一种心叶马铃苣苔的组织培养方法

1.本发明涉及植物繁殖技术领域，具体涉及一种心叶马铃苣苔的组织培养方法。


背景技术：

2.苦苣苔科马铃苣苔属植物心叶马铃苣苔(oreocharis cordatula(craib)pellegrin)为多年生草本植物，具粗而短根状茎；叶为长圆状披针形或长圆状卵形；聚伞花序，每花序具4至10花；花序梗长达12厘米，与花梗、花冠、花萼被淡褐色腺状柔毛；花序为密集的聚伞花序，花朵和萼片均为黄色，而花冠裂片为黄紫色，花色鲜艳可爱。心叶马铃苣苔株形美观，花朵清丽可人，可用于室内盆栽花卉开发，当地居民常用于跌打草药，用途广泛，具有较高开发价值和应用前景。
3.心叶马铃苣苔仅见分布于我国云南(香格里拉)、四川(九龙、木里、盐源)山顶、沟谷石灰岩上，是我国的特有物种。然而长期以来，这一具有极高观赏价值的苦苣苔植物一直处于野生状态，且根据iucn濒危等级评估体系被评为“近危(near threaten,nt)”，限制了其在园林园艺实践中的有效应用。目前，心叶马铃苣苔的种苗主要通过种子和叶插进行繁育。种子播种虽然可在短时间内获得大量幼苗，然而经种子繁育的后代易发生性状分离，遗传性状不稳定，易丢失亲本的优良性状，并且长势不一，较难得到长势一致的群体后代。另外，心叶马铃苣苔的种子也不耐贮藏，一年后种子活力就下降50％，随着贮藏时间延长，种子萌发率越来越低。而叶插方式繁育需要大量的生长健康的叶片，成本高，耗时较长，且不同个体的叶插后代长势也很难保持一致，且存在周期长、成本高、效率低下、长势不一等问题，且对其的组织培养未见报道。因此，采用植物组织培养技术来缓解其种苗紧张压力、进行可持续开发利用是十分必要的。
4.目前马铃苣苔属已经报道的组织培养和快速繁殖的有黄花马铃苣苔oreocharis flavida merr.、瑶山苣苔o.cotinifolia(w.t.wang)mich.&a.weber，上述两种物种分别分布于我国海南岛和广西壮族自治区，与本研究的研究对象不同，尤其是其原产地生长条件具有很大的差异。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种心叶马铃苣苔的组织培养方法。目的在于提供一种心叶马铃苣苔oreocharis cordatula(craib)pellegrin的组织培养快繁方法，通过诱导诱导不定芽培养、继代增殖培养、试管苗生根培养、炼苗移栽阶段成功获得了心叶马铃苣苔离体再植株，建立组织培养快速繁殖技术体系。
6.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种心叶马铃苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：
7.1)诱导不定芽培养，2)继代增殖培养，3)生根培养，4)炼苗移栽；
8.所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、1.0～3.0mg/l tdz(脱叶灵，n-苯基-n'-(1,2,3-噻二唑-5-基)脲)、0.05～0.5mg/l 2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.1～
0.5mg/l iba(吲哚-3-丁酸)、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
9.所述步骤2)的继代增殖培养基为：ms基础培养基、1.0～2.0mg/l 6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)、0.05～0.5mg/l naa(萘乙酸)、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
10.所述步骤3)的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.1～0.5mg/l iba(吲哚-3-丁酸)、1.0～2.0mg/l ggr(双吉尔-ggr，购自北京艾比蒂研究开发中心)、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l琼脂，ph为5.4～5.8。
11.本发明的有益效果是：本发明利用植物组织培养技术进行心叶马铃苣苔的组织培养技术，建立了心叶马铃苣苔的组织培养快繁体系和方法，具有简单、易行、经济的特点；通过本发明育成的心叶马铃苣苔组培苗移栽成活率达到98％以上，可以为其规模化种植提供优质种苗保障。
12.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
13.进一步，所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、1.00～2.0mg/l tdz、0.3～0.4mg/l 2,4-d、0.1～0.3mg/l iba、20～25g/l蔗糖、4.0～4.5g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
14.所述步骤2)的继代增殖培养基为：ms基础培养基、1.0～1.5mg/l 6-ba、0.2～0.4mg/l naa、25～30g/l蔗糖、3.8～5.5g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
15.所述步骤3)的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.3～0.4mg/l iba、1.2～1.8mg/l ggr、18～20g/l蔗糖、3.5～4.5g/l琼脂，ph为5.4～5.8。
16.进一步，所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、1.0mg/ltdz、0.2mg/l2,4-d、0.1mg/l iba、20g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.5；
17.所述步骤2)的继代增殖培养基为：ms基础培养基、1.0mg/l 6-ba、0.05mg/l naa、25g/l蔗糖、5.0g/l琼脂，ph为5.5；
18.所述步骤3)的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.1mg/l iba、1.0mg/l ggr、15g/l蔗糖、3.5g/l琼脂，ph为5.5。
19.进一步，所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、2.0mg/l tdz、0.3mg/l 2,4-d、0.3mg/l iba、20g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.5；
20.所述步骤2)的继代增殖培养基为：ms基础培养基、1.5mg/l 6-ba、0.2mg/l naa、30g/l蔗糖、5.5g/l琼脂，ph为5.8；
21.所述步骤3)的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.4mg/l iba、1.2mg/l ggr、18g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.8。
22.进一步，所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、3.0mg/l tdz、0.4mg/l2,4-d、0.5mg/l iba、25g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8；
23.所述步骤2)的继代增殖培养基为：ms基础培养基、2.0mg/l 6-ba、0.4mg/l naa、30g/l蔗糖、3.8g/l琼脂，ph为5.8；
24.所述步骤3)的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.3mg/l iba、1.8mg/l ggr、20g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8。
25.进一步，步骤1)诱导不定芽培养的具体为：选取继代无菌苗的嫩叶为外植体，除去外植体边缘并横向切2～3刀增加伤口，接种到诱导不定芽培养基上，于25～28℃条件下全暗培养3～4天，再转移至光照强度为1500～2000lx，光照时间12～15小时，培养温度为25～
28℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽。
26.进一步，继代无菌苗的嫩叶的培养方式为：用解剖刀将嫩叶从中间横向切成2半，叶片的正面朝上放置在ms诱导培养基表面进行诱导培养；ms诱导培养基的成分为ms基础培养基、1.0～2.0mg/l tdz、0.3～0.4mg/l 2,4-d、0.1～0.3mg/l iba、20～25mg/l蔗糖、4.0～4.5g/l琼脂，ph为5.4～5.8。
27.进一步，步骤2)继代增殖培养具体为：将步骤1)诱导形成不定芽从基部切下，接种到继代增殖培养基上进行继代培养，接种后每天光照12～15小时，光照强度为2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，直至培养长至2～4cm的不定芽。
28.进一步，步骤3)生根培养具体为：将步骤2)培养长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25～28℃条件下全暗培养3～5天，然后每天光照培养12～15小时，光照强度为2500lx，培养温度为25～28℃的条件下，直至长至5～8cm的生根试管苗。
29.进一步，步骤4)炼苗移栽具体为：将长至5～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗3～5天后，将生根试管苗从培养瓶中取出，洗涤，栽入由泥炭土基质中并定植的塑料盆中。
附图说明
30.图1为本发明诱导不定芽培养基上培养图，其中a至b图为外植体至诱导形成不定芽；
31.图2为本发明的转移到继代增殖培养基培养图；
32.图3为本发明的转移到生根培养基上长图。
具体实施方式
33.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
34.实施例1
35.本实施例的一种心叶马铃苣苔的组织培养方法，详见图1至3，包括如下步骤：
36.(1)诱导不定芽：选取继代无菌苗的嫩叶为外植体，除去边缘并横向切2～3刀增加伤口。接种到诱导培养基上,于25～28℃条件下全暗培养3天，再转移至光照强度为1500lx，光照时间12小时，培养温度为25℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽，不定芽诱导率可达92.7％。所述的诱导培养基为：ms基础培养基、1.0mg/l tdz、0.2mg/l 2,4-d、0.1mg/l iba、20g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.5；
37.(2)继代培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培养，20天转接一次，增殖系数为7.64。所述的增殖培养基为：ms基础培养基、1.0mg/l 6-ba、0.05mg/l naa、25g/l蔗糖、5.0g/l琼脂，ph为5.5；
38.(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培养7天即开始生根，生根率可达96.2％。所述的生
根培养基为：1/2ms基础培养基、0.1mg/l iba、1.0mg/l ggr(注：双吉尔-ggr，购自北京艾比蒂研究开发中心)、15g/l蔗糖、3.5g/l琼脂，ph为5.5。
39.(4)炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中并定植于塑料盆中，移栽成活率为100％。
40.实施例2
41.本实施例的一种心叶马铃苣苔的组织培养方法，详见图1至3，包括如下步骤：
42.(1)诱导不定芽：选取继代无菌苗的嫩叶为外植体，除去边缘并横向主叶脉切3刀增加伤口。接种到诱导培养基上,于26℃条件下全暗培养4天，再转移至光照强度为2000lx，光照时间13小时，培养温度为26℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽，不定芽诱导率可达95.4％。所述的诱导培养基为：ms基础培养基、2.0mg/l tdz、0.3mg/l 2,4-d、0.3mg/l iba、20g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.5；
43.(2)继代培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照14小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养，25天转接一次，增殖系数为8.13。所述的增殖培养基为：ms基础培养基、1.5mg/l 6-ba、0.2mg/l naa、30g/l蔗糖、5.5g/l琼脂，ph为5.8；
44.(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在26℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照15小时，光照强度为2500lx，培养温度为26℃的条件下培养10天即开始生根，生根率可达97％。所述的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.4mg/l iba、1.2mg/l ggr(注：双吉尔-ggr，购自北京艾比蒂研究开发中心)、18g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.8。
45.(4)炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗4天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中并定植于大田中，移栽成活率为100％。
46.实施例3
47.本实施例的一种心叶马铃苣苔的组织培养方法，详见图1至3，包括如下步骤：
48.(1)诱导不定芽：选取继代无菌苗的嫩叶为外植体，除去边缘并横向主叶脉切3刀增加伤口。接种到诱导培养基上,于26℃条件下全暗培养4天，再转移至光照强度为2500lx，光照时间15小时，培养温度为28℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽，不定芽诱导率可达89.1％。所述的诱导培养基为：ms基础培养基、3.0mg/l tdz、0.4mg/l 2,4-d、0.5mg/l iba、25g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8；
49.(2)继代培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照15小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养，20天转接一次，增殖系数为7.42。所述的增殖培养基为：ms基础培养基、2.0mg/l 6-ba、0.4mg/l naa、30g/l蔗糖、3.8g/l琼脂，ph为5.8；
50.(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养7天即开始生根，生根率可达100％。所述的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.3mg/l iba、1.8mg/l ggr(注：双吉尔-ggr，购自北京艾比蒂
研究开发中心)、20g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8。
51.(4)炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗4天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中并定植于大田中，移栽成活率为98％。
52.对照例1
53.与实施例1相比，除了诱导不定芽培养基、继代增殖培养基及生根培养基不同外，其余培养条件均与实施例1相同。
54.1.所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、0.2mg/l 2,4-d、0.1mg/l iba、25g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.5；与实施案例1相同的诱导培养天数下，不定芽诱导率仅为10％。
55.所述步骤2)继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.05mg/l naa、25g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.5；增殖系数为2.1。
56.所述步骤3)生根培养基为：1/2ms基础培养基、15g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.5。生根率为39.1％
57.对照例2
58.与实施例2相比，除了诱导不定芽培养基、继代增殖培养基及生根培养基不同外，其余培养条件均与实施例2相同。
59.1.所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、0.3mg/l 2,4-d、0.3mg/l iba、20g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.5；与实施案例2相同的培养天数下，对照组的不定芽诱导率为14.4％
60.所述步骤2)继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.2mg/l naa、30g/l蔗糖、5.5g/l琼脂，ph为5.8；增殖系数为2.71％
61.所述步骤3)生根培养基为：1/2ms基础培养基、18g/l蔗糖、4g/l琼脂，ph为5.8。生根率为35.1％。
62.对照例3
63.与实施例3相比，除了诱导不定芽培养基、继代增殖培养基及生根培养基不同外，其余培养条件均与实施例3相同。
64.1.所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、0.4mg/l 2,4-d、0.5mg/l iba、25g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8；与实施案例3相同的诱导天数下，对照组的诱导率仅为10.9％。
65.所述步骤2)继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.4mg/l naa、30g/l蔗糖、3.8g/l琼脂，ph为5.8；增殖系数为1.95
66.所述步骤3)生根培养基为：1/2ms基础培养基、20g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8。生根效率为45.5％。
67.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。