一种原位肺结节小鼠模型构建方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种原位肺结节小鼠模型的构建方法。

背景技术：

1、肺结节定义为通过常规胸部ct平扫或低剂量胸部ct筛查，发现的肺内直径小于3cm的类圆形、局灶性、密度增高的实性或亚实性肺部异常影。目前除了早期外科手术治疗，尚无针对肺结节的药物治疗方法，定期的ct随访不可避免会带来辐射暴露，同时临床上采用的有创肺结节穿刺活检的方法，也会带来一些不必要的术后并发症。在近期一些研究中发现有一部分以惰性生物学为表现的恶性肺结节，具有影像学缓慢进展的特点，尤其在一类以磨玻璃为影像学表现的肺结节中较为常见，给临床肺结节影像学鉴别诊断添加了难度。

2、近期，通过大规模回顾性临床样本的对比研究发现，在恶性肺结节中存在一组促癌基因的表达上调，同时合并另一组抑癌基因的表达下调。前者包括kras基因，后者包括p53、tgfbr2等基因。目前国际上通过气道滴注带有识别特定基因序列剪切酶活性的腺病毒(adcre)的方法，可以实现位于特定部位的呼吸道上皮细胞基因编辑功能，例如由tylorjacks构建的krasg12dp53-/-(kp)恶性肺癌小鼠模型。

3、综上，在开发适合的小鼠模型用于对良性肺结节和恶性肺结节的早期鉴别诊断，探索良恶性肺结节转化的分子机制，并针对特定靶点筛选有效的治疗手段，对肺结节患者的预后具有重要的意义。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种基于基因工程技术的原位肺结节小鼠模型构建方法，构建获得的小鼠模型可用于肺结节良恶性转化的发病机制研究及新药筛选。

2、具体地，本发明第一方面提供了原位肺结节小鼠模型构建方法，包括如下步骤：1)将loxp-stop-loxp krasg12d转基因小鼠与loxp-tgfbr2-loxp转基因小鼠杂交；2)对由步骤1)获得的f0杂交小鼠或其后代进行气道滴注带有识别特定基因序列剪切酶活性的腺病毒(adcre)。

3、在某些实施方式中，所述腺病毒(adcre)的使用浓度为106-108pfu；更优选地，所述所述腺病毒(adcre)的使用浓度为107-5×107pfu。

4、在某些实施方式中，所述腺病毒(adcre)的使用浓度为2.5×107pfu。

5、在某些实施方式中，所述步骤1)前采用seq id no：1-2或seq id no：3-4的引物验证loxp-stop-loxp krasg12d转基因小鼠。

6、在某些实施方式中，所述步骤1)前采用seq id no：5-8的引物验证loxp-tgfbr2-loxp转基因小鼠。

7、在某些实施方式中，所述步骤2)后采用seq id no：9-12验证造模小鼠的loxp-stop-loxp krasg12d位点的突变；

8、在某些实施方式中，所述步骤2)后使用引物seq id no：13-14验证验证造模小鼠的loxp-tgfbr2-loxp位点的缺失。

9、本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述的方法获得的小鼠模型在原位肺结节疾病发病机制研究中的应用。

10、本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述的小鼠模型在原位肺结节新药筛选中的应用。

11、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

12、1)本发明通过气道低剂量滴注腺病毒诱导小鼠原位肺上皮细胞发生基因突变，形成原位体细胞癌变，建立了首个原位肺结节动物模型。与kp模型以及高剂量(109pfu)krasg12d突变联合tgfbr2缺失的肺结节小鼠krasg12dtgfbr2-/-(kt)模型相比，低剂量(2.5*107pfu)kt模型具有病灶进展更缓慢的特点，为观察肺结节由良性阶段转变为恶性阶段的过程，尤其是早期肺结节所处微环境中病理生理的改变，提供了良好的观察时间窗。

13、2)本发明的小鼠原位肺结节的生长模式与人肺结节的生物行为学高度拟合。

14、3)与裸鼠异体肿瘤模型相比，完整保留小鼠正常免疫功能，更适合研究原位肺腺癌肿瘤微环境的发病机制。

15、4)为研发原位肺结节疾病发病机制及新药筛选提供理想的动物模型，弥补此类动物模型的空白。

技术特征：

1.一种原位肺结节小鼠模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将loxp-stop-loxp krasg12d转基因小鼠与loxp-tgfbr2-loxp转基因小鼠杂交；2)对由步骤1)获得的f0杂交小鼠或其后代进行气道滴注带有识别特定基因序列剪切酶活性的腺病毒(adcre)。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述腺病毒(adcre)的使用浓度低于109pfu；优选地，所述所述腺病毒(adcre)的使用浓度为106-108pfu；更优选地，所述所述腺病毒(adcre)的使用浓度为107-5×107pfu。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述腺病毒(adcre)的使用浓度为2.5×107pfu。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)前采用seq id no：1-2或seqid no：3-4的引物验证loxp-stop-loxp krasg12d转基因小鼠。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)前采用seq id no：5-8的引物验证loxp-tgfbr2-loxp转基因小鼠。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)后采用seq id no：9-12验证造模小鼠的loxp-stop-loxp krasg12d位点的突变。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)后使用引物seq id no：13-14验证验证造模小鼠的loxp-tgfbr2-loxp位点的缺失。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法获得的小鼠模型在原位肺结节疾病发病机制研究中的应用。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法获得的小鼠模型在原位肺结节新药筛选中的应用。

技术总结
本发明公开了一种原位肺结节小鼠模型构建方法，包括如下步骤：1)将loxp‑stop‑loxp KrasG12D转基因小鼠与loxp‑Tgfbr2‑loxp转基因小鼠杂交；2)对由步骤1)获得的F0杂交小鼠或其后代进行气道滴注带有识别特定基因序列剪切酶活性的低剂量的腺病毒(AdCre)。本发明还公开了构建获得的原位肺结节小鼠模型在原位肺结节疾病发病机制研究、原位肺结节新药筛选中的应用。

技术研发人员：杨达伟,谢林杉,宋元林,白春学,王向东,孙梦婷,尹俊,向萌,周建
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15