一种冷保存液及其在减少细胞、组织或器官缺血再灌注损伤中的应用

本发明属于冷藏或冷冻保存，尤其涉及一种冷保存液及其在减少细胞、组织或器官缺血再灌注损伤中的应用。

背景技术：

1、细胞或组织冷藏或冷冻保存技术是从生物医学到食品工业领域等不可或缺的关键技术。冷藏或冷冻保存技术将活细胞、组织及器官等生物材料保存于低温或超低温环境中，使细胞新陈代谢大大减慢甚至停止。冷藏或冷冻技术的共同难点在于1)如何减少降温后低温对细胞造成的损伤；和2)温度恢复后细胞、组织及器官的正常功能的恢复。

2、近年来，超低温冷冻保存技术已经实现了细胞和部分组织的冻存。其基本原理是将细胞等生物材料置于玻璃化冷冻保存液中平衡后，直接置于液氮环境中使细胞内外的水分子迅速进入玻璃化状态。然而，采用玻璃化冷冻保存液存在两大弊端：首先，实现玻璃化冷冻需要添加大量(10-15wt％)二甲基亚砜(dmso)作为玻璃化试剂结合体系中的水分，而dmso具有细胞毒性，影响细胞的存活率与功能，经常导致临床效果不理想；其次，玻璃化冷冻保存液只能抑制冷冻过程中冰晶的形成，无法在复温过程中控制冰晶成核与生长，导致细胞在复温过程中出现大冰晶造成细胞损伤。因此，研发无dmso的安全型细胞冷冻保存液成为国际上生物医学领域未来的发展趋势。而冷藏技术虽然保存的时间更短，但在临床器官移植领域已有大量实践证实了其可靠性和易操作性，因此在可预见的将来，冷藏技术仍然是活体细胞、组织和器官的医学应用领域内的主流。而冷藏技术的核心构成，则在于冷藏保存液的成分和配方。

3、哺乳动物组织器官的细胞成分复杂，是由多种类型细胞构成。组织的保存液需要对多种不同类型的原代细胞都具有较好的保存效果。并且由于组织结构紧密，保存介质不易渗透到组织的细胞中，因此保存液需要有一定的组织渗透性。而在提高保存介质组织渗透性的同时，又不能破坏组织的空间结构和形态，所以相比细胞的保存，实现组织的保存难度更大。最开始的组织保存液主要是用于器官移植，使用的方案主要有：thestanforduniversity solution(斯坦福大学方案)(1988)、amodifiedcollins solution(改进的柯林斯方案)(1990)、the university ofwisconsin solution(uw，威斯康辛大学方案)(1989)，其中，威斯康辛大学(uw)方案被认为是器官保存解决方案的行业标准，逐渐取代了前两种，但它提供的保存时间有限，部分产品仅最长达125min。器官移植使用的保存液等对于组织的保存时间较短；同时器官保存液中包含激素成分，例如地塞米松、前列腺素等会对保存的组织细胞产生刺激，从而对组织细胞基因水平上的产生影响，造成基因表达的改变，影响下游基因检测和研究。一些传统的组织保存试剂通过加入动物源蛋白，例如牛血清白蛋白等，都会对组织细胞的基因表达造成潜在的影响。

4、现有的细胞、组织和器官冷藏保存液，虽然可以帮助降低器官温度、防止细胞肿胀、清除氧自由基，减少缺血性损伤，延长器官在体外保持的安全时间并在再灌注时促进器官恢复，但在减少缺血再灌注损伤方面，仍然未能达到令人满意的效果。

5、安全型细胞冷冻保存液需要摒弃dmso的使用，大自然为我们提供了研发的思路。自然界有许多生命体能够在酷寒环境下存活，例如十三道纹地松鼠，金仓鼠等。它们都是可以冬眠的动物，具有抵抗缺血和低温的非凡生理特点，在冬眠期间，当核心温度急剧下降时，面对严重和快速的生理变化，未发现任何器官损伤。冬眠动物在冬眠季节之外，能够承受医源性损伤，如缺血/再灌注损伤(iri)和能量剥夺，而人体的iri会导致器官衰竭，如器官移植和心肌梗死。同样地，前期研究发现冬眠动物来源的细胞，如十三道纹地松鼠诱导多能干细胞(gs ipsc)，仓鼠肝细胞均表现出对冷应激的显著内在抵抗力。因此，以冬眠动物为自然模型，从冬眠动物应激保护机制出发，有望获得一种改善细胞冷保存和复苏，以及有效减少细胞或肝组织冷保存损伤的方法。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种冷保存液及其在减少细胞、组织或器官缺血再灌注损伤中的应用。本发明采用创新探索机制，发现磷酸胆碱、喹啉-4-羧酸、牛磺熊脱氧胆酸钠在冬眠动物和非冬眠动物的冷保存-复温期间具有显著差异，基于此，通过在保存液中添加磷酸胆碱、喹啉-4-羧酸、牛磺熊脱氧胆酸钠，发现使用添加了这些物质的保存液对细胞、组织和/或器官进行冷保存，细胞存活率高，能够有效减少冷保存-复温引起的细胞凋亡，降低线粒体ros，维持细胞膜完整性，有效减少冷保存-复温引起的线粒体损伤，减少缺血再灌注损伤并促进肝脏再生，这对于器官移植保存技术的进步有十分积大的意义。

2、为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、本发明的目的之一是提供了一种冷保存液，所述冷保存液的关键在于其中含有磷酸胆碱、喹啉-4-羧酸和牛磺熊脱氧胆酸钠中的任意一种或一种以上。

4、进一步的，所述冷保存液通过在基础冷保存液中添加磷酸胆碱、喹啉-4-羧酸和/或牛磺熊脱氧胆酸钠制成。

5、更进一步的，所述磷酸胆碱的使用浓度范围为5～500μm，喹啉-4-羧酸的使用浓度范围为2～200μm，牛磺熊脱氧胆酸钠使用浓度范围为10～1000μm。

6、再进一步的，所述基础冷保存液为hibernatetm-a培养基、uw液、htk液、celsior液、collins液以及optisol gs液中的任意一种。

7、其中hibernatetm-a培养基可广泛用于实验研究用途的多种细胞和组织的保存，uw液可广泛用于临床多种细胞组织和器官的保存，htk液、celsior液和collins液用于心脏、肺脏、肾脏及消化道组织器官等的保存，optisol gs液用于眼角膜及其他眼组织保存。

8、本发明的目的之二是提供了一种所述冷保存液在细胞、组织或器官冷保存中的应用。

9、进一步的，所述应用具体为在降低细胞、组织或器官温度，防止细胞、组织或器官肿胀，清除细胞、组织或器官中氧自由基，减少细胞、组织或器官缺血性损伤，延长细胞、组织或器官体外安全保持时间以及再灌注时促进细胞、组织或器官恢复中的应用。

10、更进一步的，所述应用具体为在减少细胞、组织或器官缺血再灌注损伤中的应用。

11、又进一步的，所述细胞为干细胞，所述组织为肝组织，所述所述器官为肝。

12、本发明以冬眠动物为自然模型，创新地从冬眠动物应激保护机制出发，通过对大鼠、仓鼠和人类供体移植物的肝脏亲脂和亲水代谢组学分析，建立了一个进化保守的代谢物候选名单，这些代谢物可能指示肝移植后肝脏恢复。通过分析发现磷酸胆碱水平与肝移植术后患者更好的肝脏恢复相关。其次发现喹啉-4-羧酸、牛磺熊脱氧胆酸钠在冬眠物种冷适应期间升高，复温期间下降，而人的肝细细胞在冷适应期和复温期间以上物质无显著差异。发明人经过研究发现，保存液中如果添加磷酸胆碱(phosphocholine)、喹啉-4-羧酸(qca)、牛磺熊脱氧胆酸钠(tudca)这三种物质中的任一种，对脐带来源的间充质干细胞以及肝脏组织进行冷保存，细胞存活率高，能够有效减少冷保存-复温引起的细胞凋亡，降低线粒体活性氧(ros)，维持细胞膜完整性，有效减少冷保存-复温引起的线粒体损伤，从而减少缺血再灌注损伤。具体的，在脐带来源的间充质干细胞的冷藏保存案例中，可有效减少冷保存-复温引起的干细胞死亡，保持其良好的细胞增殖能力和干细胞性状；在肝脏冷保存、缺血再灌注损伤2种模型案例中，可减轻冷保存/复温及缺血/再灌注损伤，促进肝脏的功能恢复，促进肝脏的再生。

13、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

14、(1)本发明首次发现，在脐带来源的间充质干细胞冷保存中，以hibernatetm-a保存液为基础保存液(对照组)，额外添加磷酸胆碱(phosphocholine)、喹啉-4-羧酸(qca)、牛磺熊脱氧胆酸钠(tudca)可有效减少冷保存-复温引起的细胞死亡，保持其良好的细胞增殖能力。

15、(2)本发明首次发现，在肝脏组织冷保存中，以临床金标准保存液uw液为基础(对照组)，额外添加磷酸胆碱(phosphocholine)、喹啉-4-羧酸(qca)、牛磺熊脱氧胆酸钠(tudca)可有效减少冷保存-复温引起的肝细胞凋亡，降低线粒体ros，维持肝细胞膜完整性，有效减少冷保存-复温引起的线粒体损伤，减少缺血再灌注损伤并促进肝脏再生。