一种植物组织培养脱毒方法

1.本发明涉及无性繁殖为主要繁殖方式的作物的脱毒技术领域，特别是涉及一种植物组织培养脱毒方法。


背景技术：

2.目前关于植物组培脱毒，常用的方法有：
3.(1)直接取茎尖进行培养脱毒；通常需要取0.1-0.2mm茎尖，取材非常困难，而且小的茎尖成活率比较低，脱毒率也非常低；
4.(2)热处理+茎尖培养的方法；该方法需要先将组培苗在35-40℃条件下培养1-2个月，然后取0.5-1.5mm茎尖培养进行脱毒，该方法热处理时间长，具有费时间、费能量，成本较高的问题，而且在热处理时由于很多组培苗不耐热，植株死亡率比较高；
5.(3)化学疗法+茎尖培养脱毒；该方法通常在ms培养基中添加抗病毒药物-病毒唑，用以抑制病毒的复制，然后取0.5-1.5mm茎尖培养进行脱毒，由于病毒唑本身对多种植物具有毒害作用，使用的浓度过高会对植物产生药害，使用的浓度过低则会导致脱毒率较低。
6.此外，以上关于植物组培脱毒的方法仅仅用以脱毒，不能同时实现促生长、促生根和增殖的功能。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于，提出一种植物组培脱毒的方法，能够实现操作简单、脱毒率高、再生率高，并且具有促进植物生长、增殖、生根的优点。
8.为了达到上述目的，本发明提供了一种植物组培脱毒方法，包括以下步骤：
9.取感染病毒的植物外植体，将所述外植体置于含有云芝糖肽的继代培养基中进行继代培养，以得到组培苗；
10.切取所述组培苗茎尖，将所述茎尖置于未使用的继代培养基中进行再生培养，以得到再生植株；
11.取所述再生植株的叶片进行病毒检测获得脱毒苗。
12.可选的，将所述感染病毒的植物去掉其叶片，保留1cm的茎段作为所述外植体。
13.可选的，所述含有云芝糖肽的继代培养基包括：将所述云芝糖肽经纯净水溶解后用0.22微米细菌过滤器过滤，添加到继代培养基中。
14.可选的，所述云芝糖肽的浓度为50μg/ml-1500μg/ml。
15.可选的，所述继代培养基包括：ms、浓度为30g/l的蔗糖、浓度为7.5g/l 的琼脂、浓度为0.5mg/l的6-ba及浓度为0.1mg/l的iba，所述继代培养基的 ph为5.8。
16.可选的，所述继代培养的时间为40-50天。
17.可选的，所述切取所述组培苗茎尖包括：将所述组培苗置于显微镜下，分别切取不同长度的所述茎尖。
18.可选的，所述再生培养时间为1～3个月。
19.可选的，所述病毒检测包括取所述再生植株的叶片进行rt-pcr检测。
20.可选的，所述获得脱毒苗包括切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到未感染病毒的植物组培苗；
21.对所述未感染病毒的植物组培苗进行生根移栽。
22.与现有技术相比，本发明技术方案在ms培养基中加入一定浓度的云芝糖肽对植物进行组织培养后，再进行茎尖培养脱毒，不仅操作简单、脱毒率高、再生率高，还具有促进植物生长、增殖、生根的优点，具有较好的技术效果和应用前景。
附图说明
23.图1为本发明实施例一中两组实验组和一组对照组0-45天期间草莓长势对照图；
24.图2为本发明实施例一中两组实验组和一组对照组第45天草莓植株增殖情况对照图；
25.图3为本发明实施例一中两组实验组和一组对照组第45天草莓生根情况对照图；
26.图4为本发明实施例一中两组实验组病毒检测结果对照图；
27.图5为本发明实施例二中实验组和对照组第45天猕猴桃苗长势对照图；
28.图6为本发明实施例二中实验组病毒检测结果示意图。
具体实施方式
29.下面将结合示意图对本发明进行更详细的描述，其中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的本发明，而仍然实现本发明的有利效果。因此，下列描述应当被理解为对于本领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制。
30.在下列段落中参照附图以举例方式更具体地描述本发明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
31.请参考图1所示，本发明提供了一种植物组织培养脱毒方法，包括以下步骤：
32.s1、取感染病毒的植物外植体，将所述外植体置于含有云芝糖肽的继代培养基中进行继代培养，以得到组培苗；
33.s2、切取所述组培苗茎尖，将所述茎尖置于未使用的继代培养基中进行再生培养，以得到再生植株；
34.s3、取所述再生植株的叶片进行病毒检测获得脱毒苗。
35.具体的，在步骤s1中，取感染病毒的植物外植体包括：去掉感染病毒的植物组培苗的叶片，保留1cm的茎段作为外植体。
36.所述含有云芝糖肽的继代培养基为：将云芝糖肽经纯净水溶解后用0.22微米细菌过滤器过滤，添加到继代培养基中，继代培养基中云芝糖肽的浓度为 50-1500μg/ml。
37.所述继代培养基包括：ms、浓度为30g/l的蔗糖、浓度为7.5g/l的琼脂、浓度为0.5mg/l的6-ba及浓度为0.1mg/l的iba，所述继代培养基的ph为 5.8。
38.所述继代培养的时间为40-50天，优选的，继代培养45天以得到组培苗。
39.具体的，在步骤s2中，继代培养45天后在超净工作台中，利用显微镜分别取不同长
度茎尖放至ms培养基中进行培养，优选的，分别取0.5mm、1.0mm 和1.5mm茎尖进行再生培养。
40.所述再生培养时间为1～3个月，优选的，再生培养时间为2个月左右。
41.具体的，在步骤s3中，取适量叶片进行rt-pcr检测，切取未感染病毒的再生植株的茎段进行继代培养，以得到未感染病毒的植物组培苗，对所述未感染病毒的植物组培苗进行生根移栽，即获取脱毒苗。
42.本发明的方法可以应用于草莓、猕猴桃、苹果、葡萄、马铃薯、香蕉、中药材、花卉等主要通过组织培养等无性繁殖方式进行繁殖的作物的脱毒。
43.依据本发明的上述内容，设定实验组和对照组进行实验，进而研究云芝糖肽对植物株高、叶片数、增殖数、生根数、根长以及脱毒率的影响。
44.实施例一
45.分别将500μg/ml和1000μg/ml云芝糖肽加到ms培养基中，设定为两组实验组，具体的，培养基配方为：ms、30g/l蔗糖、7.5g/l琼脂、0.5mg/l6-ba、 0.1mg/liba，ph为5.8，云芝糖肽经纯净水溶解后用0.22微米细菌过滤器过滤，添加到上述培养基中，使其浓度为500或1000μg/ml。
46.将分别携带smyev和svbv的草莓组培苗去掉叶片，保留1cm的茎段，放入两组实验组的培养基中培养，相应的，对照组放入不添加云芝糖肽的培养基培养。
47.请参考图1-3，培养45天时间，每5-10天观察草莓苗长势，测量植株高度、叶片数量，第45天时统计植株增殖数和根系数量，测定根系长度等数据。
48.之后分别取0.5mm、1.0mm和1.5mm茎尖进行再生培养，生长2个月左右，提取rna，rt-pcr检测smyev和svbv的带毒情况，请参考图4，图4 为云芝糖肽处理后取茎尖再生草莓植株的病毒检测结果，有条带的为阳性，无条带的为阴性，500μg/ml云芝糖肽处理后分别取0.5mm(a),1.0mm(b)和 1.5mm(c)茎尖再生植株检测smyev的结果；
49.1000μg/ml云芝糖肽处理后分别取0.5mm(d),1.0mm(e)和1.5mm(f) shoot tips茎尖再生植株检测smyev的结果；
50.500μg/ml云芝糖肽处理后分别取0.5mm(g),1.0mm(h)和1.5mm(i)茎尖再生植株检测svbv的结果；
51.1000μg/ml云芝糖肽处理后分别取0.5mm(j),1.0mm(k)和1.5mm(l) 茎尖再生植株检测svbv的结果。
52.实验结果如下：
53.云芝糖肽处理后与对照相比明显提高了草莓的株高；云芝糖肽处理不同时间对草莓株高的影响结果见表1：
54.表1云芝糖肽(psp)处理对草莓株高的影响
[0055][0056][0057]
叶片再生数量的也明显增多，云芝糖肽处理对草莓叶片再生数量的影响结果见表2：
[0058]
表2云芝糖肽(psp)处理对草莓叶片再生数量的影响
[0059][0060]
云芝糖肽处理对草莓植株增殖数量的影响结果见表3：
[0061]
表3云芝糖肽(psp)处理对草莓植株增殖数量的影响
[0062][0063]
云芝糖肽处理对草莓生根数量和根系长度的影响结果见表4：
[0064]
表4云芝糖肽(psp)处理对草莓生根数量和根系长度的影响
[0065][0066][0067]
云芝糖肽对不同大小茎尖的再生成活率均有显著的促进作用，云芝糖肽 (psp)处理草莓后取不同大小茎尖再生的成活率见表5：
[0068]
表5云芝糖肽(psp)处理草莓后取不同大小茎尖再生的成活率
[0069][0070]
同时，云芝糖肽处理后smyev和svbv的脱除率介于60％-100％之间：
[0071]
表6云芝糖肽(psp)处理草莓后取不同大小茎尖再生植株的病毒脱除率
[0072][0073]
由上述实验结果可知，加入云芝糖肽的实验组中，草莓株高、叶片数、增殖数、生根数及根长与没有加云芝糖肽的对照组相比均具有显著优势，加入云芝糖肽的草莓株高更高、叶片数更多、增殖数更多、生根数更多及根长更长，并且取不同大小茎尖后smyev和svbv脱毒率介于60-100％之间，尤其是使用 1000μg/ml云芝糖肽处理后取0.5mm茎尖后smyev脱毒率达到100％。
[0074]
实施例二
[0075]
将500μg/ml云芝糖肽加到ms培养基中，设为实验组，具体的，培养基配方：ms、30g/l蔗糖、7.5g/l琼脂、0.5mg/l6-ba、0.1mg/l naa，ph为 5.8；将云芝糖肽经纯净水溶解后用0.22微米细菌过滤器过滤，添加到上述培养基中，使其终浓度为500μg/ml。
[0076]
将携带accrav的猕猴桃组培苗切成1cm的茎段，放入上述培养基中培养；相应的，对照组放入不添加云芝糖肽的培养基培养。
[0077]
请参考图5，培养45天时间，第45天观察猕猴桃苗长势，测量植株高度。
[0078]
之后分别取0.5mm、1.0mm和1.5mm茎尖进行再生培养，生长2个月左右，提取rna，rt-pcr检测accrav的带毒情况，请参考图6，图6为云芝糖肽处理后取茎尖再生猕猴桃植株的病毒检测结果，有条带的为阳性，无条带的为阴性；500μg/ml云芝糖肽处理后分别取0.5mm(a),1.0mm(b)和1.5mm (c)茎尖再生植株检测accrav的结果。
[0079]
实验结果如下，云芝糖肽处理对猕猴桃株高的影响见表7：
[0080]
表7云芝糖肽(psp)处理对猕猴桃株高的影响
[0081][0082]
并且，云芝糖肽处理后accrav的脱除率介于70％-100％之间：
[0083]
表8云芝糖肽(psp)处理猕猴桃后取不同大小茎尖再生植株的病毒脱除率
[0084][0085][0086]
由上述对比实验结果可知，加入云芝糖肽对猕猴桃组培苗有促进生长效果，云芝糖肽处理猕猴桃后取不同大小茎尖再生植株的病毒脱除率介于70％-100％之间，其中，取0.5mm茎尖时脱毒率为100％。
[0087]
本发明在ms培养基中加入一定浓度的云芝糖肽对植物进行组织培养后，再进行茎尖培养脱毒，不仅操作简单、脱毒率高、再生率高，还具有促进植物生长、增殖、生根的优点，具有较好的技术效果和应用前景。
[0088]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。