一种秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法及应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法及应用。


背景技术：

2.肥胖是全球性的主要健康问题之一，根据我国的身体质量指数(body mass index，bmi)的判断标准，成年人的bmi值》24kg/m2为超重，bmi值》28kg/m2为肥胖。肥胖会导致各种疾病的发病率增高，如ⅱ型糖尿病、心血管疾病、某些癌症、肾病、阻塞性睡眠呼吸暂停、痛风、骨关节炎和肝胆疾病等。目前较多研究采用哺乳动物如大鼠等对待测样品的减肥功效进行评价，通过建立大鼠的肥胖模型，解剖取肾周围脂肪、睾丸周围脂肪，并称重，计算脂/体，以评价作用效果。采用哺乳动物如大鼠等对其减肥功效进行评价，此方法存在实验周期长，经济成本高，工作量大等缺点，无法实现样品的快速筛选和评价。
3.专利cn 105560269a《玫瑰花多糖在制备治疗肥胖症的药物中的应用》中提到一种利用秀丽隐杆线虫建立肥胖症病理模型的方法：将同步化的线虫接在含有10mg/ml胆固醇的高脂ngm培养基上培养，使每板线虫含量为3000条左右，置于20℃生化培养箱中培养，使其储脂增加，成为肥胖模型。但是该技术方案有以下几点缺陷：1、造模效果不够明显；2、该技术方案在幼虫期l1期开始造模和上药，药物和造模剂可能会影响线虫的生长发育，从而影响结果的准确性；3、用胆固醇造模，而胆固醇不溶于水，只能以颗粒的形式分散在ngm培养基中，线虫在ngm培养基(固体培养基)的表面培养时，摄入效果较差；4、该技术方案的造模和上药同时进行，不符合肥胖模型的定义，即以高热量食物诱发动物肥胖，再给予受试样品(肥胖模型)，在给予高热量食物同时给予受试样品则是预防肥胖模型；5、该技术方案在线虫染色之前需要饥饿6h的处理，增加了干扰项，由于不同组别的线虫耐饥饿的程度不同，饥饿处理将会影响结果的准确性。
4.因此，设计一种模拟人群肥胖特点、增脂效果好、相对廉价、实验周期短、操作简便高效的肥胖症模型，是研发具有减脂功效产品的行业必然需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种快速评价待测样品的减肥功效的秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法及应用，本发明通过建立秀丽隐杆线虫肥胖模型，可以快速筛选具有减肥功效的候选成分，具有实验周期短、高效廉价的特点。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.第一目的，本发明提供了一种秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法，包括以下步骤：
8.收集l4期的秀丽隐杆线虫，用培养基培养秀丽隐杆线虫，调节秀丽隐杆线虫的密度，加入5-fudr、大肠杆菌菌液以及海藻糖培养，离心，收集处理后的秀丽隐杆线虫继续培养，加入5-fudr、大肠杆菌菌液以及乙醇处理，制得秀丽隐杆线虫肥胖模型。
9.秀丽隐杆线虫的幼虫期可细分为4个阶段，即l1～l4期，随后发育为成虫。本发明
的发明人经过大量研究及试验发现，采用l4期的秀丽隐杆线虫进行造模，在秀丽隐杆线虫的接近成年期开始造模，更适合于成年人肥胖模型，更符合实际情况，对秀丽隐杆线虫生长发育的影响较小，实验结果的准确性更高。而专利cn 105560269a在l1期开始造模和上药，药物和造模剂可能会影响秀丽隐杆线虫的生长发育，从而影响结果的准确性。
10.本发明构建方法中选用了不同的造模剂，能够有效提高造模的成膜效果，大幅提高了秀丽隐杆线虫的体脂含量，效果优于专利cn 105560269a的造模方法。本发明构建方法中加入5-fudr(5-氟尿嘧啶脱氧核苷)的作用是抑制线虫产卵，大肠杆菌菌液为液体培养的常规食物。
11.本发明构建方法使用海藻糖在培养基中造模秀丽隐杆线虫吸收高营养的效果更好，肥胖造模效果更高。海藻糖易溶于水，在培养基中容易被秀丽隐杆线虫摄入利用，而胆固醇不溶于水，只能以颗粒的形式分散在ngm培养基中，秀丽隐杆线虫在ngm培养基(固体培养基)的表面培养时，摄入效果较差。
12.专利cn 105560269a在线虫染色之前需要饥饿6h的处理，增加了干扰项，由于不同组别的线虫耐饥饿的程度不同，饥饿处理将会影响结果的准确性，而本发明的构建方法中不含有饥饿处理。
13.作为本发明所述秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法的优选实施方式，大肠杆菌菌液为浓缩大肠杆菌na22菌液。
14.作为本发明所述秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法的优选实施方式，5-fudr终浓度为0.1-0.5mm，浓缩大肠杆菌na22菌液每1000μl的s培养基加100-200μl。
15.更优选地，5-fudr终浓度为0.5mm，浓缩大肠杆菌na22菌液每1000μl的s培养基加100μl。
16.作为本发明所述秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法的优选实施方式，所述海藻糖的加入量为20-100mg。
17.使用上述质量的海藻糖可以促进秀丽隐杆线虫较好的吸收营养，提高造模的成膜效果，使得肥胖造模效果更佳，秀丽隐杆线虫的体脂量大幅提升。优选为，将海藻糖在液体培养基中造模，容易被秀丽隐杆线虫摄入利用，摄入效果佳。
18.作为本发明所述秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法的优选实施方式，所述构建方法还包括染色步骤，具体为：使用油红o染色法对秀丽隐杆线虫进行染色，以脂肪染色光密度值反映秀丽隐杆线虫的体脂含量；
19.脂肪染色光密度值计算公式如下：
[0020][0021]
脂肪染色光密度值反映了秀丽隐杆线虫的体脂含量，脂肪染色光密度值越高，秀丽隐杆线虫的体脂含量越高。
[0022]
作为本发明所述秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法的优选实施方式，所述培养基包括s培养基(液体培养基)。
[0023]
第二目的，本发明提供了木犀草素、表没食子儿茶素没食子酸酯或大豆皂苷bb作为药效活性成分在制备治疗肥胖症的药物中的应用。
[0024]
在一些实施例中，木犀草素、表没食子儿茶素没食子酸酯或大豆皂苷bb对于秀丽隐杆线虫的体脂含量有影响。
[0025]
脂肪染色光密度值随着木犀草素、表没食子儿茶素没食子酸酯或大豆皂苷bb的质量浓度的升高而降低，具有浓度梯度效应。
[0026]
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述木犀草素的质量浓度为50μm-100μm；所述表没食子儿茶素没食子酸酯的质量浓度为50μm-100μm；所述大豆皂苷bb的质量浓度为25μm-50μm。
[0027]
优选地，所述木犀草素的质量浓度为50μm或100μm；所述表没食子儿茶素没食子酸酯的质量浓度为50μm或100μm；所述大豆皂苷bb的质量浓度为25μm或50μm。
[0028]
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物的剂型为注射剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液或片剂。
[0029]
第三目的，本发明提供了上述构建方法构建的秀丽隐杆线虫肥胖模型在筛选具有减肥功效的候选成分中的应用。
[0030]
第四目的，本发明提供了上述构建方法构建的秀丽隐杆线虫肥胖模型在制备减脂功效产品中的应用。
[0031]
通过上述秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法构建的肥胖模型能够在成本较低的情况下快速开展待测样品减肥功效的评价的能力，具有较好的市场应用价值。
[0032]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0033]
1)本发明的构建方法与专利cn 105560269a相比，选用了不同的造模剂，能有效提高造模的成模效果，本发明的秀丽隐杆线虫肥胖模型的脂肪染色光密度值较专利cn 105560269a的肥胖模型增加了24％，显著性升高(p《0.01)，表明本发明秀丽隐杆线虫肥胖模型的造模方法能使秀丽隐杆线虫的体脂含量大幅提高，远优于专利cn 105560269a的造模方法。
[0034]
2)专利cn 105560269a的造模和上药在秀丽隐杆线虫的l1期开始，在l4期结束，而本发明的构建方法在秀丽隐杆线虫的l4期开始造模，cn 105560269a用同步化的秀丽隐杆线虫造模培养至42h，即从l1期造模到l4期，而本发明的构建方法从l4期开始造模。cn 105560269a在l1期开始造模和上药，药物和造模剂可能会影响线虫的生长发育，从而影响结果的准确性，而本发明的构建方法在秀丽隐杆线虫的l4期开始造模，在秀丽隐杆线虫的接近成年期开始造模，更适合于成年人肥胖模型，更符合实际情况，对秀丽隐杆线虫生长发育的影响较小，实验结果的准确性更高。
[0035]
3)本发明的构建方法使用海藻糖在液体培养基中造模，秀丽隐杆线虫吸收高营养的效果更好，肥胖造模效果更高。海藻糖易溶于水，在s培养基(液体培养基)中容易被秀丽隐杆线虫摄入利用，而胆固醇不溶于水，只能以颗粒的形式分散在ngm培养基中，秀丽隐杆线虫在ngm培养基(固体培养基)的表面培养时，摄入效果较差。
[0036]
4)cn 105560269a在秀丽隐杆线虫染色之前需要饥饿6h的处理，增加了干扰项，由于不同组别的秀丽隐杆线虫耐饥饿的程度不同，饥饿处理将会影响结果的准确性，而本发明的构建方法不需要饥饿处理，与cn 105560269a存在明显差别。
附图说明
[0037]
图1为木犀草素对本发明构建的秀丽隐杆线虫肥胖模型(优化造模组)的脂肪染色光密度值的影响结果图；
[0038]
图2为表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)对本发明构建的秀丽隐杆线虫肥胖模型(优化造模组)的脂肪染色光密度值的影响结果图；
[0039]
图3为大豆皂苷bb对本发明构建的秀丽隐杆线虫肥胖模型(优化造模组)的脂肪染色光密度值的影响结果图；
[0040]
图4为专利cn 105560269a的秀丽隐杆线虫肥胖模型与本发明构建的秀丽隐杆线虫肥胖模型的相对脂肪染色光密度值实验结果图。
具体实施方式
[0041]
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
[0042]
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]
浓缩大肠杆菌na22菌液的制备步骤为：挑取大肠杆菌na22单菌落于luria-bertani液体培养基中，于37℃、120rpm的恒温摇床中培养24h，将得到的大肠杆菌na22菌液于1000rpm离心2min，弃上清后加入s培养基，使其浓缩10倍，制得浓缩大肠杆菌na22菌液。
[0044]
实施例1、一种秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法
[0045]
一种秀丽隐杆线虫肥胖模型的构建方法，包括以下步骤：
[0046]
收集l4期(接近成年期)的秀丽隐杆线虫在24孔板(1000μl/孔)中，用s培养基(秀丽隐杆线虫的液体培养基)进行培养，调节秀丽隐杆线虫密度约100虫/ml，加入终浓度为0.5mm的5-fudr(抑制线虫产卵)、浓缩大肠杆菌na22菌液(液体培养的常规食物，100μl浓缩大肠杆菌na22菌液/每1000μl的s培养基)以及海藻糖20mg，置于摇床培养48h后，用1.5ml离心管收集秀丽隐杆线虫并清洗秀丽隐杆线虫，用s培养基转移在新的24孔板(1000μl/孔)中进行培养24h，加入5-fudr、浓缩大肠杆菌na22菌液以及100μl乙醇培养24h，制得秀丽隐杆线虫肥胖模型。
[0047]
实施例2、阳性药物对构建的秀丽隐杆线虫肥胖模型的脂肪染色光密度值的影响
[0048]
实验方法：
[0049]
1、阳性药物处理：
[0050]
用s培养基收集l4期的秀丽隐杆线虫在24孔板(1000μl/孔)中进行培养，加入5-fudr、浓缩大肠杆菌na22菌液以及海藻糖20mg，置于摇床培养48h后，用1.5ml离心管收集秀丽隐杆线虫并清洗秀丽隐杆线虫，用s培养基转移在新的24孔板(1000μl/孔)中进行培养24h，加入5-fudr、浓缩大肠杆菌na22菌液、100μl乙醇以及木犀草素溶解液(终浓度为50/100μm)/表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)溶解液(终浓度为50/100μm)/大豆皂苷bb溶解液(终浓度为25/50μm)培养24h；空白对照组用s培养基收集l4期的秀丽隐杆线虫进行培养，加入5-fudr以及浓缩大肠杆菌na22菌液；优化造模组使用实施例1的构建方法。
[0051]
2、秀丽隐杆线虫的染色：
[0052]
将上述步骤处理后的秀丽隐杆线虫离心，弃上清，取沉淀，加入0.4％甲醛溶液
1ml，使用油红o染色法对秀丽隐杆线虫进行染色，并作成玻片，使用偏光显微镜在10
×
物镜下观察并拍摄图片，每组实验设置10个平行组，使用imagej进行图片分析、记录数值。以脂肪染色光密度值反映秀丽隐杆线虫的体脂含量，脂肪染色光密度值越高，线虫的体脂含量越高。
[0053]
脂肪染色光密度值计算公式如下：
[0054][0055]
3、实验结果：
[0056]
1)木犀草素对秀丽隐杆线虫肥胖模型的脂肪染色光密度值的影响：
[0057]
参考图1，空白组、优化造模组、木犀草素50μm组、木犀草素100μm组的脂肪染色光密度值分别为55.32％
±
5.26％、75.89％
±
2.63％、63.23％
±
4.55％、55.90％
±
4.80％。和空白组相比，优化造模组的脂肪染色光密度值有显著的升高(p《0.01)；和优化造模组相比，木犀草素50μm组、木犀草素100μm组的脂肪染色光密度值均有显著的降低(p《0.01)，且浓度为从50μm升高到100μm时，脂肪染色光密度值随着浓度的升高而降低(p《0.01)，具有浓度梯度效应。
[0058]
2)表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)对秀丽隐杆线虫肥胖模型的脂肪染色光密度值的影响：
[0059]
参考图2，空白组、优化造模组、egcg 50μm组、egcg 100μm组的脂肪染色光密度值分别为55.32％
±
5.26％、75.89％
±
2.63％、60.10％
±
3.19％、55.06％
±
3.51％。和空白组相比，优化造模组的脂肪染色光密度值有显著的升高(p《0.01)；和优化造模组相比，egcg 50μm组、egcg 100μm组的脂肪染色光密度值均有显著的降低(p《0.01)，且浓度为从50μm升高到100μm时，脂肪染色光密度值随着浓度的升高而降低(p《0.01)，具有浓度梯度效应。
[0060]
3)大豆皂苷bb对秀丽隐杆线虫肥胖模型的脂肪染色光密度值的影响：
[0061]
参考图3，空白组、优化造模组、大豆皂苷bb 25μm组、大豆皂苷bb 50μm组的脂肪染色光密度值分别为55.32％
±
5.26％、75.89％
±
2.63％、55.57％
±
3.09％、48.06％
±
2.83％。和空白组相比，优化造模组的脂肪染色光密度值有显著的升高(p《0.01)；和优化造模组相比，大豆皂苷bb 25μm组、大豆皂苷bb 50μm组的脂肪染色光密度值均有显著的降低(p《0.01)，且浓度为从25μm升高到50μm时，脂肪染色光密度值随着浓度的升高而降低(p《0.01)，具有浓度梯度效应。
[0062]
对比例1、采用专利cn 105560269a的秀丽隐杆线虫肥胖模型的实验方法
[0063]
1、秀丽隐杆线虫肥胖症病理模型的建立与处理：
[0064]
将同步化的秀丽隐杆线虫(处于l1期)接在含有10mg/ml胆固醇的高脂ngm培养基上培养，并在固体ngm板上涂有大肠杆菌op50浓缩液，使每板线虫含量为200条左右，置于20℃生化培养箱中培养至42h(处于l4期)，用m9将线虫洗下来，转移到离心管中，饥饿处理6h。
[0065]
2、秀丽隐杆线虫的染色：
[0066]
将步骤1处理后的秀丽隐杆线虫沉淀，弃上清，加入0.4％甲醛溶液1ml，使用油红o染色法对秀丽隐杆线虫进行染色，并作成玻片，使用偏光显微镜在10
×
物镜下观察并拍摄图片，每组实验设置10个平行组，使用imagej进行图片分析、记录数值。以脂肪染色光密度
值反映秀丽隐杆线虫的体脂含量，脂肪染色光密度值越高，秀丽隐杆线虫的体脂含量越高，实施例1获得的秀丽隐杆线虫肥胖模型和采用专利cn 105560269a构建的的秀丽隐杆线虫肥胖模型的脂肪染色光密度值之比，为相对脂肪染色光密度值。
[0067]
脂肪染色光密度值计算公式如下：
[0068][0069]
参考图4，专利cn 105560269a构建的的秀丽隐杆线虫肥胖模型和实施例1获得的秀丽隐杆线虫肥胖模型的脂肪染色光密度值分别为60.17
±
5.14％和75.89
±
2.63％，实施例1获得的秀丽隐杆线虫肥胖模型的脂肪染色光密度值比专利cn 105560269a构建的的秀丽隐杆线虫肥胖模型的肥胖模型增加了24％，肥胖造模效果显著高于专利cn 105560269a构建的的秀丽隐杆线虫肥胖模型的模型(p《0.01)。
[0070]
本发明建立一种能快速评价待测样品的减肥功效的秀丽隐杆线虫肥胖模型，本模型能够在成本较低的情况下快速开展待测样品减肥功效的评价的能力，具有较好的市场应用价值。
[0071]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。