专利名称:一种甘蔗种的组培方法
技术领域：
本发明涉及的是一种甘蔗种的组培方法，选取常规良种甘蔗的优质细胞与竹笋细胞、甜叶菊细胞进行细胞融合后再培养，产生了优良的新一代甘蔗种。
背景技术：
常规的甘蔗的蔗种是直接留蔗内尾部做种或整条做种，如果经多年留种，各种病菌病毒侵入体内常常造成品种退化，产量越来越低。常规的甘蔗选育良种是选异变株做良种繁殖，产量没有多大增加。现有的杂交甘蔗是用不同的良种蔗之间杂交，杂交出来的甘蔗品种往往难以体现出优良的品质。
根据细胞学说理论指出高等植物的器官和组织，可以不断分割，直至单个细胞， 这种单个是具有潜在全能性的功能单位，即植物细胞具有全能性。目前，植物细胞具有全能性被解释为每一个细胞带有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型的细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。现代植物细胞杂交技术是用两种或两种以上的植物细胞，经酶解法或机械分离法除去细胞壁，游离出原生质体，在一定的条件下经诱导融合形成杂种细胞；是植物杂交育种的进步。本发明用良种甘蔗和竹或其它植物远缘杂交，也是植物杂交育种实践开辟的一条新路。在这方面，名称是热带季风气候地区甘蔗截茎杂交制种方法，公开号是 CN101401M3的发明专利，公开了一种适用于中国热带季风气候地区甘蔗杂交制种的方法， 包括甘蔗亲本种植、穗茎促根处理、穗茎砍取与保育、隔离杂交与人工辅助授粉和种子成熟过程管理步骤。但这种方法显然与甘蔗通过组培而实现杂交有着较大的差距。再进一步的检索，也未发现有甘蔗杂交的技术披露，所以通过甘蔗组培进行杂交，对农业发展是很有意义的。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗种的组培方法，解决甘蔗连年旧地重栽产生的各种病菌病毒，导致出现严重的品种退化，造成甘蔗生长越来越小，产量越来越低，质量越来越差的问题。
为实现上述目的，本发明采取了下述技术措施，一种甘蔗种的组培方法，由常规良种甘蔗、食用竹笋、甜叶菊三种植物细胞进行组培融合杂交，具体方法步骤是
(1)在无菌条件下用常规良种甘蔗的叶鞘或叶片、食用竹笋的茎尖或叶片芽尖和甜叶菊的叶片芽尖，分别接种于常规通用的MS培养基中，经过常规恒温培养25-40天脱毒， 分别获得第一代纯化试管苗原种；
(2)分别将脱毒后的纯化试管苗原种组织转接于常规诱导愈伤组织MS培养基中培养25 30天，诱导产生愈伤组织，期间用通过变压装置得到的电压达到10000-12000伏的高压电，经过电触棒以每次0. 1-0. 3秒的速度瞬间剌激培养基，每隔160-240分钟剌激一次，培养期间剌激120-180次，调整培养基的酸碱度至PH 5. 5-6. 5，使纯化试管苗原种组织远缘变性为变性愈伤组织；
(3)分别将变性愈伤组织转接于常规细胞脱分化含超氧化物歧化酶(SOD) 100-200 万单位/毫升的液体MS培养基中，在25 30°C的温度下振荡培养7 10天，得到培养成熟细胞组织；
(4)将已培养好的三种细胞组织在无菌条件下分别用滤网或离心收集细胞， 用无菌水洗涤净，分别接种于新的MS培养基中，加入占培养基体积 3%的活性是 200000-300000单位/毫升的体积比是1 1 1的纤维酶、半纤维酶、果胶酶，在温度是 25-30°C的条件下继续振荡培养15-25小时，磨破细胞壁游离出细胞原生质体；
(5)离心除去酶液，收集细胞原生质体并用无菌水洗涤3-5次至净化，进行细胞融合杂交把收集洗涤净化的甘蔗、竹笋、甜叶菊无细胞壁的原生质按体积比是 1 0.3-1 0.3-1的比例加入由含量是4.0-6. 0%的NaN03、8-15% (ff/V)的蔗糖溶液及 100-200万单位/升的超氧化物歧化酶混合而成的溶液中，于32-37°C恒温保持4_8分钟， 离心3-8分钟，得到原生质体沉积物，再在恒温水浴20-40分钟，经过上处理获得大量细胞原生质体融合多核杂交细胞集合体，以加有0. 1% NaNO3的MS培养基洗涤集合体二次，然后接种于有浅层液体的固体MS培养基中培养25-35天；
(6)再取上述经过培养的杂交细胞生长发育旺盛的集合体，用30w紫外线灯在 1-1. 5米范围内以每5分钟为一梯度递进间歇照射，即第一次5分钟，待生长一天后，再照射10分，待生长一天后，再照射15分钟，如此递进间歇照射直至30分钟，淘汰生长弱势植株得到生长强壮杂交植株。
(7)在进行细胞融合杂交时，还可以把收集洗涤净化的甘蔗、竹笋、甜叶菊细胞原生质按体积比是1 0.3-1 0.3-1的比例混合接种于有浅层液体的固体MS培养基中轻微振荡培养，在开始的M小时内每隔30-50分钟用由变压装置输出的10000-12000伏高压电，经过电触棒以每次0. 1-0. 3秒的速度瞬间剌激培养基，然后静止培养，经过25-35天的培养得到融合多核杂交细胞集合体，即可按上述(6)的步骤培养。
采取上述措施的本发明，因为采用了竹笋、甜叶菊和甘蔗的细胞组织进行了细胞融合杂交，使得本发明杂交的甘蔗种具有生长旺盛、抗旱耐涝、抗倒伏，抗不良环境，抗病虫害，免疫能力强的特点。像竹笋似的生长速度快，同时还具有甜菊甜味超越甘蔗的特性，使得本发明杂交甘蔗独具杂交优良品质的特色。效果表现在于1.含糖量高于常规目前现有的良种甘蔗；2.汁多、外形好看；3.生长旺盛、抗倒状、抗病力强；4.耐干旱、耐涝、耐盐碱酸能力强；5.蔗节长度达到20厘米左右，蔗径可达5-7厘米，蔗肉可达5米；6.产量可达 10-20吨/亩，本发明技术要求严谨，实施可操作性容易。以本发明甘蔗种苗移入大田种植， 在3亩地中种植试验，以常规种植模式种植，并与常规良种台糖27号进行比较，本发明的种植结果是平均亩产12吨，平均甘蔗节长度16厘米，甘蔗直径最粗处6厘米，糖度17%。所有数据均比常规良种甘蔗台糖27号的种植结果更为优良。
具体实施方式
实施例1
(1)在无菌条件下用台糖27号良种甘蔗的叶鞘、甜竹笋的茎尖和甜叶菊的叶片芽尖，分别接种于常规通用的MS培养基中，经过常规恒温培养30天脱毒，分别获得第一代纯化试管苗原种；
(2)分别将脱毒后的纯化试管苗原种组织转接于常规诱导愈伤组织MS培养基中培养25天，诱导产生愈伤组织，期间用通过变压装置得到的电压达到10000伏的高压电，经过电触棒以每次0. 1秒的速度瞬间剌激培养基，每隔180分钟剌激一次，培养期间剌激160 次，调整培养基的酸碱度至PH 6.0，使纯化试管苗原种组织远缘变性为变性愈伤组织；
(3)分别将变性愈伤组织转接于常规细胞脱分化含超氧化物歧化酶(SOD) 100万单位/升的液体MS培养基中，在30°C的温度下振荡培养10天，得到培养成熟细胞组织；
(4)将已培养好的三种细胞组织在无菌条件下分别离心收集细胞，用无菌水洗涤净，分别接种于新的MS培养基中，加入占培养基体积1 %的活性均是10000单位/毫升的体积比是1 1 1的纤维酶、半纤维酶、果胶酶，在30°C的条件下继续振荡培养20小时，磨破细胞壁游离出细胞原生质体；
(5)离心除去酶液，收集细胞原生质体并用无菌水洗涤3次至净化，进行细胞融合杂交把收集洗涤净化的甘蔗、竹笋、甜叶菊无细胞壁的原生质按体积比是1 1 1的比例加入由含量是6. 0%的NaN03、10% (ff/V)的蔗糖溶液及100万单位/升的超氧化物歧化酶混合而成的溶液中，于32°C恒温保持5分钟，离心5分钟，得到原生质体沉积物，再在 32°C恒温水浴30分钟，经过上述处理获得大量细胞原生质体融合多核杂交细胞集合体，以加有0. 1 % NaNO3的MS液体培养基洗涤集合体二次，然后接种于有浅层液体的固体MS培养基中培养30天；
(6)再取上述经过培养的杂交细胞生长发育旺盛的集合体，用30w紫外线灯在 1-1. 5米范围内以每5分钟为一梯度递进间歇照射，即第一次5分钟，待生长一天后，再照射10分，待生长一天后，再照射15分钟，如此递进间歇照射直至30分钟，淘汰生长弱势植株得到生长强壮杂交植株。
实施例2
(1)在无菌条件下用台糖27号良种甘蔗的嫩叶片、甜竹笋的茎尖和甜叶菊的叶片芽尖，分别接种于常规通用的MS培养基中，经过常规恒温培养35天脱毒，分别获得第一代纯化试管苗原种；
(2)分别将脱毒后的纯化试管苗原种组织转接于常规诱导愈伤组织MS培养基中培养30天，诱导产生愈伤组织，期间用通过变压装置得到的电压达到12000伏的高压电，经过电触棒以每次0. 3秒的速度瞬间剌激培养基，每隔240分钟剌激一次，培养期间剌激150 次，调整培养基的酸碱度至PH 6. 5，使纯化试管苗原种组织远缘变性为变性愈伤组织；
(3)分别将变性愈伤组织转接于常规细胞脱分化含超氧化物歧化酶(SOD) 200万单位/升的液体MS培养基中，在25 30°C的温度下振荡培养10天，得到培养成熟细胞组织；
(4)将已培养好的三种细胞组织在无菌条件下分别用滤网收集细胞，用无菌水洗涤净，分别接种于新的MS培养基中，加入占培养基体积3%的活性是30000单位/毫升的体积比是1 1 1的纤维酶、半纤维酶、果胶酶，在温度是30°C的条件下继续振荡培养25 小时，磨破细胞壁游离出细胞原生质体；
(5)离心除去酶液，收集细胞原生质体并用无菌水洗涤5次至净化，进行细胞融合杂交把收集洗涤净化的甘蔗、竹笋、甜叶菊细胞原生质按体积比是1 0.3 1的比例混合接种于有浅层液体的固体MS培养基中轻微振荡培养，在开始的M小时内每隔30分钟用由变压装置输出的10000伏高压电，经过电触棒以每次0. 1秒的速度瞬间剌激培养基，然后静止培养，经过35天的培养得到融合多核杂交细胞集合体，
(6)再取上述经过培养的杂交细胞生长发育旺盛的集合体，用30w紫外线灯在 1-1. 5米范围内以每5分钟为一梯度递进间歇照射，即第一次5分钟，待生长一天后，再照射10分，待生长一天后，再照射15分钟，如此递进间歇照射直至30分钟，淘汰生长弱势植株得到生长强壮杂交植株。
权利要求
1.一种甘蔗种的组培方法，其特征是所述的组培方法由常规良种甘蔗、食用竹笋、甜叶菊三种植物细胞进行组培融合杂交，具体方法步骤是(1)在无菌条件下用常规良种甘蔗的叶鞘或叶片、食用竹笋的茎尖或叶片芽尖和甜叶菊的叶片芽尖，分别接种于常规通用的MS培养基中，经过常规恒温培养25-40天脱毒，分别获得第一代纯化试管苗原种；(2)分别将脱毒后的纯化试管苗原种组织转接于常规诱导愈伤组织MS培养基中培养 25 30天，诱导产生愈伤组织，期间用通过变压装置得到的电压达到10000-12000伏的高压电，经过电触棒以每次0. 1-0. 3秒的速度瞬间剌激培养基，每隔160-240分钟剌激一次， 培养期间剌激120-180次，调整培养基的酸碱度至PH 5. 5-6. 5，使纯化试管苗原种组织远缘变性为变性愈伤组织；(3)分别将变性愈伤组织转接于常规细胞脱分化含超氧化物歧化酶(SOD)100-200万单位/毫升的液体MS培养基中，在25 30°C的温度下振荡培养7 10天，得到培养成熟细胞组织；(4)将已培养好的三种细胞组织在无菌条件下分别用滤网或离心收集细胞，用无菌水洗涤净，分别接种于新的MS培养基中，加入占培养基体积 3%的活性是 200000-300000单位/毫升的体积比是1 1 1的纤维酶、半纤维酶、果胶酶，在温度是 25-30°C的条件下继续振荡培养15-25小时，磨破细胞壁游离出细胞原生质体；(5)离心除去酶液，收集细胞原生质体并用无菌水洗涤3-5次至净化，进行细胞融合杂交把收集洗涤净化的甘蔗、竹笋、甜叶菊无细胞壁的原生质按体积比是 1 0.3-1 0.3-1的比例加入由含量是4.0-6. 0%的NaN03、8-15% (ff/V)的蔗糖溶液及 100-200万单位/升的超氧化物歧化酶混合而成的溶液中，于32-37°C恒温保持4_8分钟， 离心3-8分钟，得到原生质体沉积物，再在恒温水浴20-40分钟，经过上处理获得大量细胞原生质体融合多核杂交细胞集合体，以加有0. 1% NaNO3的MS培养基洗涤集合体二次，然后接种于有浅层液体的固体MS培养基中培养25-35天；(6)再取上述经过培养的杂交细胞生长发育旺盛的集合体，用30w紫外线灯在1-1.5米范围内以每5分钟为一梯度递进间歇照射，即第一次5分钟，待生长一天后，再照射10分， 待生长一天后，再照射15分钟，如此递进间歇照射直至30分钟，淘汰生长弱势植株得到生长强壮杂交植株。
2.根据权利要求
1所述的甘蔗种的组培方法，其特征在于所述的细胞融合杂交是把收集洗涤净化的甘蔗、竹笋、甜叶菊细胞原生质按体积比是1 0.3-1 0.3-1的比例混合接种于有浅层液体的固体MS培养基中轻微振荡培养，在开始的M小时内每隔30-50分钟用由变压装置输出的10000-12000伏高压电，经过电触棒以每次0. 1-0. 3秒的速度瞬间剌激培养基，然后静止培养，经过25-35天的培养得到融合多核杂交细胞集合体。
专利摘要
本发明公开的是一种甘蔗种的组培方法。常规的甘蔗的蔗种是直接留蔗内尾部做种或整条做种，如果经多年留种，各种病菌病毒侵入体内常常造成品种退化，产量越来越低。常规的甘蔗选育良种是选异变株做良种繁殖，产量没有多大增加。现有的杂交甘蔗是用不同的良种蔗之间杂交，杂交出来的甘蔗品种往往难以体现出优良的品质。本发明采用了竹笋、甜叶菊和甘蔗的细胞组织进行了细胞融合杂交，使得本发明杂交的甘蔗种具有生长旺盛、抗旱耐涝、抗倒伏，抗不良环境，抗病虫害，免疫能力强的特点。像竹笋似的生长速度快，同时还具有甜菊甜味超越甘蔗的特性，使得本发明杂交甘蔗种独具杂交优良品质的特色。
文档编号A01H4/00GKCN102273409SQ201110179181
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月28日
发明者蔡明 申请人:蔡明 导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan