专利名称：一种治疗树线虫病的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗或防止树线虫感染例如松树萎蔫病(松树线虫病)的杀线虫剂的组合物，以及一种使用杀线虫剂的组合物治疗或预防树线虫病感染的方法。
森林的生态系统是一个复杂多样的系统。其受到各种各样的害虫侵扰，包括昆虫，线虫，病毒，真菌和螨。松树林，特别是日本的红松林，黑松林和硫球的松林被一种由松树木线虫Bursaphe-lenchus xylophilus所引起的松树萎蔫病所侵扰。
松木线虫是通过Cerambycid种的甲壳虫为传染媒介的，已发现与Bursaphelenchus xylophilus有关的至少八种Cerambycid。其中一种Monochamus alternatus是日本Bursaphelenchus xylophilus的主要载体(Mamijya，JARQ，Vol.10，No.4，206-211，1976)。
已进行了一些控制松树木线虫的努力。例如，日本专利申请公开No.S57-57442公开了一种控制线虫Bursaphelenchus xylophilus的方法，其包括通过将噻烯氢嘧啶或其水溶性酸加成盐引入松树的树干而使噻烯氢嘧啶或其水溶性酸加成盐与所述线虫接触，从而控制松树萎蔫病。但是，在该专利中公开的杀线虫剂的杀线虫活性不够大，因此对松树的给药量很大。这样，当使用注射或输注法给予活性成分时，需在树干上凿许多的洞给药。当然，从被治疗的松树的健康的角度看减少洞的数量更好。另外，日本专利申请公开No.H06-37501(美国专利5,089,480)公开了一种治疗或预防人体或动物体寄生虫感染的组合物，其含有抗寄生虫有效量的阿凡曼菌素衍生物。但是，该专利中没有教导或建议使用这些化合物来治疗或预防树的线虫感染，如萎蔫病。
鉴于上述情况，如果能提供一种对树线虫(如松树线虫)具有更高杀线虫活性的杀线虫剂将是很合乎需要的。
本发明提供了一种治疗或预防树线虫感染的杀线虫剂组合物，其含有以下通式的化合物 其中R单独是氢；R1单独是氢或羟基；R和R1一起代表一个双键；R2是C3-8环烷基；R3是氢或甲基，及惰性载体。
本发明的杀线虫组合物用于杀死或消灭树线虫，如松树木线虫，即引起松树萎蔫病的Bursaphelenchus xylophilus线虫，因此可用于治疗或预防线虫感染如松树萎蔫病。因此，本发明也提供了一种治疗或预防树线虫感染的方法，其包括将上述杀线虫组合物对树给药。
本发明提供了一种比常规的杀线虫剂具有更高杀线虫活性，特别针对松树线虫的杀线虫组合物。与常规的杀线虫剂相比，其具有更高的杀线虫活性，因此可减少对树给药的有效成分量，从而也减少了注射或输注方法时树干上洞的数量。因此，根据本发明，可提供一种治疗或预防树线虫感染(如松树萎蔫病)的更好的方法。本发明的杀线虫组合物包括上述通式(I)化合物作为活性成分。通式(I)化合物在日本专利申请公开No.H06-37501(美国专利No.5089480)中有详细描述，包括其的制备过程。如果简要描述该制备过程，通式(I)化合物可通过一种包括将适当的环烷羧酸或其盐、酯或酰胺或者氧化前体加入可产生有机体(例如Steptomyces avermitilisATCC 31267，31271或31272)的阿凡曼菌素发酵液中。适当的酸的实例包括环丙烷羧酸、环丁烷羧酸、环戊烷羧酸、环己烷羧酸和环辛烷羧酸。在一个优选的方案中，在环己烷羧酸钠盐的存在下进行发酵，得到通式(I)化合物，其中R是氢；R1是羟基；R2是环己基；R3是甲基。可使用Kokoku H06-37501中所述的常规化学修饰反应将R、R1或R3修饰成适宜的基团。例如，R和R1一起代表一个双键的通式(I)化合物可通过将R是H及R1是OH的通式(I)化合物进行已知的脱水反应。R3为H的通式(I)化合物可通过已知的脱甲基反应从R3为甲基的通式(I)化合物制得。
本发明的一个优选的方案中，杀线虫组合物包括R和R1一起代表一个双键，R2是环己基，R3是氢的通式(I)化合物，R是氢，R1是羟基，R2是环己基，R3是氢的通式(I)化合物。本发明最优选的组合物包括由下式代表的化合物 杀线虫组合物中通式(I)化合物的含量可以根据该化合物的活性、待治疗树的状况、待治疗树的周围环境等等的不同而不同。一般地，通式(I)化合物的含量可以是0.001至70重量百分数，优选0.005至30重量百分数，更优选0.01至10重量百分数(基于组合物的总重)。
如果需要，本发明的杀线虫组合物可含有另外的活性成分例如阿凡曼菌素或其盐、左咪唑和二己基硫蒽。
本发明的杀线虫组合物包括一种液态或固态的惰性载体。惰性载体意指一种不或与活性成分反应的物质，并且其可对待治疗的树安全给药。适当的惰性载体为液态形式(例如溶剂)，因为杀线虫组合物通常是以注射或输注的方法对松树给药。适当的溶剂是对树无毒，并且具有等于或小于水的粘度，同时可溶解所用的活性成分。适当的溶剂包括，例如水、芳香烃(如苯、甲苯和二甲苯)、醇(如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)、酯(如乙酸乙酯、二恶烷和四氢呋喃)、卤代烃(如二氯甲烷、氯仿和二氯乙烷)、酰胺(如N，N-二甲基甲酰胺)、腈(如乙腈)。特别适当的溶剂包括水、甲醇、丙酮、己烷、乙腈及其混合物。最适当的溶剂为水和甲醇的混合物，因为其可有效地溶解本发明通式(I)混合物。水和甲醇的比可从0.1∶99.9至60∶40，优选从5∶95至50∶50。
当以液态形式使用杀线虫组合物时，杀线虫组合物溶液中活性成分的浓度大大不同，即从稀(约0.01％)到浓或者甚至饱和溶液。但是，从实用的角度看，优选使用具有0.001％至40％浓度的杀线虫组合物，更优选0.002％至20％，特别是0.004％至10％。可将杀线虫组合物溶液用于树，这样树中活性成分的浓度可以是0.1至300ppm的范围，优选0.3至100ppm，更优选0.5至50ppm。
在使用杀线虫组合物前，鉴于操作方便，其可为一种含有所需量活性化合物的固体制剂。该固体制剂能在注射或输注方法中溶于或分散于上述溶剂中。通过将活性成分与适当的细分固体载体(例如滑石、硅藻土、碳酸钙、膨润土或豆粉)及其它所需添加剂均匀混合制备固体制剂。用于本发明的添加剂是农药中所用的任何已知添加剂，例如填料、崩解剂及粘合剂(包括淀粉、乳糖、滑石、硬脂酸镁和植物胶)。
治疗或预防树线虫感染的方法如下所述。
根据本发明的方法，受线虫感染的树(例如患萎蔫病的松树)可以用上述杀线虫组合物治疗。可用本发明方法治疗的适当的树包括松树，例如日本红松(Pinus densiflora)、黑松(P.thunbegii)和Ryukyu松(P.Luchuensis)。
用本发明杀线虫组合物治疗树可通过将杀线虫组合物给予或引入待治疗树的树干中而进行。对树干给药通常是通过本领域专业人员已知的注射或输注方法完成的。在这种情况下，杀线虫组合物应是液体形式，其由本发明通式(I)化合物和可溶解所述化合物的溶剂组成。可用重力或压力装置将杀线虫组合物对树干给药。可在树上的多个位置进行注射或输注。多个输注位置能在最短时间内注入足量的杀线虫组合物而避免树汁液渗出的干扰。
根据待治疗树所在的环境，在适当的时间将杀线虫组合物给药。在日本，在M.alternatus(Bursaphelenchus xylophilus的主要载体)的生命循环时间之前当其到达发育的dauerlarvae的阶段将杀线虫组合物给药是适宜的。为保证持续保护松树，应每年给药。
当使用输注方法时，可将适当量的杀线虫组合物在两小时或更短的时间内输注到树干中。大于此的输注时间通常会遇到树汁液渗出的麻烦，其干扰输注进程。使用压力技术给药可使这种困难最小化或者甚至消除这种困难。
杀线虫组合物的效果通过下述实施例确定其杀死或麻痹线虫的效力来证实。
实施例本发明参考下列实施例及比较实施例进一步详细描述。
实施例1至11线虫(Bursaphelenchus xylophilus)从生长在日本Chiba-Ken的松树样品中分离。将100个线虫滴入含有1毫升蒸馏水的陪替氏培养皿中。
将本发明的通式(I)化合物(其中R和R1一起代表一个双键，R2是环己基，R3是氢；化合物B1)溶于水和甲醇的混合液中，得到11个杀线虫组合物溶液，每个具有4.6至0.005g/ml的浓度(甲醇浓度为0.94至0.001％)，如表1所示。
将1毫升每个检测组合物与1毫升含有100个线虫的线虫悬浮液混合，在25℃致敏24小时。致敏后，将混合液于37℃保温，将2毫升转入划有格子的陪替氏培养皿中(直径为4.5厘米)，在16倍的体视显微镜下观察。
所用的线虫(成虫和幼虫-3)分为3组(用针尖刺)没有效果，麻痹和死亡组，并且计数每组的线虫数目。
测试结果示于表1中。比较实施例1至6以及参考实施例1至2将酒石酸噻烯氢嘧啶溶于水和甲醇的混合液中，得到6个浓度为4.6至0.15μg/ml(甲醇浓度为0.94至0.03％)的杀线虫组合物溶液，如表1所示。
将1毫升每个检测组合物与1毫升含有100个线虫的线虫悬浮液混合，在25℃遮蔽致敏24小时。作为对照(参考实施例1至2)，分别将1毫升水和1毫升0.94％的甲醇与1毫升线虫悬浮液混合，并在25℃致敏24小时。
致敏后，重复实施例1中使用的相同步骤以分析检测组合物的效力。测试结果也示于表1中。表1(对Bursaphelenchus xylophilus的效力)
表1(对Bursaphelenchus xylophilus的效果)
<p>从表1可看出，在实施例1至11中，未观察到无效力线虫的浓度高于0.15μg/ml，未观察到死亡线虫的浓度低于0.005μg/ml。在比较实施例1至6中(使用酒石酸噻烯氢嘧啶)，未观察到无效力线虫的浓度比2.3μg/ml噻烯氢嘧啶高(3.9μg/ml酒石酸噻烯氢嘧啶)，未观察到死亡线虫的浓度低于0.15μg/ml。
因此，将实施例中无效力线虫与比较实施例中的相比，本发明组合物显示出在低于酒石酸噻烯氢嘧啶组合物15倍浓度的杀线虫活性。这样，证明了本发明杀线虫组合物具有比常规杀线虫组合物更显著的杀Bursaphelenchus xylophilus效果。
实施例12和13为测量本发明通式(I)化合物(其中R是氢，R1是羟基，R2是环己基，R3是氢；化合物B1)的杀线虫活性，进行下述实验。
按下述方式制备所用线虫悬浮液。从农业部、林业部和渔业部通用森林实验室(General Forest Laboratory of the Ministry of Agricu-ture，Forestry and Fisheries)获得的Bursaphelenchus xylophilus用作种线虫。将Botrytis cinerea在约22℃于大麦培养基中孵育约10天形成菌落。将种线虫移植到菌落中，在约27℃培养约10天。在无菌水中悬浮培养基和线虫混合液，并且通过Baermann funnel技术分离30到60分钟而收集线虫悬浮。只有非原生体雌性成虫通过无菌针从线虫悬浮液钓取以用作线虫样品。
将每个化合物B2(50mg)和化合物B1(50mg)溶于甲醇中制备标准溶液(2500μg/ml)。将每个标准溶液用甲醇稀释制备5份不同浓度的样品溶液(0.04μg/ml，0.2μg/ml，1.0μg/ml，5.0μg/ml和25.0μg/ml)。
将无菌水(5.0ml)倒入Syracuse watchglass，用上述制备的每个样品溶液取代50升无菌水。将从线虫悬浮液中钓取的30份线虫样品浸入Syracuse watchglass中的每个样品溶液。把这些Syracusewatchglass置于约25℃的恒温器中约24小时。
然后，在显微镜下通过刺激确定线虫的死亡率、病态率和麻痹率。在没有用无菌针刺激时，头部间歇性移动的线虫认为是被麻痹了。只有在用针刺激后移动的线虫认为是病态。在用针刺激后，没有移动并且没有反应的线虫认为是死亡。用死亡、病态和麻痹的线虫总数除以30而得到死亡率、病态率和麻痹率。测试结果示于表2中。
从表2中可看出，化合物B2确实显示出与化合物B1相似的杀线虫活性。
实施例14和比较实施例7为测量化合物B1和化合物B2混合物的杀线虫活性，进行下述实验。
用与实施例12相同的方式制备所用的线虫悬浮液。
用于本实验的标准样品溶液含有浓度为83.5％的甲醇、22μg/ml的化合物B1及275μg/ml的化合物B2。将标准样品溶液用无菌水连续稀释制备5，10，50，100，500，1000，2500和5000倍稀释的样品溶液。将从线虫悬浮液中钓取的30份线虫样品浸入Syracusewatchglass中的每个样品溶液。把这些Syracuse watchglass置于25℃的恒温器中24小时。然后，用与实施例12类似的方式调查死亡率和病态率。结果示于表3中。
表3
从表3可看出，化合物B1和B2确实显示出良好的杀线虫活性。
权利要求
1.一种治疗或预防树线虫感染的杀线虫组合物，其含有下列通式的化合物 其中R单独是氢；R1单独是氢或羟基；R和R1一起代表一个双键；R2是C3-8环烷基；R3是氢或甲基，及惰性载体。
2.权利要求1的杀线虫组合物，其中R和R1一起代表一个双键；R2是环己基，R3是氢。
3.权利要求1的杀线虫组合物，其中R是氢，R1羟基，R2是环己基，R3是氢。
4.权利要求2或3的杀线虫组合物，其中惰性载体是水、甲醇、丙酮、己烷，乙腈或其的混合物。
5.权利要求2或3的杀线虫组合物，其含有0.001至70重量百分数的通式(I)化合物和99.999至30重量百分数的惰性载体。
6.权利要求1的杀线虫组合物，其中的线虫感染是由松树线虫Burasphelenchus xylophilus引起的。
7.一种治疗或预防树线虫感染的方法，其包括用权利要求1的杀线虫组合物治疗待治疗树。
8.权利要求7的方法，其中用注射法或者输注法来治疗树。
全文摘要
本发明提供了一种治疗或预防树线虫感染(如松树萎蔫病)的杀线虫组合物，其含有下列通式的化合物其中R单独是氢；R
文档编号A01N43/90GK1137345SQ9512013
公开日1996年12月11日 申请日期1995年12月26日 优先权日1994年12月27日
发明者H·梅基, K·尤奇达, K·尤美赫拉 申请人:辉瑞大药厂