本发明涉及动物模型构建，具体涉及一种父源性骨关节炎的动物模型构建方法、干预靶标及其应用。
背景技术：
：：1、骨关节炎是一种好发于老年人的慢性退行性关节疾病，主要以关节软骨退变、骨赘形成、软骨下骨硬化和滑膜炎症为特点[1]。骨关节炎也是引起老年人关节疼痛、慢性致残的首要原因，其患病率随年龄递增，65岁以上人群甚至已高达50％[2,3]。伊朗学者safiri及其同事通过分析2017年全球疾病负担研究中关于1990年到2017年全球多个国家和地区的骨关节炎负担，发现2017年骨关节炎的年发病率比1990年增加了8.2％[4]。因此，当前迫切需要明了驱动骨关节炎发生的病理生理机制，以便实现早期预防及诊断，从而筛选出更优的个体化治疗手段。传统观点认为，骨关节炎属于老年退行性疾病，主要由机械及年龄相关因素引起的关节软骨退变所致。然而，多项大样本流行病学调查显示，低出生体重患儿成年后，手、膝和髋等关节部位的骨关节炎发生率显著增加[5-8]。其中，澳大利亚学者hussain等2015年对3604名年龄大于40岁且诊断为髋、膝骨关节炎的病例进行了临床回顾性调查发现，低出生体重者患髋关节骨关节炎的风险是正常体重者的2.04倍[7]。该学者2018年的另一项研究证实，低出生体重与成年髋关节骨关节炎之间存在明确的因果关系[8]。提示，低出生体重与成年骨关节炎的发生关系密切。本室前期系列研究已证实，孕期母体咖啡因暴露所致的低出生体重子代出现关节软骨发育不良及成年后骨关节炎易感[9]。然而，父体不良环境对子代关节软骨发育及其远期骨关节炎易感的危害尚不清楚。2、软骨形成是胚胎发育和脊椎动物骨骼修复中高度协调的事件[10-12]。在胚胎软骨形成过程中，间充质干细胞凝集分化为前软骨细胞团，并进一步形成由早期软骨细胞组成的软骨原基。随后，软骨原基中的软骨细胞增殖，并分泌大量的细胞外基质成分来促进软骨发育[13]。关节软骨是一种无神经、血管以及淋巴管的结缔组织，其退行性改变参与了骨关节炎的发生。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其在维持关节软骨稳态中扮演重要的角色。本发明前期的系列研究显示，母体孕期暴露于不良环境因素可以致子代关节软骨发育抑制并延续到出生后[14,15]。提示，软骨发育异常与骨关节炎的发生紧密相关。3、众多的研究表明，表观遗传学是不良环境因素对疾病影响的一个重要机制，其可以从父母传给子代，并引起子代表型的改变[16-19]。dna甲基化是一种主要的表观遗传修饰，其参与了生物体内的多种调控过程，包括基因表达的调控、基因组印记和x染色体失活等[20,21]。dna甲基化对环境因素特别敏感，由不良环境因素引起的dna甲基化改变会导致子代发育缺陷，并引起多种与发育缺陷相关的疾病[22-25]。研究表明，在世代间的表观遗传传递过程中，精子dna甲基化组要比卵母细胞dna甲基化组更重要[16,18,26]。如斑马鱼的精子dna甲基化组在斑马鱼早期胚胎发生过程中遗传和维持，并可促进胚胎发生[27]；营养缺乏可改变父体精子dna甲基化组，并有助于代谢性疾病在子代中的遗传[18]。在本研究中，本发明发现，父体孕前咖啡因暴露(paternal pre-pregnant caffeine exposure，ppce)的精子plagl1启动子高甲基化。此外，在ppce雄性子代大鼠软骨中检测到印记基因plagl1启动子多个位点高甲基化。由此，本发明推断，plagl1启动子高甲基化可能在ppce雄性子代软骨表型改变中发挥重要的调控作用。4、已知印记基因plagl1通常是以其编码的锌指蛋白zac1发挥转录调控作用。印记基因plagl1及其编码的锌指蛋白zac1具有良好的同源性，在人和啮齿类动物中的功能表现一致，并优先表达于父本等位基因。既往研究发现，由plagl1编码的锌指蛋白zac1通过调控功能基因表达，在小鼠发育和体外软骨形成过程中发挥着重要的作用[28]。在本研究中，本发明发现，ppce雄性子代大鼠软骨中plagl1的表达持续降低，且从宫内延续到出生后。同时，在体外胎软骨细胞培养过程中，敲低plagl1可观察到软骨基质合成障碍，并且发现tgfβ信号通路相关组份tgfβr1表达的抑制。而通过过表达plagl1可增加软骨基质含量，激活tgfβ信号通路。此外，在整体水平给予ppce雄性子代大鼠腺相关病毒过表达plagl1可以改善ppce雄性子代软骨质量低下，并激活tgfβ信号通路。提示，plagl1通过tgfβr1调控tgfβ信号通路功能影响ppce雄性子代大鼠关节软骨发育。以上内容表明，软骨细胞中plagl1可能作为父源性骨关节炎易感的治疗靶标，为父源性骨关节炎易感的早期防治应用提供干预靶标和实验依据。5、参考文献：6、[1]t.liu,c.xu,j.b.driban,t.mcalindon,c.b.eaton,b.lu,excessive alcoholconsumption and the risk of knee osteoarthritis:a prospective study from theosteoarthritis initiative,osteoarthritis cartilage(2022).7、[2]prevalence of doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitation---united states,2007-2009,mmwr morb mortalwkly rep 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sites of the mouse,dev dyn229(2)(2004)340-8.技术实现思路1、为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的在于建立一种父源性骨关节炎动物模型，进一步确定印记基因plagl1的启动子区dna甲基化水平及其表达与父源性成年骨关节炎易感间的相互关系，为父源性骨关节炎易感的早期防治应用提供干预靶标和实验依据，即提供一种基于印记基因plagl1作为父源性骨关节炎易感的干预靶标及其应用。2、本发明的目的通过下述技术方案实现：3、第一方面，本发明提供一种父源性骨关节炎动物模型的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：4、s1：选取健康的6周龄成年雄性啮齿类动物，交配前每日给予60mg/kg咖啡因胃內灌注2月，自由饮食；5、s2：之后把咖啡因暴露的雄性成年啮齿类动物与正常成年雌性啮齿类动物交配，获得子代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各6只进行哺乳喂养；6、s3：仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，部分继续正常饮食饲养至8周；7、s4：部分子代饲养至出生后12周检测关节软骨质量，以及进行长距离跑步造模后最终得到父源性骨关节炎动物模型。8、作为优选方案，所述步骤s1中，啮齿类动物为spf级wistar、sd大鼠或昆明种小鼠。9、进一步地，所述步骤s3中，正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同。10、第二方面，本发明提供一种基于印记基因plagl1作为父源性骨关节炎易感的干预靶标。11、作为优选方案，所述扩增plagl1基因的引物对序列如seq id no.1和seq id no.2所示；所述检测plagl1基因启动子区dna甲基化水平的引物对如seq id no.3和seq idno.4所示。12、第三方面，本发明提供一种父源性骨关节炎动物模型在筛选父源性骨关节炎的干预靶标中的应用，其特征在于：所述父源性骨关节炎动物模型由上述任一方法构建得到，所述动物模型中印记基因plagl1的启动子区甲基化水平增加，伴随着plagl1表达降低。优选地，所述父源性骨关节炎的干预靶标为干预plagl1表达后能改善父源性骨关节炎样表型。13、本发明的技术原理及研究过程如下：14、本发明通过研究证实，与对照组相比，ppce组父体精子plagl1启动子区dna甲基化水平显著增加，同时胎软骨中plagl1表达降低，基因启动子区dna甲基化水平增加，并持续到出生后。提示，ppce组父体精子与胎软骨中plagl1 dna甲基化水平具有一致性。15、接着，本发明人发现ppce组及对照组在给予长距离跑步进行骨关节炎造模后，ppce组相较于对照组，其雄性子代骨关节炎改良mankin评分增加，并且存在骨关节炎易感性增加的现象。而软骨中plagl1在出生后的持续低表达，很可能是介导软骨发育不良的主要机制，从而引起子代成年骨关节炎易感性增加。即ppce组胎软骨中plagl1表达降低、甲基化水平增加，出生后骨关节炎发生风险更高，有较好的一致性。16、综上，plagl1可为父源性骨关节炎的早期干预靶标并用于早期防治父源性骨关节炎的应用。17、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：18、1、本发明的技术构思贴近日常生活且较为新颖，选取了咖啡因这种日常暴露的外源物，使得模型构建更具备广泛适用性。19、2、本发明的动物造模方法简单可靠，能够模拟父体不良环境暴露所致子代骨关节炎易感的现象。本模型指标稳定性好，可重复性强，为父源性骨关节炎的构建提供了一种可靠的方法。20、3、本发明为父体不良环境暴露动物模型，与母体孕期不良环境暴露动物模型具有显著的区别。本模型为ppce模型，尚无相关动物模型的构建方法及骨关节炎方面的应用。21、4、基于本发明构建的父源性骨关节炎疾病模型，可用于指导男性合理备孕和临床合理用药、探讨父源性骨关节炎的发生发展机制、早期干预靶标中的应用。当前第1页12当前第1页12