技术特征：
1.一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取外植体，采用愈伤组织培养基进行培养，挑选生长旺盛、松脆易碎的颗粒状愈伤组织作为悬浮细胞培养的材料，避免选择出现褐化、发白现象以及水样化的愈伤组织；(2)将颗粒状愈伤组织放入容器中夹碎，向容器中加入悬浮细胞培养基，在摇床上进行恒温振荡培养；(3)将培养后的悬浮培养物中的大颗粒愈伤组织筛除，静置，待细小颗粒培养物沉淀后吸去上层液体培养基，再加入新鲜的悬浮细胞培养基，在摇床上进行恒温振荡培养；(4)筛除大颗粒愈伤组织，重复步骤(3)的操作，在恒温摇床上进行恒温振荡培养；(5)对悬浮培养物进行继代，同时定期取培养物进行显微观察，直至观察到的悬浮细胞呈大小均一的圆形或者椭圆形，为单细胞和小细胞团组成，无其他不规则形状的细胞和大细胞团，即完成菠萝胚性细胞悬浮系的建立。2.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(1)中挑选的愈伤组织为以冠芽、裔芽、吸芽或块茎芽为外植体诱导5周至6周的愈伤组织。3.根据权利要求2所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，所述外植体为吸芽。4.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(1)中使用的愈伤组织培养基为：ms培养基中添加13μm/l 6-ba、1μm/l naa和7g/l琼脂，ph＝5.8；愈伤组织培养条件为恒温28℃，暗培养。5.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(2)中所述悬浮细胞培养基含有：氯化铵500～600mg/l、硝酸钾2000～3000mg/l、氯化钙400～500mg/l、七水硫酸镁300～400mg/l、磷酸二氢钾150～200mg/l、碘化钾0.5～1.0mg/l、硼酸6～7mg/l、硫酸锰22～26mg/l、硫酸锌1.5～2.0mg/l、钼酸钠0.2～0.3mg/l、硫酸铜0.02～0.03mg/l、氯化钴0.02～0.03mg/l、乙二胺四乙酸二钠35～40mg/l、硫酸亚铁25～30mg/l、谷氨酰胺1000～1200mg/l、干酪素水解物500～600mg/l、精氨酸100～150mg/l、甘氨酸1～3mg/l、盐酸硫胺素0.3～0.6mg/l、盐酸吡哆醇0.5～0.7mg/l、烟酸0.5～0.7mg/l、肌醇100～120mg/l、蔗糖1～10g/l、毒莠定9～10mg/l、脱落酸0.05～0.07mg/l、活性炭2000～3000mg/l、2-吗啉乙磺酸300～400mg/l，ph＝5.6～6.2。6.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(2)中所述悬浮细胞培养基为：以水为溶剂，含氯化铵535mg/l、硝酸钾2528mg/l、氯化钙440mg/l、七水硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌1.72mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、谷氨酰胺1000mg/l、干酪素水解物500mg/l、精氨酸120mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.4mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、蔗糖5000mg/l、毒莠定9.9mg/l、脱落酸0.053mg/l、活性炭2000mg/l、2-吗啉乙磺酸300mg/l，ph＝5.8。7.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(2)中悬浮细胞的培养条件为：恒温28～30℃，转速80～100rpm，暗培养，培养时间为7～8d。
8.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(3)为：将培养7d后的悬浮培养物中的大颗粒愈伤组织用30目网筛筛除，静置，待细小颗粒培养物沉淀后吸去上层液体培养基，再加入新鲜的悬浮细胞培养基，在摇床上进行恒温振荡培养。9.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，步骤(4)中，用50目网筛筛除大颗粒愈伤组织。10.根据权利要求1所述的从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法，其特征在于，所述菠萝的品种包括台农17、金钻、甜蜜蜜或金菠萝。
技术总结
本申请公开了一种从菠萝愈伤组织建立菠萝胚性细胞悬浮系的方法。筛选生长旺盛、松脆易碎的颗粒状愈伤组织通过液体培养基悬浮培养，经过持续继代同时筛除大颗粒愈伤组织以建立菠萝胚性悬浮细胞系。所述菠萝胚性细胞悬浮系中，细胞形状及细胞团大小均一，细胞分散性好，细胞生长增殖迅速，可直接用于原生质体的分离、培养、杂交、基因转移和次生代谢物的生产等，作为遗传转化材料能有效避免嵌合体现象产生，大幅提升菠萝生物育种的成功率和效率。大幅提升菠萝生物育种的成功率和效率。大幅提升菠萝生物育种的成功率和效率。
技术研发人员：王悠 常胜合 舒海燕 李科明 詹儒林
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院海口实验站
技术研发日：2022.11.16
技术公布日：2023/1/30