一种开放式植物组织培养育苗方法

专利名称:一种开放式植物组织培养育苗方法
技术领域：
本发明属于农林领域的植物组织培养育苗技术，具体涉及一种开放式植物组织培养工厂化育苗方法。即在培养基中添加采用植物提取物配制而成的抑菌剂的条件下，使植物组织培养育苗过程脱离严格无菌的操作环境，尤其是不需要高压灭菌，可在开放的带菌环境中进行植物组织培养育苗，从根本上简化了植物组织培养育苗环节，提高了育苗工作效率，大大降低了植物组织培养育苗成本。
背景技术：
植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项植物繁殖技术。植物组织培养又称植物克隆，指通过无菌操作把植物的任何器官、组织或细胞接种于人工配制的含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基上，在人工控制环境下进行离体培养，使其生长、分化形成完整植株的过程。植物组织培养为植物的快速繁殖提供了新的手段，接种的一个小外植体，可以被诱导形成愈伤组织并再生芽和根，继代多次后，即可建立无性繁殖系，大量生产试管苗。建立植物试管苗繁育体系，有着非常重要的意义，其一， 快速繁殖不受季节限制，可在短期内获得大量个体；其二，选择优良单株扩繁，可保证品种的纯合性，可对高产、高抗、优质新品种进行快速推广；其三，通过脱毒离体培养，可以培育出不带任何病原物和病毒的试管苗，减少病害的发生。因此，利用植物组织培养快繁技术， 在提高繁殖系数、有效防止种性退化和生产高质量的种苗中起到了决定性作用。经过近一个世纪的发展，植物组织培养技术以其独特的优势，作为现代生物技术的一个重要手段现已在工厂化育苗、种苗脱毒复壮、遗传育种、种质资源的保存与交换等领域得到了广泛的应用。目前，已在多种经济植物中建立了相应的良种快速繁育体系。
发展至今，植物组织培养的理论研究已经相当精深，但它的技术环节还存在不少问题。目前广泛使用的植物组织培养育苗是在密闭、无菌环境下进行，包括接种外植体、诱导愈伤组织、愈伤组织分化形成试管苗、试管苗的移栽等几个步骤。这种组织培养方式存在四个缺陷培养基污染难以解决、试管苗成本过高、规模化生产技术不成熟和试管生产技术繁琐。
由于富含营养的培养基既适合植物组织生长发育，更适合杂菌的滋生。因此，不论是在植物组织培养的试验研究中还是在工厂化生产中，污染是普遍存在的问题，它严重地影响了植物苗木的规模化生产、植物试管基因库的构建、生产成本和宝贵材料保全等方面。 因此，控制污染成了组织培养中的首要技术。而影响污染的因素多种多样，如外植体的种类、取材的时间、预处理方法、消毒剂的种类、消毒方法、培养基和器皿灭茵、操作人员和工作环境的要求等都与污染密切相关，因此，使得污染问题难以防治，成为限制组织培养产业化的重要原因之一。
此外，传统的植物组织培养方式均是在严格无菌的封闭条件下进行的，无菌操作是常规植物组织培养的一项严格要求，如要对培养基、培养器皿高温灭菌，任何用于操作和处理植物组织的器皿都要消毒，其操作过程都必须在无菌环境如超净工作台内进行。如果能够建立起不灭菌的组织培养技术，还能够将污染率降低到可接受范围内，组织培养技术将得到巨大的飞跃。因此，寻找一种无需灭菌程序的开放式组织培养技术非常重要。植物开放式组织培养，即在抑菌剂的作用下，使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境，不需高压灭菌和超净工作台，在开放的有菌环境中进行植物组织培养，从根本上简化组织培养环节， 降低成本。
众所周知，传统组织培养过程中的污染，主要表现为培养基的污染，营养丰富的培养基为细菌、真菌提供了适宜的滋生场所。因此，只要将培养基改造成既可保证植物组织正常生长，又具有抑菌功能的培养基，菌类一旦失去滋生场所，就不会对组织培养过程产生危害。改造培养基的关键在于找到一种能够添加到培养基的广谱抑菌剂。目前，广谱抑菌剂的筛选一直是困扰植物组织培养专家的难题，有学者对抑菌剂及组织培养关系进行过研究。 单文修等采用在培养基中添加大量化学杀菌消毒剂苯甲酸类、山梨酸类、酚类、含氯化合物类、季胺盐类、脲类、胍类或天然消毒抑菌剂，建立了一种非无菌条件下的植物组织培养方法(申请号2004100M035. 5公开号CN1^8507A)。他们对常用抗生素、抗菌素、防腐剂做了大量单一或组合添加到培养基中的试验，实验证明，常用抗生素、抗菌素、防腐剂对植物组织培养中的污染具有的一定的防治作用，但是针对不同的植物品种要想找到一种合适的处理组合是比较困难的，往往当培养基抗菌时，植物组织的生长也受到抑制；而植物组织能正常生长时，却无法获得满意的抗菌效果。这也是国内外专家学者普遍遇到的障碍。其原因之一是还没有一种抗生素对所有的细菌都有效，而且药效期短；二是有些抗菌素、防腐剂在有效浓度下，其杀菌、抗菌离子对植物组织直接产生伤害。
为此，我们从多种植物中提取具有抑菌活性物质，建立了具有良好抑菌效果的植物提取物资源库，研制了适合于开放式组织培养的抑菌剂，使植物组织培养育苗过程可在开放的带菌环境中进行，从根本上简化了育苗环节，提高了工作效率，大大降低了植物组织培养育苗成本。

发明内容
本发明的目的在于建立一种低成本、高效益的开放式植物组织培养育苗方法，在添加植物提取物配制而成的抑菌剂的条件下，使植物组织培养育苗过程脱离严格无菌的操作环境，尤其是不需要高压灭菌，可在开放的带菌环境中进行植物组织培养育苗，简化了植物组织培养育苗环节，提高了工作效率，降低了植物组织培养育苗成本。
本发明提供的开放式植物组织培养育苗方法，其特征在于，该方法在有菌的室温自然环境条件下进行在培养基中添加植物提取物抑菌剂，以IL培养基计算，植物提取物抑菌剂的添加量为4 15g，制备抑菌培养基，再利用该抑菌培养基进行接种培养。
上述植物提取物抑菌剂可以采用下述两类，其一包括大蒜提取物、黄连提取物和忍冬叶提取物，其质量百分比为20 100%0 40%0 50%;其二包括甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物，其质量比为10 100%0 80%0 50%。
使用本发明所提供的抑菌培养基，可用于植物的种子、根、茎、叶和愈伤组织等接种和培养，以及试管苗的移栽，可以有效地减少植物组织培养过程中微生物的污染，保证植物组织、器官、细胞和试管苗的正常发育生长。
本发明所述的接种是指在有菌的自然环境条件下，将上述植物组织或试管苗接种在抑菌培养基中，除了无需进行无菌处理程序外，具体接种操作手续与常规组织培养的接种手续相同。
由于使用了抑菌培养基，因而本发明所述的开放式植物组织培养方法中的接种及培养过程无需再进行严格的无菌处理(无需高压灭菌、无菌接种和无菌培养)，改变了常规植物组织培养全过程中必须进行无菌处理的传统观念，可以省略了高压灭菌锅、超净工作台、紫外灯等设备及严格无菌的环境设施，并可以将易损的玻璃器皿更换为价格低廉、操作简便的塑料杯，省略了繁琐的消毒手续，大大降低了生产成本。
本发明与传统无菌组织培养相比，具有简化环节，节省成本等特点，具体如下
1.培养容器的选择在传统组织培养中，培养容器需选择耐高温高压的玻璃瓶和聚丙烯封口膜。而在开放式组织培养中，在培养基中添加抑菌剂，让抑菌培养基代替高压灭菌，并可用廉价的一次性塑料杯作为培养容器，用保鲜膜封口，这大大降低了成本。
2.接种器具的灭菌传统组织培养中，接种用的剪子、镊子、刀片等均采用高压灭菌或酒精灯灼烧灭菌，而在开放组织培养中，接种器具用75%酒精擦洗后，即可有效的防止由于接种器具引发的污染。
3.接种方法在接种室内，用75%的酒精将接种台面和手擦干净，揭开封口膜一角，用接种器具把植物接种到培养基上，再将杯口封严即可。
4.技术环节与成本分析开放式组织培养省去了高压灭菌和超净工作台接种，简化了组织培养环节。由于制备抑菌剂的材料资源丰富，生产工艺简单，消毒液也能重复利用，因此开放式组织培养与传统组织培养相比，大大节省成本。
具体实施方式
下面通过借助以下实施例将更加详细说明本发明，且以下实施例仅是说明性的， 本发明并不受这些实施例的限制。
开放式植物组织培养育苗可以按照以下步骤进行
(1)抑菌培养基的配制
植物组织培养所使用的培养基种类很多，如MS、N6、White等，本专利中植物组织培养以MS培养基为例进行说明。配制IL MS培养基，然后按照每升培养基添加4 15g抑菌剂标准，将抑菌剂添加至基本培养基中，用0. lmol/L NaOH或0. lmol/L HCl调节pH至 6. 0，配制成抑菌培养基(固体培养基中加入琼脂)。采用透明的塑料杯分装，将分装好培养基的容器盖上棉塞或用保鲜膜封口，培养基冷却后即可接种。
(2)接种
接种过程在开放环境中进行。除了培养基不需灭菌、不需严格无菌的接种环境外，其它接种步骤与传统的接种程序一样，即先用消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌外
植体，然后在接种台面上，将消毒后的外植体接种至添加有抑菌剂的培养基中，用保鲜膜封□。
(3)初代培养
将接种材料置于培养室中培养(培种室无需灭菌消毒)，以获得愈伤组织，一个周期后，按照上述操作进行继代培养。
(4)愈伤组织的分化[0028]将愈伤组织接种于抑菌分化培养基中进行培养，生根长芽，形成试管苗。
(5)试管苗的移栽
因为试管苗的整个培养过程为开放式培养，因此试管苗的移栽不需要炼苗。将试管苗取出后，用清水将其根部冲洗干净，再用抑菌剂浸泡试管苗根部，30分钟后用清水冲洗干净后移栽。
实施例一魔芋开放式组织培养
魔芋开放式组织培养按照以下步骤进行
(1)抑菌剂的制备
①大蒜提取物的制备
剥皮后的新鲜白皮大蒜1kg，洗净后加入水300ml，用打浆机搅打20分钟得到蒜泥，倒入密封罐中，滴加0. 02mol/L的盐酸并不断搅拌至蒜泥pH = 6，在温度40°C下密封静置，让蒜泥中的内源蒜酶解蒜氨酸4小时以产生大蒜素。酶解完成后，将蒜浆转移到搅拌罐中，加入4L 95 %食用乙醇，充分搅拌后，板框过滤得到大蒜素提取液，转移到真空减压浓缩罐中，60°C下减压蒸馏至干，得到黄色大蒜提取物，经高效液相色谱法检测大蒜素含量等于 6. 98%。
②黄连提取物的制备
称取干燥的黄连根茎1kg，粉碎机粉碎后过80目筛网，黄连粉末置于提取罐中加入3L 95%工业乙醇，95°C浸提5小时，通过板框过滤得到黄连提取液，转移到真空减压浓缩罐中，55°C下减压蒸馏至干，得到黄连提取物，经高效液相色谱法检测黄连素含量等于 20%。
③忍冬叶提取物的制备
称取干燥的忍冬叶1kg，粉碎机粉碎后过60目筛网，忍冬叶粉末置于提取罐中加入2L 80%工业乙醇，调节pH值5. 0，95°C浸提3小时，通过板框过滤得到忍冬叶提取液，转移到真空减压浓缩罐中，减压蒸馏至干，得到忍冬叶提取物。经高效液相色谱法检测绿原酸含量等于10%。
将三种提取物按照附表1所述的5种比例分别混合，制备成5种抑菌剂。
(2)抑菌培养基的配制
配制5份IL MS培养基，于其中加入琼脂，完全溶解后，添加激素6-BA 2mg/ L+NAA 0. lmg/L+IBA 0. ang/L，然后分别加入(1)中所述的5种抑菌剂，添加量为10g/L，配制成5种固体抑菌培养基。采用透明的塑料杯分装，将分装好培养基的容器用保鲜膜封口， 培养基冷却后即可接种。
(3)接种魔芋球茎
接种经常规消毒后的魔芋球茎，进行培养。对照1为O)中所述的不添加抑菌剂的固体培养基；对照2为(2)中所述的不添加抑菌剂的固体培养基，而且培养基需要灭菌。 每组接种20瓶，每瓶接种5块外植体，共100块外植体。抑菌培养基对魔芋愈伤组织诱导及芽形成的影响见附表1。
实施例二开放式条件下光果甘草、胀果甘草和乌拉尔甘草种子萌发
开放式条件下光果甘草、胀果甘草和乌拉尔甘草种子萌发按照以下步骤进行
(1)抑菌剂的制备[0048]按照实施例一中所述的制备方法制备大蒜提取物、黄连提取物和忍冬叶提取物， 并将三种提取物按照附表2所述的5种比例分别混合，制备成5种抑菌剂。
(2)抑菌培养基的配制
配制5份IL MS培养基，于其中加入琼脂，即为种子萌发培养基。分别加入(1) 中所述的5种抑菌剂，添加量为4g/L，配制成5种固体抑菌培养基。采用透明的塑料杯分装，将分装好培养基的容器用保鲜膜封口，培养基冷却后即可接种。
(3)甘草种子接种
用浓硫酸分别浸泡光果甘草、胀果甘草和乌拉尔甘草种子Ih后，用清水冲洗干净，经常规消毒后，分别接种于种子萌发培养基中，每个处理接种20瓶，每瓶接种10粒种子，共200粒种子。对照1为( 中所述的种子萌发培养基，且培养基不添加抑菌剂；对照 2为(2)中所述的种子萌发培养基，且培养基不添加抑菌剂，但培养基需要灭菌。抑菌培养基对三种甘草种子萌发的影响见附表2。
实施例三甘草开放式组织培养育苗
甘草开放式组织培养育苗按照以下步骤进行
(1)抑菌剂的制备
①甘草根提取物的制备
准确称取干燥的甘草根茎1kg，粉碎机粉碎后过80目筛网，甘草粉末置于提取罐中加入3L 50 %工业乙醇，超声提取1小时，通过板框过滤得到甘草黄酮提取液，转移到真空减压浓缩罐中，55°C下减压蒸馏至干，得到甘草根提取物，其中甘草黄酮的纯度等于 70%。
②桂花提取物的制备
准确称取干燥的桂花1kg，加入500ml 90%乙醇，解吸15分钟。再加入4L 80%的乙醇回流提取15分钟，提取2次，过滤，滤液转移到真空减压浓缩罐中，55°C下减压蒸馏至干，得到桂花提取物，其中桂花黄酮的纯度等于40%。
③石蒜提取物的制备
准确称取干燥的石蒜1kg，粉碎机粉碎后过80目筛网，石蒜粉末置于提取罐中加入IOL甲醇，75°C回流提取3小时，通过板框过滤得到石蒜提取液，转移到真空减压浓缩罐中，55°C下减压蒸馏至干，得到石蒜提取物，经高效液相色谱法检测石蒜生物碱的纯度等于
2 % ο
将三种提取物按照附表3所述的5种比例分别混合，制备成5种抑菌剂。
(2)抑菌培养基的配制
配制5份1 L MS培养基，于其中加入琼脂，完全溶解后，添加激素6-BA 2mg/ L+KT 0. 5mg/L+IBA 0. 5mg/L后，然后分别加入(1)中所述的5种抑菌剂，添加量为4g/L，配制成5种抑菌培养基。采用透明的塑料杯分装，将分装好培养基的容器盖上棉塞，培养基冷却后即可接种。
(3)接种胀果甘草下胚轴
接种经常规消毒后的胀果甘草、光果甘草下胚轴，进行培养。对照1为O)中所述的不添加抑菌剂的固体培养基；对照2为( 中所述的不添加抑菌剂的固体培养基，而且培养基需要灭菌。每组接种20瓶，每瓶接种6个茎段，共120个茎段。抑菌培养基对胀果甘草、光果甘草愈伤组织诱导率和分化率的影响见附表3。
实施例四开放式条件下刺山柑种子萌发及诱导下胚轴分化
开放式条件下刺山柑种子萌发及诱导下胚轴分化按照以下步骤进行
(1)抑菌剂的制备
按照实施例一中所述的制备方法制备大蒜提取物、黄连提取物和忍冬叶提取物， 并将三种提取物按照附表4所述的5种比例分别混合，制备成5种抑菌剂。
(2)抑菌培养基的配制
配制MS培养基，于其中加入琼脂，完全溶解后，添加激素。种子萌发培养基中添加激素为6-BA 1. Omg/L,诱导下胚轴分化培养基中添加激素为6-BA 0. lmg/L+NAA 0.01mg/L。分别加入(1)中所述的5种抑菌剂，添加量为15g/L，配制成抑菌培养基。采用透明的塑料杯分装，将分装好培养基的容器用保鲜膜封口，培养基冷却后即可接种。
(3)刺山柑种子接种
用浓硫酸浸泡刺山柑种子Ih后，用清水冲洗干净，经常规消毒后，接种于种子萌发培养基中，每个处理接种10瓶，每瓶接种15粒种子，共150粒种子。当种子萌发后，切取下胚轴，置于分化培养基中，每组接种20瓶，每瓶接种6个茎段，共120个茎段。对照1为 (2)中所述的不添加抑菌剂的培养基；对照2为( 中所述的不添加抑菌剂的培养基，但是培养基需要灭菌。抑菌培养基对刺山柑种子萌发和下胚轴分化的影响见附表4。
实施例五开放式条件下魔芋试管苗的形成和移栽
开放式条件下魔芋试管苗的形成和移栽按照以下步骤进行
(1)抑菌剂的制备
按照实施例三中所述的制备方法制备甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物， 并将三种提取物按照附表5所述的5种比例分别混合，制备成5种抑菌剂。
(2)抑菌培养基的配制
配制IL MS培养基，于其中加入琼脂，完全溶解后，添加激素6-BA1.5mg/ L+NAA 0.3mg/L后，分别加入(1)中所述的5种抑菌剂，添加量为15g/L，配制成抑菌培养基。采用透明的塑料杯分装，将分装好培养基的容器用保鲜膜封口，培养基冷却后即可接种。
(3)接种魔芋不定芽
接种经常规消毒后的魔芋不定芽，进行培养，使之分化形成试管苗。对照1为(2) 中所述的不添加抑菌剂的培养基；对照2为( 中所述的不添加抑菌剂的培养基，而且培养基需要灭菌，每组接种20瓶，每瓶接种5个不定芽，共100个不定芽。
(4)液体抑菌剂的制备
分别取(1)中所述的5种抑菌剂，每种称取5g溶于IL水中，搅拌均勻后制得5种液体抑菌剂，分别用于试管苗根部的浸泡。
(5)试管苗的移栽
待不定芽形成粗壮的试管苗后，将试管苗取出，用清水将其根部冲洗干净，再将其根部分别置于(4)中制备的5种液体抑菌剂中，浸泡30分钟后，用清水冲洗干净，移栽。抑菌培养基对魔芋试管苗的形成和移栽的影响见附表5。
实施例六开放式条件下红豆杉外植体诱导形成愈伤组织[0088]开放式条件下红豆杉外植体诱导形成愈伤组织按照以下步骤进行
(1)抑菌剂的制备
按照实施例三中所述的制备方法制备甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物， 并将三种提取物按照附表6所述的5种比例分别混合，制备成5种抑菌剂。
(2)抑菌培养基的配制
配制5份IL MS培养基，于其中加入1 %琼脂，完全溶解后，添加激素二氯苯氧乙酸O.aiig/L和α-萘乙酸0.5mg/L，然后分别加入(1)中所述的5种抑菌剂，添加量为Sg/ L，配制成5种抑菌培养基。采用透明的塑料杯分装，将分装好培养基的容器盖上棉塞，培养基冷却后即可接种。
(3)接种红豆杉外植体
接种经常规消毒后的中国红豆杉、东北红豆杉和曼地亚红豆杉嫩茎，进行培养。对照1为O)中所述的不添加抑菌剂的固体培养基；对照2为( 中所述的不添加抑菌剂的固体培养基，而且培养基需要灭菌。每组接种20瓶，每瓶接种6个茎段，共120个茎段。抑菌培养基对中国红豆杉、东北红豆杉和曼地亚红豆杉愈伤组织诱导率的影响见附表6。
附表1开放式条件下魔芋愈伤组织诱导和芽的形成
权利要求
1.一种开放式植物组织培养育苗方法，其特征在于，该方法在有菌的室温自然环境条件下进行在培养基中添加植物提取物抑菌剂，以1 L培养基计算，植物提取物抑菌剂的添加量为4 15 g，制备抑菌培养基，再利用该抑菌培养基进行接种培养；所述植物提取物抑菌剂的第一种配方包括大蒜提取物、黄连提取物和忍冬叶提取物， 其质量百分比为20 100% 0 40% 0 50% ；所述植物提取物抑菌剂的第二种配方包括甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物， 其质量百分比为10 100% 0 80% 0 50%。
2.如权利要求
1所述的开放式植物组织培养育苗方法，其特征在于，在所述植物提取物抑菌剂的第一种配方中，大蒜提取物中的大蒜素的重量百分比大于或等于6. 0%，黄连提取物中黄连素的重量百分比大于或等于20. 0%，忍冬叶提取物中绿原酸的重量百分比大于或等于10. 0%。
3.如权利要求
1所述的开放式植物组织培养育苗方法，其特征在于，在所述植物提取物抑菌剂的第二种配方中，甘草根提取物中的甘草黄酮纯度大于或等于70%，桂花提取物中的桂花黄酮纯度大于或等于40%，石蒜提取物中的石蒜生物碱纯度大于或等于m。
专利摘要
本发明涉及一种开放式植物组织培养育苗方法，属于农林领域的植物组织培养育苗技术。该方法在有菌的室温自然环境条件下进行在培养基中添加植物提取物抑菌剂，以1L培养基计算，抑菌剂的添加量为4～15g，制备抑菌培养基，再利用该抑菌培养基进行接种培养。抑菌剂有两类，其一包括大蒜提取物、黄连提取物和忍冬叶提取物，其质量百分比为20～100％∶0～40％∶0～50％；其二包括甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物，其质量比为10～100％∶0～80％∶0～50％。本发明方法可使植物组织培养育苗过程脱离严格无菌的操作环境，在开放的有菌环境中进行植物组织培养育苗，这从根本上简化了植物组织培养育苗环节，提高了工作效率，大大降低了育苗成本。
文档编号A01H4/00GKCN101455180 B发布类型授权 专利申请号CN 200910060484
公开日2012年1月25日 申请日期2009年1月9日
发明者何峰, 余龙江, 季家兴, 杨英, 金文闻 申请人:华中科技大学非专利引用 (4),