具有杀线虫活性的几丁质-蛋白质复合物的制作方法

专利名称:具有杀线虫活性的几丁质-蛋白质复合物的制作方法
本发明涉及将有壳水生动物废料转变成有用产品的，和代替用于处理有壳水生动物加工工业所产廉价废物的高成本传统方法的加工过程，更具体一些说，本发明涉及从甲壳纲外骨骼硬聚合基质分离出和回收自然界存在的几丁质-蛋白质复合物，和应用此复合物去抑制园艺和农业所关心的植物寄生线虫和其他线虫生长的方法。
背景技术：
线虫，或不分节的线虫，具有细长、梭形或袋状和外盖护膜的身体，属线形动物门，广存于自然界，居于土壤、水和植物，与广大动、植物的寄生病害有重要关系。
虽然有些重要问题与动物的线虫病有关，但主要的兴趣似乎仍然集中在寄生于植物的根、茎、叶和种子的线虫方面。线虫是损害农作物和使世界生产遭受重大经济损失的主要因素。举例来说，有害线虫包括根瘤线虫(根节线虫属类)、伤根线虫(草地垫刃线虫属类)、螺旋形线虫(嗜日垫刃线虫属类)与潜伏线虫(与内侵线虫属相似)。这些线虫对柑桔类作物和200多种其他植物，具有严重的损害作用。在叶纹中也可找到损害矮生植物杆子的线虫(垫丸大线虫属类)、肾状线虫(Rotylenchulus类)和针状线虫(Amphelenchoid-es类)。侵扰果园的线虫有环状线虫(Marroposthonic类)和剑状线虫(Xiphinema类)。常常侵扰大豆的有大豆囊线虫(异皮线虫属类)和根瘤线虫(根节线虫属类)。
仅在美国，就有近2百万英亩农田每年要进行预防、检疫、施化肥、烟熏土壤、热水处理和其他处理，以防止线虫。这些土地包括种植非粮食作物(如棉花和烟叶)、大田作物(如玉米和小麦)、果园作物(如苹果、柑桔和坚果)、蔬菜(如土豆)和大量观植物的土地。易受线虫侵扰的有扁桃、苹果、天门冬属植物、柑桔(包括橙子、园柚、洋柠檬和酸橙)、棉花、葡萄、西瓜、桃子、落花生、菠萝、大豆、草莓和其他食用植物和几乎全部蔬菜，此外还有家庭花园和草坪，工业观赏草地和许多其他植物。此外，由于直接或间接受不可防御的线虫的干扰，使得大面积的可耕农田(包括作物地、牧草地、森林地和其他农田地)可能休闲或无用。
控制线虫的植物方法有作物轮换、土壤处理、施化学肥料、施新鲜苜蓿或芥末这样的“绿肥”，以及土壤处理等各种物理方法。象水蒸汽处理土壤和热水处理植物主茎之类的方法，一般只是在一定的范围内适用。另一方面，虽然线虫对许多市售农药，不论是以气体的形式用(如烟熏法)，还是以液体和固体的形式用(如撒在土壤中)，都有抵制作用，但是系统施农药的化学方法已取得了相当大的收效(A.C.Tarjan and P.C.Cheo，“罗德岛大学的线虫筛选方案”，Contribution 887，农业实验站，Kingston，R.I.March，1956)。
目前，已在美国环境保护署注册的、可作重要食品、原料和纤维作物防止线虫用的化学品只有25个左右。而且现在市场上大多数的防线虫剂商品，对人和动物是有毒的，大都是含有机物的硫代磷酸酯(硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯)化合物和胆碱脂酶抑制剂。其中许多还有植物毒。由于其对环境有不利的影响，目前对市场的一些防灭线虫药品，正在进行可能导致取消注册的鉴定。在控制植物寄生线虫方面应考虑的关键问题，是安全和效力问题，以及农业成本问题。目前商业上很需要有干扰线虫和杀线虫的物质，特别需要各种对动、植物和人类无害的生物控制剂。
虽然几乎在所有的土壤中，特别是在那些含有腐植质的土壤中，有原生动物门、细菌、捕食线虫的东西和在理论上可起抵抗植物寄生线虫控制剂制作用的霉菌，但是世界上到处都在大规模地实行生物控制方案(K.F.Baker and R.J.Cook，“植物病原的生物控制”，W.H.Freeman and Company，旧金山，California，1974;H.Decker，“植物线虫和对它的控制(植物线虫学)”，Published for the U.S.Department of Agricul-ture and the National Science Foundation，Washington，D.C.by Amerind Publishing Co.Ltd.，New Delhi，India，1981)。
用有系统和有规划的方法，对Chesapeake Bay之类的特别地区，将相当大量的无毒有机废料(可以聚集起来的和引起严重环境污染和经济后果的无毒有机废料)引入土壤所起生物作用的分析结果是，效果甚微(R.A.A.Muzzarelli and E.R.Pariser Eds.，“关于几丁质-蛋白质的第一次国际会议的科研报告集”，MIT Sea Grant Report，MISG 78-7，Cambrige，Mass，1978;B.L.Averbach，“利用几丁质废料生产几丁质/脱乙酰壳多糖”，P.P.285～300，in W.S.Otwell;“80年代海洋食品废料的有效管理科研报告集”，Florida Sea Grand Report No.40，February，1981;T.P.Cathcort et al，“复合兰蟹加工植物固体废料”，An-nual Report，Department of Agricuture Eng-ineering University of Maryland，College Park，Maryland，March，1982)。
但是Brown等在实验室所做各项试验所取得的结果表明，当用干粉海洋食品废料〔含有市售的几丁质和葡萄糖，碱处理(3.5%NaOH，24小时)过的和未处理的虾壳废料〕作土壤调节剂时，据统计，在根瘤干扰上明显下降，在番茄和观赏植物中几丁质分离放线菌纲的数目明显上升(L.R.Brown et al.，“几丁质海洋生物废料应用于控制植物寄生线虫”，MMRC Project No.GR-76-004 and CO-76-020，Mississippi Marine Re-source Chronical，Long Beach，Mississippi，Octorber，1977 and“几丁质海洋食品废料用于控制植物寄生线虫”，BMR Project No.GR-ST-78-003 and GR-ST-78-004，Bureau of Marine Resources，Miss-issippi Department of Wildlife Conservation，Long Beach，Mississippi，September，1979)。
在Chesapeake Bay地区与聚集蟹壳废料有关的一些问题(如墨西哥湾的虾壳废料)，和在由这些废料分离几丁质和脱乙酰壳多糖所起的作用和所得的效果方面，大家经常看法不一致，因此促使了实验室研究工作的开展，导致了本发明方法的产生。在已发表的报告中提出的看法有以下一些(a)将残存作物和炭质物质加入土壤的结果是，土壤群体中的线虫和某些真菌都受到抑制(M.B.Linford et al，“在有机质分解期间，烂根线虫的土壤群体下降”，SoilSci，45，27，1938;C.B.Davey and G.C.Papa-vizas，“有机土壤调节剂对菜豆抗丝核菌病害的作用”，Agron.J.，51493，1959);(b)在土壤中加少量市售几丁质，但不加脱乙酰壳多糖或乙酰氨基葡糖时，似乎能够刺激产壳质酶的微生物，和减轻由镰刀菌引起的菜豆严重烂根(R.Mitchell and M.Alexander，“溶真菌的现象和土壤中镰刀菌的生物控制”，Na-ture，190，1961;R.Mitchell and M.Alexander，“几丁质和镰刀菌病害的生物控制”，Plant Disease Repor-ter 45487，July 15，1961;(c)是脱乙酰壳多糖而不是几丁质，能抑制包括在培养基中的植物和动物的病原体在内的许多真菌(C.R.Allan and L.A.Hedwiger，“几丁质对变更细胞壁组成的真菌所起的杀真菌作用”，Exp.Mycology 3285，1979)。(d)脱乙酰壳多糖的工业制品在减少工业蟹加工过程废水所需化学氧和生物氧方面的作用很小，或没有(F.W.Wheaton et al.，“兰蟹加工厂废水的性质和处理系统的发展”，WRRC Technical Report No.65，University of Maryland，College Park，Maryland，April 1981)。
在目前发表的专利文献中也对发展各种有关几丁质处理的有用方法进行了描述(Austin，U.S.Patents 3，879，377，3，892，731 and 4，286，087;Balassa，U.S.Patents 3，903，268，3，911，116 and 3，914，413;Dunn，U.S.Patent 3，847，897;Casey，U.S.Patent 4，059，097;Muralidhara，U.S.Patent 4，282，351)，这些内容作为参考材料结合在本发明中。有的专利文献介绍了各种由几丁质回收脱乙酰壳多糖的成熟技术(Rig-by，U.S.Patent 2，048，879，Penniston，U.S.Patents 3，862，122，4，195，175 and 4，199，496)，这些内容也作为参考材料结合在本发明中。
发明提示本发明的目的是，为了给处理工业有壳水生动物加工厂所产的经济价值极低的残留废料，提供改进和经济上有利的方法。
本发明的另一目的，是为了将含几丁质的生物量废料变成工业有用组成，特别是变成农业、园艺和动物饲料等有用组成和形状，提供一种方法。
本发明的再另一目的，是为了从自然界存在的、在各种培养基和土壤样品中具有能产生干扰线虫和杀线虫活性的含几丁质生物量，获得大量的工业原料，提供一种改进的和廉价的方法。
本发明的一个比较具体的目的，是提供一种新的分离出的几丁质-蛋白质复合物。这种几丁质-蛋白质复合物，可从现有的自然资源中获得，并对原型线虫类的线虫，具有切实可靠的活性，不用根据直接毒杀法去消灭线虫。
对于应用本发明的专业人员，只要学习本专利的说明书和附在后面的权利要求
，就可以较深入和全面地了解本发明的目的、特点和优点。
本专利涉及用经济易行的稀酸水解甲壳动物废料法制造具有杀线虫活性的几丁质-蛋白质复合物这一新发现。在此法的脱矿质和部分蛋白质降解过程中，可以有，也可以没有二氧化碳和其他挥发气体的回收设备。用显微镜观测所得几丁质-蛋白质复合物在线虫离体培养基中诱发杀线虫活性时，可以看出，由于线虫失去活动能力和死亡而形成的早期衰老和空泡。用亮绿和甲苯基亮兰染色法对线虫进行染色，就可以使染上色的死线虫与活动的线虫形成鲜明的对照。
由于本文提出的几丁质-蛋白质复合物可以诱发杀线虫活性，在工业上容易低成本大量生产，加入农业和园艺用土壤可以控制使植物致病的线虫，由此可见，本发明为利用价格特别低的有壳水生动物废料，为避免由于线虫干扰造成的粮食、纤维和经济损失，提供了一种在经济上和环境保护上都具有吸引力的方法。将这种物料并入动物饲料，也为控制肠胃线虫病和丰富食用蛋白资源，提供了一种方法。
图的说明对于技术熟练的专业人员，结合以下的，可以对发明有一个较全面的了解。
图1表示本发明制造几丁质-蛋白质复合物的过程和可能回收的副产品。
图2表示按例2所述方法处理蟹壳原料所得蛋白质的亚基组成。
图3表示用于处理有壳水生动物废料以生产工业几丁质和脱乙酰聚多糖产品的一般方法(供与本发明方法作对比之用)，和几丁质和脱乙酰壳多糖的化学结构。
图4表示例2、3和4所制得的几丁质-蛋白质复合物中蛋白组分的亚基组成。
图5表示用例2所述的酸处理法处理工业赤霉素发酵过程所产干发酵饼所得几丁质-蛋白质复合物中蛋白组分的亚基组成。
图6表示几丁质、脱乙酰壳聚糖和蟹壳几丁质-蛋白质复合物的交流(AC)电导率与所用电压的关系。
图7表示几丁质(A)、本发明的几丁质-蛋白质复合物(B)和脱乙酰壳多糖的红外光谱。
图8表示未处理的霉菌发酵饼(A)和本发明酸处理霉菌发酵饼产品(B)的红外光谱。
图9表示在对比培养基(A和B)中，在接种16～28天后线虫(Panagrellus类)的显微照片，和在含本发明几丁质-蛋白质复合物的试验基(C和D)中在接种16～20天后线虫的显微照片。
图10表示用亮绿染色的活线虫和死线虫。
实现本发明的最佳方法用任何合适的含几丁质生物量原料，都可以制造本发明的几丁质-蛋白质复合物。这种原料不限于带壳的无脊椎动物的生物体，例如，包括甲壳纲动物、软体动物、海底生物体和鲸食虾的节肢动物。最好的有壳水生动物废料，是加工蟹、龙虾、螯虾、河虾和对虾得到的废料。包括藻菌目和子囊菌目类在内的真菌细胞壁和丝状团都含有几丁质，但是不能为工业加工提供原料，因为所有这类原料都已被利用了。藻菌目和子囊菌目的生物体可能被含在蜗牛(大蜗牛-园口螺属)消化液内的，或由某些像假草细胞菌属之类细胞产生的30几个酶(包括几丁酶、葡萄糖酶和干露聚糖酶)中的一个或几个酶消化掉，因此目前最能实现的，是以Chesapeake Bay产的兰蟹〔兰泳蟹属(Callinectes Sapidus)〕壳为原料来制几丁质-蛋白质复合物。兹将制造方法介绍于下传统的兰蟹加工法(E·J·Middlebrooks，“工业污染控制，卷1农业工业”，John Wileyand Sons，New York，206～207，1979)所用的蟹，或从泥浆纲捞而得，或用诱饵陷阱和绳纲捕捉而得，或在蟹脱皮期间从多草的海滨刮得。邓杰内斯蟹、石蟹和雄蟹是用诱饵罐捕集，然后贮藏在具有循环海水的船上，和(或)在加工以前，一般用干杀法将蟹杀死，贮藏在陆地上的罐内。兰蟹是在活的情况下被运到加工厂，然后倒入电车，用直接蒸汽，在121℃下蒸煮18～20分钟，然后将蒸煮过的蟹置冷库中过夜，然后除爪，保留备下一步使用。在脱下甲壳和爪子后，用机器或人工采摘法对蟹爪，有时蟹壳进行剥肉处理。蟹加工废料，一般排入水沟，或城市下水道，或埋掉以保卫生，或者送去炼油，通过干燥和切细加工，最后生产出饲料。此饲料特别适用于作鸡饲料(P·R·Austin et al.，U·S·Patent 4，320，150;W·P·Uri Yrams，Jr·and T·M·Miller，“根据营养价值来看蟹粉和蟹粉-磷酸用作单胃动物家畜用高蛋白质饲料问题”，Final Report(F15-81-005)to Department of Natural Resouces，Maryland Tidewater Admin，Stration Narch，1982)。
本发明认为，宜优先选用的原料或粗料(图1)是已烘干和切成小粒的蟹加工废料。为了降低原料的价格，可以省略干燥步骤。原料的粒度只影响加工速度，但不影响性质。蟹粉原料的组成，因海洋和壳上肉的清除程度而不同，一般原料含40～50%的蛋白质，少量的碳酸钙和其他的矿物盐(约50%)以及约含10%的几丁质。
干燥和切细的蟹壳废料被磨成或打碎成合乎要求的粒度后，或直接送入加工装置使用，或在需要的情况下经过热、冷水洗涤，以除去输送过程中所造成的污染，然后送入加工装置。将碎壳料放入搅拌罐式反应器中，应用1.0N HCl之类的稀无机酸，在常温常压下进行脱矿质。脱矿质的时间为30～60分钟。不宜用硫酸和磷酸之类的酸，因为这类酸会产生不溶性钙盐，影响产品回收。在脱矿质的反应过程中，伴随产生明显的蟹壳蛋白质组分的变性(图2)释放出具有可察觉的、链烷胺特征的鱼味CO2气，因此可用滴定或测定此放出气体的方法，对反应进行监视。
应特别注意的是，不溶性反应最终产物是几丁质-蛋白质复合物。它的凝胶电泳性质不同于用乙二胺四乙酸螯合剂脱矿质脱蟹壳时所得的产品(图4)和由真菌分离出的几丁质-蛋白质复合物(图5)。这种几丁质-蛋白质复合物的固体电性质也不同于工业上用精细加工过的几丁质和脱乙酰壳多糖为原料生产的几丁质-蛋白质复合物(图3、6)。
在完成脱矿质和蛋白质变性以后，用稀酸水解，水解时间为60分钟(从水解开始算起)，然后用水或用弱苏打灰(CaCO3)溶液洗涤所得的几丁质-蛋白质料，至中性(PH7.0)为止。对于脱矿质和蛋白变性过程以及水洗罐排出的污水，可以将其循环以回收低分子肽、氨基酸和氯化钙盐，或简单地将其排入指定的排水沟或废水处理装置。将所产的几丁质-蛋白质复合物进行干燥和破碎。假若需要，可磨成粒度小于0.5毫米的粒子。所得的产品，可符合一般几丁质和脱乙酰壳多糖加工(图3)的需要，不用进一步加工。
所得的几丁质-蛋白质复合物(图4、6和7)具有(ⅰ)不溶于中性和稀酸溶液，但溶于浓无机酸，并同时使大量的蛋白质分解;(ⅱ)低灰分量;(ⅲ)由于存在蛋白质部分的原因，所以具有高结合氮含量;(ⅳ)将自然界存在的生物降解物质加入线虫离体培养基时，结果是活生物体的数量明显下降(图9-10)。用由蟹、龙虾、河虾或其他壳类水生动物的加工废料，或用由含几丁质的真菌、真菌和酵母菌的细胞壁得出的几丁质和脱乙酰壳多糖，能够生产这种产品。用工业方法能够高产率地生产这种产品，而且成本大大降低于上述方法。从原型线虫类线虫对几丁质或脱乙酰壳多糖的反应来看(图9)，在离体培养基中线虫培体因诱发而引起的形态变化也是明显不同的。
本发明的几丁质-蛋白质复合物应用于植物生成培养基的数量范围为1～50重%，一般与含有必要营养的植物生长培养基混合使用。较宜的用量范围2-20重%。最宜的用量范围为5～10重%。合适的用量因对植物防护技术掌握的程度而不同。这是周所知的。最适合的用量除了受上述变化的影响以外，还受所控制的病、作物的类型、作物的生长阶段和使用期间所限制。在1到6个月的间期内，可能需要按规定的用量重复1或数次。可以将本发明几丁质-蛋白质复合物做成各种形状供使用，最好制成片状或粒状。
将活性组分与表面活性剂(或不用)、粉碎的固体(如滑石粉、天然白土、叶蜡石和硅藻土等)、粉末(如小麦、红杉和黄豆等的粉)或无机物(如碳酸镁、碳酸钙、磷酸钙、硅铝酸钠、硫等)进行调配，可以制得各种粉状和尘状制品。颗粒稀释的选择是根据对所需产品的物理和化学要求，活性组分的物化性质和浓度，使用上要求的形状。
依据调配用的活性组分、稀释剂和其他加入物的用量可以知道制成品的组成。
用加液体、机械处理和一般干燥的方法，可以将粒状制品变成粉状制品。所用的机器有球磨机、混合机和挤压机。即使混合物中没有液体也可用成型机成型。在成型的粒子中可以含水溶性粘合剂。例如有机盐、尿素、木素磺酸盐、甲基纤维素和其他水溶性聚合物等。在最终的球状或片状制品中上述物质的含量约为25重%。这些物质有助于在野外条件下片状制品的分解，和活性物质的释放。另一种方法是将活性组分的悬浮液喷在由白土、蛭石、玉米等制成的粒子上。后法还可以使用表面活性剂。
本发明的组成，除含本发明的活性组分外，还可以含通用的杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀真菌剂、固果剂、疏果剂和肥料等农用化学品。所以这种制品除了具有杀线虫作用外，还可以作许多其他用途。
由于几丁质-蛋白质复合物含有蛋白质，所以使几丁质-蛋白质复合物含10%的慢释性氮。因此它能与促使代谢变化的亚磷酸化合物和(或)钾源联合起来帮助肥料平衡。这又是它的一个优点。用众所周知的技术，进一步加入其他氮肥源，可以使土壤内的氮肥增加。目前最能体现本发明的方法是将上述组成与土壤或像蛭石之类的无机物粒子在罐内混合，例如用于培养温室或苗圃这样培养植物之类的地方。在上述制品中加入Harposporium类真菌，可以提高几丁质-蛋白质复合物的杀线虫活性。
按照本发明可以控制使植物致病的线虫，但不排斥用去控制下表中的线虫。
表Ⅰ致病的植物线虫线虫 植物寄主Aphelenchoides besseyi 草
属Ditylenchus dispari 根作物，庄稼Heterodera rostochiensis 马铃薯Ditylenchus dectructor 马铃薯Pratylenchus Penetrans 烟叶、苹果、樱桃Xiphinema americanum 草、柑桔、番茄Melonidogyne hapla 马铃薯Tylenchulus semipenetrans 柑桔Ditylenchus myceliophagus 真菌Tylenchorhynchus claytoni 烟草
Hemicriconemoides chitwoodi 山茶属Hemicycliophora arenaria 柑桔Paratrichodorus christiei 旱芹Paratylenchus Projectus 草Dratytenchus zeae 玉米Holoaimus columbus 大豆Pratylenchus neglectus 玉米、草
属等我们相信，任何一个专业人员，不用作进一步的说明，应用上述说明，就可以全面地应用本发明。所以下面的实例只是为了帮助作比较详细的说明，决没有限制本发明其余部分的意思。
以下所有的温度都是未校正的摄氏温度。除有注明者外，所有的压力都是常压。所有的分数和百分数都是重量分数和重量百分数。元素分析数据在一般误差范围之内。所有新产品都具有所希望的红外母体峰。
例1原料制备将市售的蟹粉加工废料，在经过水洗后，放入空气干燥箱，在100℃下干燥16小时左右。然后用机械法将它破碎到能通过美国25号标准试验筛的粒子。这些粒子含5～10%的水分、近40～50%的蛋白质和30～50%的CaCO3(干重量基)。未经任何处理的三批有代表性原料的元素组成见表Ⅱ。蛋白质含量是用Lowry法测得(测量酪氨酸和肽含量)。氮含量是用基于Pregl-Dumas法和Perkin-Elmer型240B元素分析器的燃料分析法测得。
表Ⅱ有壳水生动物原材料的组成元素组成 未分的(1) 筛过的(2) 筛过的(3)钙(微克/克) 92900.0 94999.0 95900.0钠(微克/克) 9470.0 12000.0 10500.0镁(微克/克) 4880.0 5170.0 5030.0钾(微克/克) 4160.0 3390.0 4420.0蒽(微克/克) 1070.0 1000.0 1170.0铁(微克/克) 361.0 410.0 716.0铝(微克/克) 100.0 103.0 206.0钡(微克/克) 25.5 23.5 34.6硼(微克/克) 4.5 4.5 6.6镉(微克/克) ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5铬(微克/克) 1.0 1.5 1.6钴(微克/克) ＜1.0 ＜1.0 ＜3.3铜(微克/克) 27.0 25.0 36.3铅(微克/克) ＜2.5 ＜2.5 ＜8.2锰(微克/克) 150.0 145.0 228.0钼(微克/克) ＜1.0 ＜1.0 ＜3.3锌(微克/克) 69.0 57.5 74.2碳(%) 29.84 34.76 34.01氢(%) 3.96 4.74 5.59氮(%) 5.46 6.29 7.19蛋白质(Lowry法)(%) 32.4 43.0 41.8灰分(%) 45.76 36.65 37.22水分(%) 7.41 10.47 8.11(1)碎壳废料，作为标准样品(批号118)。
(2)磨碎壳废料，通过ASTM40筛目的筛子(批号118)。
(3)磨碎壳废料，粒度＜0.5毫米。
例2用酸脱矿质法分离蟹壳几丁质-蛋白质复合物(实验室规模)用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(含10%的聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺凝胶内含0.1%的十二烷基硫酸钠)测定亚基组成。各种蛋白质在用考马基亮兰R染色之后的凝胶扫描见图2。图中，各箭头所指的位置是各种具有标准分子量蛋白质的位置。其中(a)为脱浆球蛋白质(200，000);(b)为β-半乳糖甙酚(116，500);(c)为磷酸化酶(97400);(d)为牛血清白蛋白(66，200);(e)为卵白蛋白(45，000);(f)为碳酸酐酶(31000);(g)为大豆胰蛋白抑制剂(21，500);(h)为溶菌酶(14，400)。括号内的数值为分子量，单位为道尔顿。
将100克例1制的原料，在30分钟的时间内，在连续搅拌下，慢慢地加入2升1.0N的HCl溶液内。根据反应混合物的泡化和释放出的具有胺味的CO2气，来判定反应迅速引起原料中CaCO3迅速脱矿质的情况。将40毫升左右的浓HCl分多次，在60分钟的时间内加入反应混合物，以维持其酸度在PH值为1.5左右。此后不会有泡出现。用美国评定分子筛标准法NO.270，聚集在脱矿质和部分水解步骤之后留下的不溶性剩余物，并用水洗涤，直至产品和洗涤水均呈中性(PH7.0)为止。将此不溶性产品在100℃下干燥一夜，可得128克产品(产率为32%)。将此干燥产品置Wiley实验室用磨碎机中，磨成颗度小于0.5毫米的粒子，供此后所有的研究之用。
例3用螯合剂处理法分离蟹壳几丁质-蛋白质复合物(实验室规模)将10克例1制的原料，放入1升0.1M的乙二胺四乙酸溶液(PH7.5)内，然后在25℃下连续搅拌此混合物72小时。用美国评定分子筛标准法NO.270，聚集留下的不溶性产品，并进行彻底洗涤，然后在100℃下烘干一夜，可得2.75克干燥产品(产率为27%)。
例4几丁质-蛋白质复合物的制造(小型试验规模)将15公斤例1制的原料，放入盛有100升1.25N HCl的200升具有搅拌器的不锈钢反应罐内。以在60分钟的脱矿质和酸水解反应的时间内尽量少生泡为准，控制加料速度。用设有150筛目自动清洗不锈钢纲的Sweco(R)Vibro-Energy(R)分离器聚集脱矿质和酸水解后留下的不溶产物，然后对其进行水洗、1%Na2CO3溶液洗，再水洗，以除去所有的可溶性碳酸盐。置此中性(PH7.0)产物在100℃下干燥一夜，然后将其磨碎成粒度小于0.5毫米的粒子。例2、3和4所得制品、几丁质和脱乙酰壳多糖的元素组成见表Ⅲ。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(含10%的聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺凝胶内含0.1%的十二烷基硫酸钠)测定由例2、3和4制得的几丁质-蛋白质复合物内和工业几丁质内以及工业脱乙酰壳多糖内蛋白质组分的亚基组成。图4表示上述各种蛋白质组分在用考马斯亮兰染色之后的凝胶扫描。其中样品(A)是例1制的5毫克米处理蟹壳废料;样品(B)是例2用稀酸水解脱矿质法制得的几丁质-蛋白质复合物。样品(C)是例2用乙二胺四乙酸脱矿质法制得的几丁质-蛋白质复合物;样品(D)是按照例4方法制得的几丁质-蛋白质复合物;样品(E)是工业制造的几丁质，箭头表示的意思与图2同。
例5由于真菌生物量分离出几丁质-蛋白质复合物(实验室规模)可用由工业赤霉素发酵过程获得的干发酵罐饼作原料，以代替例1至例4所用的蟹壳原料。将200克干菌生物量放入1000毫升1.0NHcl内。连续搅拌此混合物1小时。在反应过程中没有明显的气体放出，盐酸溶液也不会明显中和。用离心法(SorlallCSA旋转器，转速为10000转/分，4℃下，运转10分钟)聚集留下的不溶物质。将所得细粒重新悬浮于水，并再进行一次如上所述的分离。重复上述步骤4次，直到留下的不溶性生物质和洗涤水均呈中性(PH7.0)为止。置在经过5次水洗之后所留下的不溶性物质于100℃下，烘干一夜，可得88克固体料(产率为44%)。在使用前，用Wiley实验室磨碎机将其磨成粒度小于0.5毫米的颗粒。其组成见表Ⅳ。
图5表示用酸处法处理工业赤霉素发酵过程产的干发酵罐饼所得几丁质-蛋白质复合物的蛋白组分的亚基组成。扫描(A)表示酸处理过的原料。扫描(B)表示未处理的真菌发酵罐饼。箭头表示的意思与图2同。
例6几丁质-蛋白质复合物的特性对于蟹壳原料样品和每一评定物质(粒度小于0.5毫米)，都要进行碳、氢、氮、灰分和金属等含量的分析，总含量和氨基酸含量的分析(表ⅡⅢ和Ⅳ)固态电性质分析(图6)和红外光谱分析(图7～8)应用感应偶合等离子体发射光谱作金属元素的组成分析。
表Ⅳ真菌制品的组成真菌发 酸处理过的元素组成 酵罐饼 真菌发酵罐饼钙(微克/克) 766.0 174.0钠(微克/克) 102.0 160.0镁(微克/克) 1000.0 23.5钾(微克/克) 8270.0 132.0锶(微克/克) 3.2 1.9铁(微克/克) 106.0 237.0铝(微克/克) 26.9 28.1钡(微克/克) 1.1 ＜0.9硼(微克/克) 2.1 3.7镉(微克/克) ＜1.0 ＜0.9铬(微克/克) 1.0 ＜1.9钴(微克/克) ＜2.1 1.9铜(微克/克) 8.6 1.9铅(微克/克) ＜5.4 ＜4.7锰(微克/克) 8.6 2.8钼(微克/克) ＜2.1 ＜1.9锌(微克/克) 22.7 1.9碳(%) 52.74 1.9氢(%) 7.07 7.60氮(%) 6.03 6.20蛋白质(Lowry法)(%) 31.46 29.32
灰分(%) 4.96 30.75水分(%) 4.04 5.33应用Perkin-ELmer240B元素分析仪作碳、氢和氮的分析。应用Perkin-ELmer型1320红外光谱仪，测量所有物料的红外光谱。用10NNaoH溶液，在25℃下抽提每种物料48小时，以测定其总蛋白质含量，然后用Lowry法测定溶液中蛋白质含量。在真空下用6NHCl进行样品水解(110℃，24小时)，以分析氨基酸的含量。按照最近鉴定过的那标准方法(M·W·Dong and J.C.De Cesare Liq.Chrom.1，222-228(1983))，在用高效液体色光谱分离之后，测定氨基酸量。采用标准实验室电测定法，测定固态电性质。氨基酸的组成见表Ⅴ。
例7几丁质-蛋白质复合中蛋白质组分的特性在蟹壳废料酸脱矿质时，用十二烷基硫酸钠抽提出的高分子量蛋白质减少(图2)。但是总蛋白质量仍然近乎不变(表Ⅲ)，而且只有用延伸碱水解法才能分出蛋白质。这表明在酸处理过程中，或者是使蛋白质更不溶解，或者是使蛋白质部分降解，或者是使蛋白质同价地联结在几丁质上，或者这些同时发生。原材料和几丁质-蛋白质复合物(表Ⅴ)的氨基酸分析结果证明，在弱酸水解时，氨基酸无明显变化。这表明，在原料中和最终产品中的相对蛋白量不会有明显的不同。如图4所示，在工业几丁质和脱乙酰壳多糖的制品中，蛋白质含量不是很高的。另一方面应用乙二胺四乙酸脱矿质制得的几丁质-蛋白质复合物中，含有大量没有变质的蛋白质。
表Ⅴ蟹壳废料、酸脱矿质蟹壳废料和乙二胺四乙酸脱矿质蟹壳废料的氨基酸组成
a 几丁质-蛋白质复合物 乙二胺四乙酸氨基酸 原材料 脱矿质批号524 批号118 蟹壳废料b天冬氨酸 10.8 8.3 10.5 13.3苏氨酸 3.6 8.6 4.513.6丝氨酸 4.9 5.5 4.8谷氨酸b 9.9 13.4 12.9 12.2甘氨酸 5.0 3.9 3.9 4.2丙氨酸 5.6 5.3 5.4 5.5缬氨酸 3.6 5.2 5.9 6.0甲硫氨酸 1.8 3.3 3.5 3.1异亮氨酸 4.4 5.4 5.5 5.1亮氨酸 10.5 8.5 9.0 7.4酪氨酸 4.9 5.9 5.7 5.9苯丙氨酸 10.8 9.3 9.8 5.9赖氨酸 12.5 7.3 8.3 7.5组氨酸 3.0 2.9 3.2 3.0精氨酸 8.8 7.1 7.0 7.2a 没有测定半胱氨酸、脯氨酸和色氨酸。
b 天冬酰胺和谷氨酰胺分别包括在天冬氨酸和谷氨酸之内。
c 丝氨酸和苏氨酸。
例8几丁质蛋白质复合物中几丁质组分的特性用红外光谱分析几丁质-蛋白质复合物，并与工业用几丁质和脱乙酰壳多糖的红外分析结果进行比较(图7)。除了1738厘米的超吸谱带以外，几丁质-蛋白质复合物的光谱与几丁质的光谱非常相似，这可能是由于蛋白质组分的原因。经过脱乙酰壳多糖化的几丁质和含几丁质复合物的吸收谱带为1550厘米-1。这似乎表明，其与几丁质中氨基团的乙酰化有关。几丁质的谱带较强，几丁质-蛋白质复合物的谱带表明，在制造几丁质-蛋白质复合物的过程中，有非常少量的几丁质脱乙酰。
真菌法制品的光谱见图8。此光谱与几丁质光谱非常相似。不处理法和酸处理法两者制品的光谱也相似。这表明原料中几丁质在形式上的变化很小。
几丁质-蛋白质复合物的溶解性质与几丁质的溶解性质相似，即不溶于通用的溶剂中。用除垢剂和象尿素、胍盐之类的蛋白溶剂，或用碱处理，可使蛋白质部分溶解。另一方面，脱乙酰壳多糖可溶于稀有机酸(1%的乙酸、丙酸和甲酸)，并产生明显的降解。
例9杀线虫试验系统的制备将Julius Feldmess博士在美国实验室(the U.S.Depat-ment of Agriculture Plant Protection Institude，Bel-tsville，Maryland)制得的腐蚀寄生线虫(Panagrellus类)，放入工业用燕麦粉谷类(Gerber Product Co，Fremont Michi-gon)内培养。线虫被放在60×22毫米无菌塑料培养皿内，皿内盛有6克经高压灭菌的燕麦粉谷类，和20毫升无菌蒸馏水。用悬浮有2000个线虫的2毫升无菌蒸馏水滴入各皿内，进行接种。然后在30℃下孵化21天。按上述比例，控制仅含燕麦粉谷类、蒸馏水和线虫的培养物。用于评定杀线虫活性的物料都要经过高压灭菌，然后按每盘0.2克的标准，将其加入各培养皿内。将对比用和评定用的培养物分成许多组，每组5个样品。
例10杀线虫活性的测定按照例9提供的评定系统制备并观察培养物。从开始后的第6天开始进行观察，一直延续到第21天，或直至培养物死尽。从含有Panagrellus类线虫的培养物的活动表面，抽出0.01毫升试样，用温计数玻片技术，进行显微镜观测，应用各组每一皿抽出样品的测定值的平均值，来确定相对群种。从第6天起，开始计算线虫数，一直连续到第21天。平均结果见表Ⅵ。从这些结果可以看出，在用本发明几丁质-蛋白复合物处理过的培养基中，线虫数明显减少。
表Ⅵ各种制品对培养基活线虫数的影响a活生物体的数目对比物 1300～1500b几丁质 600～700b脱乙酰壳多糖 900～400b几丁质-蛋白质复合物 0～400a-从试板表面取的0.01毫升样品中算出的活生物体数。
b-具有3%(重/重)的添加。
在第17天后可以看出生动体总数明显减少，繁殖率下降。虽然在用几丁质-蛋白质复合物、几丁质和脱乙酰壳多糖处理过的培养基中，在群体上都有减少，但是用本发明的几丁质-蛋白质复合物时，线虫减少最明显。这也表明，用本发明的几丁-蛋白质复合物，比用纯度较高的几丁质和脱乙酰壳多糖，在经济上有明显优点。目前没有利用真菌发酵饼，但在数量上是足以考虑用它作本方法的实用原料。
在线虫群体试验中的杀线虫活性见图9(A～D)中的实情照片。这些照片包括在所有发展阶段明显变化的情况。用亮绿(C.I.42040)和亮甲苯基兰(C.I.51010)avital染色法，可以提高鉴别死、活线虫的准确性。染色的方法是，将一滴0.05%的水溶液放到有生物体的显微镜玻片上。在3分钟内，死活生物体清晰可辨(图10)。活生物体染不上色，死生物体则染上色。线虫表面破裂情况显示得相当清楚(图9)。只有用几丁质-蛋白质复合物处理过的培养基，早在13天以前的各个阶段，就显示出有大量标志线虫过早衰老的空泡。这种出现空泡的情况，在用任何其它物质处理过的培养基中，是看不到的。
例11在具有土壤的培养基中几丁质-蛋白质复合物的干扰线虫和杀线虫的活性将由农田随意选得的土壤与几丁质-蛋白质复合物，按0.05、0.025和0.01的比例(复合物/土壤，重/重)混合。将相同分子量的这种混合物撤到水内植物中和放在室温下孵化。此时，腐蚀寄生线虫的同系交配群体得到发展。可以看出有一些种类的线虫出现，Panagrellus类线虫和杆状线虫类线虫占多数。计算培养基中死、活生物体的数目。由表Ⅶ可见，含5%几丁质-蛋白质复合物的，杀死线虫量最大。含有几丁质和脱乙酰壳多糖的对比试验结果表明，几丁质和脱乙酰壳多糖的杀线虫效率很低，在33天时分别仅为33%和49%。显微镜测定结果表明，在培养基中含有噬线虫真菌时，会产生最大的杀线虫率。这可以反映几丁质-蛋白质复合物作用的方式，几丁质-蛋白质复合物可以刺激噬线虫真菌。
下表表示在关于几丁质-蛋白质复合物对土壤培养基中线虫生长的作用的三次重复试验(每样品三块板)中所观测到的杀线虫活性。
表Ⅶ离体培养土壤活性试验板上死生物体的百分数30天 45天 60天对比物 16% 16% 19%1%几丁质-蛋白质复合物 52% 53% 91%2.5% ″ 49.7% 52% 77%5% ″ 93.6% 96% 80.7%改变上述诸例中所用的一般要求的和特殊要求的反应剂和本发明的操作条件，仍然很好地重复上述诸例中所得的结果。根据前面所作的说明，对于任何与本发明技术有关的专业人员，可以很容易地弄清楚本发明主要特点，不会背离本发明的精神和背景，能作各种改变和改进以适应各种用途和条件。
工业应用的可能性从上述揭示可以看出，本发明在将含几丁质生物废料转变成具有对农业和园艺有用的干扰线虫和杀线虫性质的产品方面，在工业上是有用的。
权利要求
1.一种含有由含几丁质废料制成的具有杀线虫活性的几丁质-蛋白质复合物的，和主要包括不溶性脱矿质几丁质组分和与之复合的蛋白组分的物质组成。该复合物基本上是上述废料酸水解时形成的，和脱除了低分子量肽、氨基酸和氯化钙盐的复合物。该复合物的特性是a)Lorwy蛋白质含量至少约为50重%，灰分含量不大于15重%，水含量低于10重%(基于总组成)。b)溶解度性质与几丁质的溶解度性质相似，在稀酸溶液中不溶解，但在浓无机酸溶液中溶解，且使大量蛋白质组分破坏。c)红外光谱与几丁质的红外光谱相似，不同的是特点超吸收谱带为1738厘米-1。d)水不溶的含乙酰基脱矿质几丁质组分与几丁质的基本相同，基本上不含碳酸盐和含约不大于15%的几丁质灰分，特征红外吸收谱带为1550厘米-1。e)具有氨基酸组成的水不溶蛋白组分基本上与未处理含几丁质废料的蛋白组分相同，由十二烷基硫酸钠凝胶电泳法测得的分子量范围为10000～50000道尔顿，基本上不溶于普通的蛋白质溶剂。f)该复合物是干的粒子，粒径约小于0.5毫米。
2.按照权利要求
1的组成，它的Lowry蛋白质含量最低约为70重%，灰分含量不大于5%，水含量约不低于5重%(基于总组成)。
3.按照权利要求
1的组成，它在外形上是磨碎的固体。
4.一种由植物生长培养基和与之混合的、杀线虫有效量的、合乎权利要求
1的几丁质-蛋白质复合物配成的物质组成。
5.按照权利要求
4的组成，其中的植物生长培养基是土壤。
6.按照权利要求
5的组成，其中的植物生长培养基是适用作植物营养料的植物用罐装土壤。
7.按照权利要求
6的组成，其中的植物生长培养基是用于种植对线虫干扰敏感的活植物。
8.按照权利要求
4的组成，其中的植物生长培养基是粒状的非有机物质。
9.按照权利要求
8的组成，其中的植物生长培养基是展平的云母。
10.按照权利要求
8的组成，其中的植物生长培养基是用于种植对线虫干扰敏感的活植物。
11.按照权利要求
8的组成，为了提高该几丁质-蛋白质复合物的杀线虫活性，可在其中加入有效量的真菌(Harposp-orium类)。
12.一种抑制在能支持腐蚀寄生线虫生长的植物生长培养基中腐蚀寄生线虫生长的方法。这种方法是将合乎权利要求
1的、干扰线虫有效量的几丁质-蛋白质复合物与上述植物生长培养基混合，以抑制线虫生长。
13.按照权利要求
12的方法，其中的植物生长培养基是土壤。
14.按照权利要求
12的方法，其中的植物生长培养基是粒状的无机物。
15.按照权利要求
12的方法，其中的植物生长培养基是生长营养料。
16.按照权利要求
12的方法，其中的杀线虫有效量的几丁质-蛋白质复合物是与植物生长培养基混合使用。
17.按照权利要求
16的方法，其中的干扰线虫有效量最低约为植物生长培养基的5重%。
18.一种由合乎权利要求
1的、杀线虫有效量的几丁质-蛋白质复合物和与之相混合的适用于园艺的载体配成的杀线虫组成。
19.按照权利要求
18的组成，它在外形上是磨碎的固体。
20.按照权利要求
18的组成，其中的载体是含土壤的调节剂。
专利摘要
由甲壳纲类的含几丁质生物废料制造几丁质-蛋白质复合物。这种复合物不同于几丁质和脱乙酰壳多糖，具有对农业和园艺有用的干扰和杀线虫活性。应用方法是将杀线虫有效量的复合物与植物生长培养基混合。此复合物还提供一种慢性释放氮源，使得它特别适宜于与肥料和土壤调节剂联合使用。
文档编号C05F1/00GK85104021SQ85104021
公开日1987年1月14日 申请日期1985年5月22日
发明者罗伯特·奥斯汀·米尔殊, 拉塞尔·J·麦坎德利什, 巴巴拉·J·伊斯特伍德 申请人:Igi生物科技公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan