3’；
[0045]
tb166r：5
’‑
cggaagttcatttcggat-3’，由北京六合华大基因科技有限公司合成；用于黑胫病菌dna的常规和实时定量pcr检测。
[0046]
常规pcr体系为：2
×
taq master mix 12.5μl，dna模板1μl，正反引物各1μl，加ddh2o至25μl充分混合。
[0047]
pcr反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸60s；35个循环；最后72℃延伸8min，16℃保存。
[0048]
反应结束后，pcr产物经1％琼脂糖凝胶检测及回收(美国omega公司)，将回收产物克隆至pmd18-t载体(日本takara公司)并转化大肠杆菌dh5α(上海唯地生物技术有限公司)，经蓝白斑筛选后提取质粒dna(美国omega公司)并送至北京六合华大基因科技有限公司进行核酸测序。
[0049]
参照《土壤中立枯丝核菌ag3菌核的荧光定量pcr快速检测》(申永铭等，2017)的方法计算质粒dna初始浓度为3.46
×
10
10
copies/μl，-20℃保存待用。10倍系列稀释，取9个浓度梯度的质粒标准品，每个梯度5次重复进行常规pcr和荧光定量pcr扩增，通过凝胶电泳成
像及扩增曲线检测引物tb166f/tb166r的灵敏度。
[0050]
培养并收集烟草黑胫病菌孢子，采用10倍分别稀释至1
×
101、1
×
102、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108个/ml(取各浓度孢子液5ml分别加入5g灭菌的烟田土中，混匀后静置1h，模拟带菌环境，使土壤中黑胫病菌孢子浓度分别为1
×
10
1-1
×
108个/g)。分别取0.2g上述混菌的土壤，提取土壤微生物总dna，经琼脂糖凝胶电泳检测，超微量分光光度计检测土壤dna总浓度和纯度，-20℃保存备用，以此为模板进行荧光定量pcr检测制作标准曲线，如图2所示。
[0051]
第二年烟草移栽后45d、60d、75d，分别采集烟草根际土样，采用dna试剂盒(美国omega公司)提取烟草根际土壤总dna，1％琼脂糖凝胶电泳检测。通过超微量分光光度计检测土壤总dna浓度和纯度，-20℃保存备用。进行常规pcr和荧光定量pcr扩增，获得不同根际土样的ct值，根据标准曲线，如图2、3所示，计算出土壤中黑胫病菌的数量，如下表2所示。
[0052]
表2烟草根际土壤黑胫病菌数量监测
[0053][0054]
结果显示，在烟草移栽45d、60d、75d间作轮作田病原菌孢子浓度均显著低于连作田，分别下降了41.21％、85.19％、94.76％。
[0055]
试验例3：烟草-荞麦轮作对烟草根际微生态环境的改良作用
[0056]
在完成上述实施例和对比例的第二年的烟草移栽后第75d，采集各试验田的烟草根际土样0.5g，用dneasy prowersoil pro kit试剂盒提取土壤中的总dna。
[0057]
以此为模板，用细菌引物：
[0058]
338f：5
’‑
actcctacgggaggcagcag-3’；
[0059]
806r：5
’‑
ggactachvgggtwtctaat-3’；
[0060]
以及真菌引物：
[0061]
its1f：5
’‑
cttggtcatttagaggaagtaa-3’；
[0062]
its2r：5
’‑
gctgcgttcttcatcgatgc-3’；
[0063]
进行pcr扩增。在美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com)进行数据分析。使用mothur软件计算alpha多样性中的sobs、chao1、shannon、coverage指数等。
[0064]
微生物alpha多样性指数中，sobs指数、shannon指数和chao1指数分别表示微生物otu丰度、多样性和丰富度。在第二年烟草移栽后75d，根际土壤细菌、真菌alpha指数如表3所示。
[0065]
表3烟草根际土壤细菌群落多样性分析
[0066][0067][0068]
由此可见，烟草—荞麦—荞麦—烟草种植模式下的烟草根际土壤细菌与真菌群落sobs指数、shannon指数、chao1指数均显著高于连作田，细菌群落三种指数分别增长了23.70％、6.38％、24.32％，真菌群落三种指数分别增长了24.51％、16.57％、41.17％。
[0069]
本试验例对相对丰度高于1％的土壤细菌、真菌属进行了显著性差异分析，结果如表4，5所示，采用本发明的烟草—荞麦—荞麦—烟草种植模式，显著增加了烟草根际土壤中盖勒氏菌属(norank_o__gaiellales)、鞘氨醇单孢菌属(sphingomonas)、芽单胞菌属(gemmatimonas)、大豆根瘤菌属(bradyrhizobium)、地杆菌属(terrabacter)、芽生球菌属(blastococcus)、candidatus_solibacter、ramlibacter、芽孢杆菌属(bacillus)的相对丰度；显著降低了罗河杆菌属(rhodanobacter)、微杆菌属(microbacterium)、噬几丁质菌属(norank_f__chitinophagaceae)、伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)、劳尔氏菌属(ralstonia)、红球菌属(rhodococcus)的相对丰度。
[0070]
采用本发明的烟草—荞麦—荞麦—烟草种植模式显著增加了亚隔孢壳属(didymella)、规整霉属(codinaea)、unclassified_c__sordariomycetes、短梗蠕孢属(trichocladium)、pseudaleuria、枝孢菌属(cladosporium)的相对丰度；显著降低了被孢霉属(mortierella)、新赤壳属(neocosmospora)、setophoma、赤壳属(haematonectria)的相对丰度。
[0071]
表4烟草根际土壤细菌相对丰度情况
[0072]
[0073][0074]
表5烟草根际土壤真菌相对丰度情况
[0075][0076]
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。