本发明属于植物组织超低温保存方法，具体涉及一种青钱柳包埋玻璃化法超低温保存的方法。
背景技术：
1、青钱柳[cyclocarya paliurus(batal.)iljinskaja]属胡桃科(juglandaceae)青钱柳属植物，别名摇钱树、麻柳，青钱李、山麻柳、山化树。青钱柳被誉为“植物大熊猫”、“医学界的第三棵树”，是冰川四纪幸存下来的珍稀树种，是我国特有的单种属珍稀树种和国家重点的濒危植物之一。青钱柳富含多糖、黄酮类化合物、齐墩果酸、萜类化合物、有机酸、生物碱以及甾醇等多种有效成分，具有降血糖、降血压、降血脂、增加机体免疫力、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用，而且还含有大量的钾、钙、镁、磷等常量元素，以及锰、铁、铜、铬、锌、硒、钒、锗等微量元素。其中，与糖代谢和胰岛素作用密切相关的元素铬、镍、锂、硒、钒的含量较高，能够协助胰岛素发挥降血糖作用，并能改善糖耐量，因此，青钱柳具有独特的保健和药用价值。
2、目前，青钱柳的组织培养技术具有繁殖速度快、不受季节和环境条件限制等优点，它不仅可以解决种子萌发困难、萌发率低及优良特性保持等的诸多问题，而且可以克服扦插繁殖速度慢、难生根、繁殖率低的缺点，是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径。但是，由于青钱柳茎段的保存方法存在着许多问题，导致组织分化率、生根率低及苗木质量差等问题的出现。因此，研究一种青钱柳茎段的保存方法，提高青钱柳的成活率是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种青钱柳包埋玻璃化法超低温保存的方法。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
3、本发明提供了一种青钱柳包埋玻璃化法超低温保存的方法，包括以下步骤：
4、将经过消毒处理的青钱柳茎段进行包埋，得到青钱柳茎段包埋珠；然后移入第一培养基中进行预培养；
5、将经过预培养后的青钱柳茎段包埋珠置于装载液中进行装载，接着将青钱柳茎段包埋珠取出后，再将其置于pvs2中脱水处理，之后再置于分散有石墨烯量子点和碳纳米管的pvs2溶液中继续脱水，最后经超低温冷冻、解冻，并于第二培养基中恢复培养后，即完成所述青钱柳包埋玻璃化法超低温保存。
6、进一步地，所述消毒处理的具体过程为：先用70％乙醇消毒1min，再用0.1％氯化汞消毒12min，最后用无菌水冲洗2-3次。
7、有益效果：先进行消毒处理，可以起到抑制茎段发霉的作用，并且降低细菌等微生物的生长和繁殖速度，从而减少污染的风险，有利于提高细胞的存活率和生长速率。
8、进一步地，所述包埋的具体过程为：将所述经过消毒处理的青钱柳茎段放入含有浓度0.5g/l海藻酸钠和0.02g/l甘油的ms溶液中，然后将青钱柳茎段与含有海藻酸钠溶液和甘油的ms溶液共同放入含有10.2g/l cacl2、0.2g/l甘油、0.15g/l蔗糖的ms溶液中，即得到所述青钱柳茎段包埋珠。
9、进一步地，所述第一培养基中成分包括：2,4-d、甘露醇、脱落酸、iba和蔗糖；
10、其中，所述2,4-d的浓度为2mg/l、甘露醇的浓度为7.5mg/l、脱落酸的浓度为0.5mg/l、iba的浓度为2mg/l、蔗糖的浓度为17mg/l。
11、进一步地，所述预培养为：将所述青钱柳茎段包埋珠置于第一培养基中，在光照强度1500-2000lx，光照时间12h/d，温度20-30℃的条件下培养5-7d，优选培养时间为5d。
12、有益效果：本发明中之所以先将青钱柳茎段包埋珠置于第一培养基中是因为在该温度下预培养后既可以保证茎段很好地生长，还可以对细菌的细胞蛋白质进行进一步破坏，起到进一步脱毒的作用。而且还可以使植物组织逐渐适应低温环境，从而避免冷冻过程中细胞受到损伤，提高冷冻后材料的成活率和再生能力。
13、进一步地，所述装载液为添加有甘油和蔗糖的ms溶液，其中所述甘油的浓度为0.18g/l，蔗糖的浓度为0.14g/l；
14、所述装载温度为23-30℃，时间为75-90min。优选为温度25℃，时间80min。
15、进一步地，所述pvs2中脱水处理的温度为0℃，时间为50-60min，优选为60min；
16、所述分散有石墨烯量子点和碳纳米管的pvs2溶液中石墨烯量子点的含量为1-2g/100ml，碳纳米管的含量为1-2g/100ml；
17、所述继续脱水的温度为23-25℃，时间为5-8min。
18、有益效果：在采用超低温保存方法中，脱水是关键步骤，可以避免细胞内大量结冰引起的细胞死亡的问题。因此，本发明在pvs2脱水处理的基础上，还加入了石墨烯量子点和碳纳米管，石墨烯量子点和碳纳米管丰富的结构能够增加脱水效果并吸附营养，二者协同作用，进一步提高了茎段的成活率。
19、进一步地，所述超低温冷冻的具体过程为：将脱水结束后的混合体系，即分散有石墨烯量子点和碳纳米管的pvs2溶液和茎段共同放入温度为-196℃的液氮中进行冷冻保存1-2d。
20、进一步地，所述解冻的具体过程为：将超低温冷冻后的混合体系置于温度为35-40℃(优选为38℃)的水浴条件下化冻3-5min后，取出青钱柳茎段，用浓度为0.4g/l的蔗糖溶液洗涤3-5次。
21、进一步地，所述恢复培养的具体过程为：将化冻后的青钱柳茎段放入第二培养基中，先暗培养5-7d(优选为7d)，然后转入光照强度为1500-2000lx，温度为25±1℃的条件下培养10-15d。
22、更进一步地，所述第二培养基成分包括：iaa、naa、ga和蔗糖；
23、其中，所述iaa的浓度为1mg/l、naa的浓度为0.5mg/l、ga的浓度为2.5mg/l、蔗糖的浓度为30g/l。
24、本发明中所述ms溶液均为改良后的ms溶液，包括以下含量的组分：硝酸钾700mg/l、硝酸铵600mg/l、七水硫酸镁185mg/l、磷酸二氢钾60mg/l、二水氯化钙165mg/l、肌醇100mg/l、烟酸1mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、盐酸硫胺素0.2mg/l、甘氨酸2mg/l、硫酸亚铁27.85mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.25mg/l以及微量元素和蔗糖；
25、其中，所述微量元素和蔗糖的组成和含量同普通ms培养液的组成和含量相同，包括碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌8.6mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l；蔗糖30g/l。
26、有益效果：本发明通过改良基本培养液及成分，进一步促进了细胞分裂，提高植物组织的抗寒能力，从而提高冷冻后茎段的成活率和再生能力。
27、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
28、采用本发明的超低温保存方法保存的青钱柳茎段，在经过恢复培养后成活率较高，可达到90-95％。本发明通过包埋玻璃化法，以及石墨烯量子点和碳纳米管在冷冻前进行脱水，能够有效提高青钱柳茎段的保存效果，并且也可以使超低温保存后的茎段的脱毒率和生长率得到显著提高，进而提高茎段的成活率。