一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法

1.本发明涉及植物细胞培养技术领域，具体涉及一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法。


背景技术：

2.植物胚性悬浮细胞系是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养的胚性细胞系，有细胞形状及细胞团大小均一，细胞分散性好，细胞生长增殖迅速等特点，可直接用于原生质体的分离、培养、杂交、基因转移和次生代谢物的生产等，是作为遗传转化的良好材料。胚性细胞悬浮系的建立受植物品种、外植体、愈伤组织、培养基及环境因素等多种因素的影响，且植物细胞更易团聚，对剪切力更敏感，种种因素制约着植物胚性悬浮细胞系的建立。目前国内外已有多种植物建立了较为完善的悬浮细胞系，并直接使用悬浮细胞作为材料进行遗传转化操作、进行原生质体培养和体细胞杂交等研究，但在菠萝生物育种方面，鲜少见悬浮细胞相关的研究与应用。
3.菠萝是我国重要的热带水果，主要的选育种方式有杂交育种、芽变选种、诱变育种以及基因工程育种。传统杂交育种、芽变选种耗时耗力、工作量大，育种效率较低，诱变育种和基因工程育种多使用菠萝愈伤组织为转化材料，但因愈伤组织是细胞团和分化后的胚状体的混合物，转化后代容易存在大量的嵌合体现象，难以进行分离选择，常在转基因后代的培养过程中，目标性状逐渐丢失，最后导致育种失败。若能以单细胞即胚性悬浮细胞系为转化对象，则能有效避免嵌合体现象产生，大幅提升菠萝生物育种的成功率和效率。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，以弥补技术空白。
5.本发明方案包括以下主要内容：
6.一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，包括以下步骤：
7.(1)取外植体采用愈伤组织培养基进行培养，挑选生长旺盛、松脆易碎的颗粒状愈伤组织作为悬浮细胞培养的材料，避免选择出现褐化、发白现象以及水样化的愈伤组织；
8.(2)将颗粒状愈伤组织放入容器中夹碎，向容器中加入悬浮细胞培养基，在摇床上进行恒温振荡培养；
9.(3)将培养后的悬浮培养物中的大颗粒愈伤组织筛除，静置，待细小颗粒培养物沉淀后吸去上层液体培养基，再加入新鲜的悬浮细胞培养基，在摇床上进行恒温振荡培养；
10.(4)筛除大颗粒愈伤组织，重复步骤(3)的操作，在恒温摇床上进行恒温振荡培养；
11.(5)对悬浮培养物进行继代，同时定期取培养物进行显微观察，直至观察到的悬浮细胞呈大小均一的圆形或者椭圆形，为单细胞和小细胞团组成，无其他不规则形状的细胞和大细胞团，即完成菠萝胚性细胞悬浮系的建立。
12.优选的，步骤(1)中挑选的愈伤组织为以冠芽、裔芽、吸芽或块茎芽为外植体诱导5
周至6周的愈伤组织。其中，以吸芽为外植体时，细胞增殖速度最快。
13.优选的，步骤(1)中使用的愈伤组织培养基为：ms培养基中添加13μm/l 6-ba、1μm/lnaa和7g/l琼脂，ph＝5.8；愈伤组织培养条件为恒温28℃，暗培养。研究表明，在ms培养基中添加13μm/l 6-ba、1μm/l naa后愈伤组织的诱导率显著提高，褐化率显著降低。且愈伤组织生长旺盛、松脆易碎，使用基于该愈伤组织建立的菠萝胚性细胞悬浮系具有生长速度快、均一性好等特点。
14.优选的，步骤(2)中所述悬浮细胞培养基含有：氯化铵500～600mg/l、硝酸钾2000～3000mg/l、氯化钙400～500mg/l、七水硫酸镁300～400mg/l、磷酸二氢钾150～200mg/l、碘化钾0.5～1.0mg/l、硼酸6～7mg/l、硫酸锰22～26mg/l、硫酸锌1.5～2.0mg/l、钼酸钠0.2～0.3mg/l、硫酸铜0.02～0.03mg/l、氯化钴0.02～0.03mg/l、乙二胺四乙酸二钠35～40mg/l、硫酸亚铁25～30mg/l、谷氨酰胺1000～1200mg/l、干酪素水解物(即酶水解干酪素，经胰酶水解精制而成，市售产品)500～600mg/l、精氨酸100～150mg/l、甘氨酸1～3mg/l、盐酸硫胺素0.3～0.6mg/l、盐酸吡哆醇0.5～0.7mg/l、烟酸0.5～0.7mg/l、肌醇100～120mg/l、蔗糖1～10g/l、毒莠定9～10mg/l、脱落酸0.05～0.07mg/l、活性炭2000～3000mg/l、2-吗啉乙磺酸300～400mg/l，ph＝5.6～6.2。在上述范围内，均可取得与实施例1相似的结果。
15.更优选的，步骤(2)中所述悬浮细胞培养基为：以水为溶剂，含氯化铵535mg/l、硝酸钾2528mg/l、氯化钙440mg/l、七水硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌1.72mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、谷氨酰胺1000mg/l、干酪素水解物500mg/l、精氨酸120mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.4mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、蔗糖5000mg/l、毒莠定9.9mg/l、脱落酸0.053mg/l、活性炭2000mg/l、2-吗啉乙磺酸300mg/l，ph＝5.8。
16.优选的，步骤(2)中悬浮细胞的培养条件为：恒温28～30℃，转速80～100rpm，暗培养，培养时间为7～8d。
17.优选的，步骤(3)为：将培养7d后的悬浮培养物中的大颗粒愈伤组织用30目网筛筛除，静置，待细小颗粒培养物沉淀后吸去上层液体培养基，再加入新鲜的悬浮细胞培养基，在摇床上进行恒温振荡培养。
18.优选的，步骤(4)中，用50目网筛筛除大颗粒愈伤组织。
19.优选的，所述菠萝的品种包括台农17、金钻、甜蜜蜜或金菠萝。
20.优选的，本发明步骤(5)中所述的显微观察可直接吸取细胞悬液于显微镜观察专用培养皿中进行观察。也可将细胞悬液与1％三氧化铬(cro3)溶液1:1混合，在70℃下水浴15分钟，置于显微镜观察专用培养皿中进行染色观察。
21.本发明所取得的有益效果：
22.本发明所述方法建立的菠萝胚性细胞悬浮系具备以下特征：
①
悬浮细胞分散性、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，在显微镜下观察为体积和形状大致相同的细胞或小细胞团；悬浮细胞生长速度快，一般2～3d甚至更短时间细胞的量便可增加1倍。得到的胚性细胞悬浮系生长稳定，细胞活力好，细胞增殖速度快。
23.本发明所得胚性悬浮细胞系可直接用于原生质体分离、培养与杂交、基因转移和
生产次生代谢物等，可在短期内在细胞水平筛选出预期突变体，能大幅提高生物育种的效率。且本发明的制备方法步骤简单，无需繁琐的设备。
附图说明
24.图1为实施例中分散的圆形或椭圆形胚性细胞
具体实施方式
25.为了便于技术人员理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
26.实施例1从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法
27.1)以菠萝优良品种台农17的冠芽茎段为外植体，采用愈伤组织培养基培养5周，获得大量愈伤组织，挑选同批次中生长旺盛、松脆易碎的颗粒状愈伤组织作为悬浮细胞培养的材料，避免选择出现褐化、发白现象以及水样化的愈伤组织。
28.愈伤组织培养基为：ms培养基+13μm/l 6-ba(6-苄氨基嘌呤)+1μm/l naa(萘乙酸)+7g/l琼脂，ph＝5.8。培养条件为恒温28℃，暗培养。
29.2)将愈伤组织(约1g)放入200ml三角瓶中，用镊子轻轻夹碎，使用移液管吸取50ml悬浮细胞培养基加入三角瓶中，同时用移液管尖端压碎三角瓶中较大的愈伤组织块，用纱布包裹的棉花塞住三角瓶瓶口，再依次用封瓶膜、锡纸包裹瓶口。放置于恒温28℃，转速80rpm的摇床上进行暗培养7d。
30.其中悬浮细胞培养基以水为溶剂，含氯化铵535mg/l、硝酸钾2528mg/l、氯化钙440mg/l、七水硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、碘化钾0.83mg/l，硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌1.72mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、谷氨酰胺1000mg/l、干酪素水解物500mg/l、精氨酸120mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.4mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、蔗糖5000mg/l、毒莠定9.9mg/l、脱落酸0.053mg/l、活性炭2000mg/l、2-吗啉乙磺酸300mg/l，ph＝5.8。
31.3)将培养7d后的悬浮培养物用30目(孔径600μm)不锈钢网筛筛除大颗粒愈伤组织，静置待细小颗粒培养物沉淀后吸去上层液体培养基，再补充加入新鲜的悬浮细胞培养基，在恒温28℃，转速80rpm的摇床上进行暗培养7d。
32.4)将悬浮培养物用50目(孔径280μm)不锈钢网筛筛除大颗粒愈伤组织，静置待细小颗粒培养物沉淀后吸去上层液体培养基，再加入新鲜的悬浮细胞培养基，在恒温28℃，转速80rpm的摇床上进行暗培养7d。
33.5)将悬浮培养物静置，待细小颗粒培养物沉淀后吸去上层液体培养基，再加入新鲜培养基进行继代培养。每培养7d进行一次继代。
34.6)每次继代时吸取3～5ml培养物进行显微观察，在继代二次后(培养28d)观察到培养物中已有部分分散的圆形或椭圆形细胞，但仍有很多不规则形状细胞和较大的细胞团。
35.7)当继代五至七次时(培养49d～63d)可观察到培养物中大部分为大小均一的圆形或椭圆形单个细胞或2～30个细胞的小细胞团。
36.结果见图1。结果显示，本发明建立的菠萝胚性细胞悬浮系具备以下特征：
37.①
悬浮细胞分散性、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，在显微镜下观察为体积和形状大致相同的细胞或小细胞团；
38.②
悬浮细胞生长速度快，2～3d细胞的量便可增加1倍。
39.实施例2
40.本实施例中，分别以台农17品种菠萝裔芽、吸芽和块茎芽为外植体进行培养获得愈伤组织。其他步骤与实施例1相同。
41.结果显示，当继代五至七次时(培养49d～63d)均可观察到培养物中大部分为大小均一的圆形或椭圆形单个细胞或2～30个细胞的小细胞团，形成的胚性细胞悬浮系生长稳定，细胞活力好，细胞增殖速度较快。其中细胞增殖速度吸芽＞裔芽＞块茎芽。
42.实施例3
43.本实施例中，使用的愈伤组织为金钻、甜蜜蜜和金菠萝品种菠萝冠芽茎段为外植体进行培养获得的愈伤组织。其他步骤与实施例1相同。
44.结果显示，培养过程中品种间没有显著差异，均能形成生长稳定，细胞活力好，细胞增殖速度快的胚性细胞悬浮系。
45.对比例1
46.本例中，使用的悬浮细胞培养基配方为ms培养基+13μm/l 6-ba(6-苄氨基嘌呤)+1μm/l naa(萘乙酸)，ph＝5.8。其他步骤与实施例1相同。
47.结果显示：
48.1)在继代一次时(培养21d)可观察到培养物中有部分分散的细胞，多为不规则形状细胞和较大的细胞团。
49.2)在继代二次时(培养28d)可观察到培养物中有较多分散的细胞，多为不规则形状细胞和较大的细胞团。
50.3)在继代三次时(培养35d)培养液中细胞出现明显褐化现象，且细胞数量已无明显增多。
51.对比例2
52.本例中，使用的悬浮细胞培养基中蔗糖浓度分别为1g/l、10g/l、20g/l、30g/l。其他步骤与实施例1相同。
53.结果显示：
54.1)在继代一次后(培养21d)可观察到不同蔗糖浓度培养基中均有部分分散的悬浮细胞，其中1g/l蔗糖浓度的培养基中细胞数量最少，其次是30g/l蔗糖浓度培养基，10g/l、20g/l蔗糖浓度中细胞数量与实施例1无明显差异。
55.2)在继代二次时(培养28d)，1g/l蔗糖浓度的培养基中细胞数量与继代一次时相比无明显增多，10g/l、20g/l、30g/l蔗糖浓度培养基中细胞数量均有所增加，但增加量均少于实施例1。
56.3)在继代五次时(培养49d)，1g/l蔗糖浓度的培养基中细胞数量因继代时更换新鲜培养基而不断减少，20g/l、30g/l蔗糖浓度的培养基中细胞数量也有所减少，且液体培养基内出现许多漂浮的杂质和细胞碎片。
57.4)在继代七次时(培养63d)，只有10g/l蔗糖浓度的培养基与实施例1中的细胞数
量仍在增加，但增加量仍少于实施例1。
58.对比例3
59.本例中，使用的悬浮细胞培养基中，脱落酸的浓度分别为0mg/l、0.1mg/l。其他步骤与实施例1相同。
60.结果显示：
61.1)在继代一次后(培养21d)，不同脱落酸浓度培养基中均有部分分散的悬浮细胞，其中0mg/l脱落酸浓度培养基中多为不规则形状细胞和较大的细胞团，0.1mg/l脱落酸浓度的培养基中细胞数量明显较少。
62.2)在继代二次时(培养28d)，均可观察到有较多分散的细胞，多为不规则形状细胞和较大的细胞团。
63.3)在继代三次时(培养35d)，培养液中细胞出现明显褐化现象，且细胞数量已无明显增多。
64.以上所述仅为本发明的部分较佳实施例，并不用以限制本发明，本发明的保护范围并不限于上述内容。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。