一种椰子组织培养快繁的方法

本发明涉及植物组织培养，特别是涉及一种椰子组织培养快繁的方法。

背景技术：

1、椰子是世界上最重要的棕榈科植物之一，是一种高经济价值的多年生单子叶乔木。作为一种热带油料作物和食品原料，椰子在全球93个国家和地区均有分布。目前椰子种植业面临严重的威胁，如种苗种果短缺等。作为最难以在体外繁殖的植物之一，传统营养繁殖手段，如扦插、压条、嫁接等很难用于椰子的培育繁殖。但是利用组织培养技术，通过多种外植体诱导能够大批量获得椰子的再生苗。目前澳大利亚昆士兰大学等研究机构已经开发出通过合子胚进行组织培养的技术，但还未在世界范围内广泛普及。因此，开发更高效率的椰子组培技术，尤其是探索通过体胚发生途径生产大量优良品种椰子苗的技术是极为重要的。为此，本发明提供一种椰子组织培养快繁的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种椰子组织培养快繁的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的组培快繁方法显著提高椰子胚外植体的愈伤组织诱导率、球形体细胞胚出胚率、组培苗出苗率和移栽成活率，并显著缩短培养周期，为椰子转基因及遗传转化体系建立了基础。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种椰子组织培养快繁的方法，包括以下步骤：

4、（1）外植体预培养：将椰子胚芽外植体置于预培养培养基中培养至新生胚芽出现；

5、其中，每升所述预培养培养基由y3培养基大量营养素10-12ml、y3培养基微量营养素10-15ml、mw培养基维生素1-1.5ml、植物组培铁盐1-1.5 ml、6-ba 5-8 μmol、gelzan冷结胶3-3.5 g、蔗糖30-50g及活性炭2.5-3 g组成；

6、（2）愈伤诱导培养：将步骤（1）收获的新生胚芽置于愈伤诱导培养基培养至形成愈伤组织和新生胚芽；

7、其中，每升所述愈伤诱导培养基由y3培养基大量营养素10-15ml、y3培养基微量营养素10-11ml、mw培养基维生素1-1.2ml、植物组培铁盐0.8-1 ml、6-ba 5-10 μmol、蔗糖40-50 g、gelzan冷结胶3-3.5 g、活性炭2.5-3 g及2，4-d 300-400 μmol组成；

8、（3）体胚诱导培养：将步骤（2）收获的愈伤组织和新生胚芽接种于体胚诱导培养基进行继代培养，直至形成球形体细胞胚和发芽胚，之后光照处理，形成组培苗；

9、其中，每升所述体胚诱导培养基由y3培养基大量营养素8-10ml、y3培养基微量营养素7-10ml、mw培养基维生素0.8-1ml、植物组培铁盐1-1.2 ml、蔗糖30-50 g、gelzan冷结胶3-3.5 g、活性炭2.5 g、2，4-d 5-10 μmol及6-ba 200-400 μmol组成；

10、（4）组培苗的炼苗移栽：对组培苗进行降糖、光照、二氧化碳处理，之后移入移栽基质中培养。

11、进一步地，在步骤（1）中，所述椰子胚芽外植体的提取方法为：先从椰子果实中提取含有胚的胚乳块，之后从胚乳块中取出大小为0.5mm的胚芽，将其进行消毒处理后即可。

12、进一步地，所述y3培养基大量营养素包括kcl 15000mg/l、kno320000mg/l、nh4cl5400mg/l、nah2po4·2h2o 3000mg/l、cacl2·2h2o 3000mg/l和mgso4·7h2o 2500mg/l；所述y3培养基微量营养素包括mnso4·4h2o 115mg/l、ki 84mg/l、znso4·7h2o 73mg/l、h3bo332mg/l、cuso4·5h2o 2.6mg/l、cocl2·6h2o 2.5mg/l、namoo4·2h2o 2.5mg/l和nicl·6h2o 0.25mg/l；所述mw培养基维生素包括维生素b6 0.50mg/l、维生素b1 0.50mg/l、维生素b3 0.50mg/l、维生素b5 0.50mg/l、维生素h 0.50mg/l、维生素b12 0.50mg/l和甘氨酸0.1mg/l；所述植物组培铁盐包括fe2so4·7h2o 420mg/l和na2edta 560.0mg/l。

13、进一步地，在步骤（1）中，所述培养具体为暗培养7-21d，培养温度为25-29℃。

14、进一步地，在步骤（3）中，所述继代培养期间，将接种于体胚诱导培养基的愈伤组织和新生胚芽置于顶部用透气膜封闭的培养容器中，并进行氧气处理，氧气浓度为30-70%。

15、进一步地，所述光照处理的时间为14-16h/d，光照强度为25-50μmol·m-2·s-1。

16、进一步地，在步骤（4）中，所述降糖、光照、二氧化碳处理具体为：将组培苗接种于y3含糖液体培养基继代培养，调整co2浓度为750-1500 μmol·mol-1，进行12-16h/d光照处理；所述继代培养的次数为2-3次。

17、进一步地，所述y3含糖液体培养基为y3基础培养基+80-150 μm naa+30-50 g/l蔗糖；所述降糖处理为：组培苗在含糖量为30-50g/l的培养基中进行第一次继代培养，后续继代培养所用培养基逐步降糖至0g/l。

18、进一步地，所述光照处理采用led红色光和蓝色光处理，光照强度为50 μmol·m-2·s-1；其中所述led红色光和蓝色光的光照强度比值为（1-3）：（1-2）。

19、进一步地，在步骤（4）中，所述移栽基质为生物活性炭和泥炭土以（1-2）：1质量比复配的混合基质。

20、本发明公开了以下技术效果：

21、本发明优化了椰子胚芽组织快繁过程中所使用的培养基，采用y3、mw基本培养基的部分成分以及植物组培铁盐组合成基础培养基，并补入生长调节剂及其他附加成分，优选出以y3、mw培养基部分成分和铁盐组合的培养基为基础的椰子胚预培养培养基、愈伤诱导培养基和体胚诱导培养基，并结合外植体表面消毒、愈伤组织诱导、体胚萌发，组培小苗大量增殖、大苗生根炼苗等过程建立了椰子组织培养快速繁殖体系，该组培方法显著提高椰子胚芽外植体的愈伤组织诱导率、球形体细胞胚出胚率、组培苗出苗率和移栽成活率，并显著缩短培养周期，为椰子转基因及遗传转化体系建立了基础，具有向椰子产业提供大量具有优质形状组培苗的能力。

技术特征：

1.一种椰子组织培养快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述椰子胚芽外植体的提取方法为：先从椰子果实中提取含有胚的胚乳块，之后从胚乳块中取出大小为0.5mm的胚芽，将其进行消毒处理后即可。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述y3培养基大量营养素包括kcl15000mg/l、kno3 20000mg/l、nh4cl 5400mg/l、nah2po4·2h2o 3000mg/l、cacl2·2h2o3000mg/l和mgso4·7h2o 2500mg/l；

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述培养具体为暗培养7-21d，培养温度为25-29℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述继代培养期间，将接种于体胚诱导培养基的愈伤组织和新生胚芽置于顶部用透气膜封闭的培养容器中，并进行氧气处理，氧气浓度为30-70%。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述光照处理的时间为14-16h/d，光照强度为25-50μmol·m-2·s-1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述降糖、光照、二氧化碳处理具体为：将组培苗接种于y3含糖液体培养基继代培养，调整co2浓度为750-1500 μmol·mol-1，进行12-16h/d光照处理；所述继代培养的次数为2-3次。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述y3含糖液体培养基为y3基础培养基+80-150 μm naa+30-50 g/l蔗糖；所述降糖处理为：组培苗在含糖量为30-50g/l的培养基中进行第一次继代培养，后续继代培养所用培养基逐步降糖至0g/l。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述光照处理采用led红色光和蓝色光处理，光照强度为50 μmol·m-2·s-1；其中所述led红色光和蓝色光的光照强度比值为（1-3）：（1-2）。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述移栽基质为生物活性炭和泥炭土以（1-2）：1质量比复配的混合基质。

技术总结
本发明公开了一种椰子组织培养快繁的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括外植体预培养、愈伤诱导培养、体胚诱导培养和组培苗的炼苗移栽步骤。本发明采用Y3、MW基本培养基的部分成分和铁盐组合成基础培养基，并补入生长调节剂及其他附加成分，优选出以Y3、MW部分成分及铁盐组合的培养基为基础的椰子胚芽预培养培养基、愈伤诱导培养基和体胚诱导培养基，并结合外植体表面消毒、愈伤组织诱导、体胚萌发，组培小苗大量增殖、大苗生根炼苗等过程建立了椰子组培快繁体系，可显著提高愈伤组织诱导率、出胚率、出苗率和成活率，并显著缩短培养周期，为椰子转基因及遗传转化体系建立了基础。

技术研发人员：穆治华,罗杰,肖勇,杨壮,夏薇,刘贤青,徐航,周骏杰,徐冉,李娇龙,李凤梅
受保护的技术使用者：海南大学三亚南繁研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13