一种对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌、生防制剂及其制备方法与流程

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种链霉菌、生防制剂及其制备方法。

背景技术：

大豆(Glycine max)属于重要的经济作物，含有丰富植物蛋白质，用来做各种豆制品、榨取豆油、酿造酱油和提取蛋白质。豆渣或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜饲料。大豆生产中受到多种病害侵害。大豆疫病又叫大豆疫霉根腐病，由大豆疫霉(Phytophthorasojae)侵染导致的卵菌病害，是一种传播速度快，危害面积大，不易防治的多循环土传病害。是大豆生产上的危险性病害，被公认为是继大豆胞囊线虫病害之后的第二大严重大豆病害。由大豆疫霉根腐病引起的苗期死株率轻则10％，重则80-90％，大田发生该病甚至造成局部地块绝产。目前利用甲霜灵进行化学防治作为其主要手段，但是防治效果不理想，同时大豆疫霉对甲霜灵的抗药性问题也日益严重。利用土壤微生物防治病害是综合防治土传病害的重要措施之一。已报道的有用于防控连作草莓根腐病的拮抗放线菌吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)及其生防制剂(CN 104403976A)，用于黄瓜枯萎病防治的白色链霉菌(Streptomyces albus)和暗黑链霉菌(Streptomyces tenebrarius)的发酵产物(CN 104342389 A)，用于防治马铃薯晚疫病菌、黄瓜疫霉、辣椒疫霉或烟草黑胫病菌导致病害的湿链霉菌(Streptomyces humidus)的发酵产物(CN 103361294 A)。

生物防治技术具有环境友好、安全、不易产生抗药性和高效等多种优点，是实现农业可持续的有效方法之一，利用生物制剂来防治根腐病是目前的研究热点。目前用的比较好的大豆根腐病生防菌剂，主要是生物制剂埃拇泌(一种放线菌颗粒剂)，防治镰刀菌和紫青霉菌；淡紫拟青霉菌剂，防治镰刀菌等真菌病害。目前利用链霉菌菌剂防治卵菌病害的报道并不多，尤其是有效的针对大豆疫霉的链霉菌菌剂还很少报道。

技术实现要素：

为了解决背景技术中提出的技术问题，本发明提供一种对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌、生防制剂及其制备方法。

该对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌为多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4，该菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.11789，保藏日期为2015年12月4 日。

所述的对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌的生防制剂，其特征在于：该生防制剂为将权利要求1所述的多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4扩大培养后接种到以黄豆饼粉和麦麸为主要原料的发酵培养基中进行发酵培养得到孢子总数≥10¹⁰个/g的生防制剂。

所述的对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌的生防制剂的制备方法包括以下步骤：(1)菌种的扩大培养：取多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4菌株的分生孢子，接种到液体种子培养基中，摇床培养得到链霉菌液体种子，摇床培养的条件为温度28～30℃，转速180r/min，培养时间48h；所述的液体种子培养基的配方为：酵母提取物4g/L、葡萄糖4g/L、麦芽抽提物10g/L，CaCO₃ 2g/L，pH值7.2～7.4；(2)生防制剂的制备：将黄豆饼粉和麦麸按质量比1：1混合均匀后调节含水率至50％～60％、pH值至7.5～8，得到基质；向每千克基质中添加5g CaCO₃，混匀后，装入发酵瓶中121℃灭菌20min，然后按质量比10％-15％的比例接入步骤(1)制得的菌液，28℃～30℃、搅拌速度50～70rpm发酵培养5～7天，制得生防制剂。

所述的多伦湖链霉菌M1-4菌剂对引起大豆疫霉根腐病的主要病原菌，包括大豆疫霉(P.sojae)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporun)具有较强抑制效果，另外对其他病原菌同样具有抑制作用，例如燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)、小麦赤霉菌(FusariumGraminearu)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)。多伦湖链霉菌M1-4主要是通过其发酵产生的次级代谢产物对大豆疫霉产生拮抗作用。

所述的对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌的生防制剂防治大豆疫霉根腐病的盆栽应用试验结果表明，生防制剂对苗期大豆疫霉根腐病的防效为70％以上，效果较好。该生防制剂能够有效防治大豆病害，避免了化学农药施用所带来的一系列问题，有利于大豆的无公害生产，提高大豆品质，降低农药使用投入，节省开支，同时保护土壤和环境安全。

附图说明

图1为多伦湖链霉菌M1-4对大豆疫霉病菌的抑制作用的对照图；

图2为多伦湖链霉菌M1-4对大豆疫霉病菌的抑制作用的效果图；

图3为多伦湖链霉菌M1-4对尖孢镰刀菌的抑制作用的对照图；

图4为多伦湖链霉菌M1-4对尖孢镰刀菌的抑制作用的效果图；

图5为多伦湖链霉菌M1-4对镰孢菌的抑制作用的对照图；

图6为多伦湖链霉菌M1-4对镰孢菌的抑制作用的效果图；

图7为多伦湖链霉菌M1-4对小麦赤霉菌的抑制作用的对照图；

图8为多伦湖链霉菌M1-4对小麦赤霉菌的抑制作用的效果图；

图9为多伦湖链霉菌M1-4对禾谷镰孢菌的抑制作用的对照图；

图10为多伦湖链霉菌M1-4对禾谷镰孢菌的抑制作用的效果图；

图11为多伦湖链霉菌M1-4对大豆疫霉盆栽防效试验的对照图；

图12为多伦湖链霉菌M1-4对大豆疫霉盆栽防效试验的效果图；

图13为多伦湖链霉菌M1-4菌株系统发育树图；

图14为多伦湖链霉菌M1-4显微图片；

图15为多伦湖链霉菌M1-4菌落图片。

具体实施方式

下面结合实施例和实验对本发明作进一步说明：

本发明的对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌为多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4，该菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.11789。

该多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4的筛选方法，包括如下步骤：

(1)从湖泊采集底泥样品，在阴暗通风处晒干，用研钵研磨成粉末；

(2)利用稀释法进行分离，将土样放入装有玻璃珠和无菌水的瓶中，震荡，静置后，稀释，制备质量浓度为10^-3、10^-4、10^-5稀释液，吸取稀释液滴加到加入放线菌酮(50μg/ml)和萘啶酮酸(40μg/ml)的高氏一号培养基平板上，涂布均匀，将培养皿放在温箱倒置培养，生长温度28℃，培养5～7天，分离纯化；

(3)采用平板对峙法筛选对大豆疫霉菌有抑制作用的放线菌：将纯化的放线菌菌株，用高氏一号培养基培养，将放线菌转接到胡萝卜培养基中心位置，用Φ9cm培养皿培养3天；大豆疫霉菌在胡萝卜培养基上培养4～5天后，裁成Φ0.5cm菌丝块，接种到含胡萝卜培养基的培养皿四周十字交叉线位置，培养7～10天后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的放线菌，保存；

(4)菌株的分子学鉴定：提取步骤(3)得到的菌株的DNA，利用通用引物27f和1492r扩增其16S rDNA，PCR产物经纯化测序，获得全长序列进行系统发育分析。首先在Ezbio Cloud网站进行序列相似性分析，发现其与已报道的湿链霉菌(Streptomes humidus)相似性最高，98.82％。然后利用MEGA软件构建系统发育树，见图13。由系统发育树可知该菌株与Streptomyces humidus不在同一分支，与Streptomyces edernsis等菌株聚在一起，亲缘关系较近。推测该菌为链霉菌属新种，并将其命名为多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis) M1-4。

多伦湖链霉菌M1-4菌株形态、培养特征观察:肉眼观察划线接种在不同培养基平板上气生菌丝、基内菌丝和可溶性色素的颜色变化，取成熟期的颜色作为定种的依据，见表1及图15。使用ISP3培养基培养一个月，利用扫描显微镜TM3030(5000×)菌丝有发达分支(见图14)，孢子长卵圆形。

表1多伦湖链霉菌M1-4菌株的培养特征

注：-表示不产生可溶性色素

多伦湖链霉菌M1-4菌株生理生化特征鉴定：可以使明胶液化；可产生H₂S；纤维素水解实验表明其具有较强的纤维素降解能力。NaCl耐受范围为0～4.0％。pH值耐受范围4～10，最适pH值为7。最适温度28℃。碳源、氮源利用实验结果见表2、表3。

表2多伦湖链霉菌M1-4与其近缘种碳源利用差异比较表

注：N表示没有数据

表3放线菌多伦湖链霉菌M1-4与其近缘种氮源利用差异比较

注：N表示没有数据

多伦湖链霉菌M1-4拮抗作用鉴定：将多伦湖链霉菌M1-4接种到胡萝卜培养基中间，28℃培养3d，第四天在其四周对称位置接种大豆疫霉，28℃培养7～10d，测量抑菌直径。M1-4对大豆疫霉的抑制作用的对照图见图1，效果见图2，测量抑制半径为17.76mm。同样采用对峙法利用PDA培养基测多伦湖链霉菌M1-4对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporun)、燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)、小麦赤霉菌(FusariumGraminearu)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等有强烈抑制作用。抑制半径分别为14.49mm、5.56mm、5.18mm、15.94mm，其中，图3、图5、图7、图9为对照图，图2、图4、图6、图8、图10为效果图。

所述的对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌的生防制剂为将多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4扩大培养后接种到以黄豆饼粉和麦麸为主要原料的发酵培养基中进行发酵培养得到孢子总数≥10¹⁰个/g的生防制剂。

所述的对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌的生防制剂的制备方法(一)：

(1)菌种的扩大培养：取多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4菌株的分生孢子，接种到液体种子培养基中，摇床培养得到链霉菌液体种子，摇床培养的条件为温度28℃，转速180r/min，培养时间48h；所述的液体种子培养基的配方为：酵母提取物4g/L、 葡萄糖4g/L、麦芽抽提物10g/L，CaCO₃ 2g/L，pH值7.2；

(2)生防制剂的制备：将黄豆饼粉和麦麸按质量比1：1混合均匀后调节含水率至50％、pH值至7.5，得到基质；向每千克基质中添加5g CaCO₃，混匀后，装入发酵瓶中121℃灭菌20min，然后按质量比10％的比例接入步骤(1)制得的菌液，28℃℃、搅拌速度50rpm发酵培养5天，制得生防制剂。生防制剂中多伦湖链霉菌M1-4孢子总数10¹⁰个/g所述的对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌的生防制剂的制备方法(二)：

(1)菌种的扩大培养：取多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4菌株的分生孢子，接种到液体种子培养基中，摇床培养得到链霉菌液体种子，摇床培养的条件为温度30℃，转速180r/min，培养时间48h；所述的液体种子培养基的配方为：酵母提取物4g/L、葡萄糖4g/L、麦芽抽提物10g/L，CaCO₃ 2g/L，pH值7.4；

(2)生防制剂的制备：将黄豆饼粉和麦麸按质量比1：1混合均匀后调节含水率至60％、pH值至8，得到基质；向每千克基质中添加5g CaCO₃，混匀后，装入发酵瓶中121℃灭菌20min，然后按质量比15％的比例接入步骤(1)制得的菌液，30℃、搅拌速度70rpm发酵培养7天，制得生防制剂。生防制剂中多伦湖链霉菌M1-4孢子总数10¹⁰个/g。

所述的对大豆疫霉根腐病病菌具有抑制作用的链霉菌的生防制剂的制备方法(三)：

(1)菌种的扩大培养：取多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4菌株的分生孢子，接种到液体种子培养基中，摇床培养得到链霉菌液体种子，摇床培养的条件为温度29℃，转速180r/min，培养时间48h；所述的液体种子培养基的配方为：酵母提取物4g/L、葡萄糖4g/L、麦芽抽提物10g/L，CaCO₃ 2g/L，pH值7.3；

(2)生防制剂的制备：将黄豆饼粉和麦麸按质量比1：1混合均匀后调节含水率至55％、pH值至7.8，得到基质；向每千克基质中添加5g CaCO₃，混匀后，装入发酵瓶中121℃灭菌20min，然后按质量比12％的比例接入步骤(1)制得的菌液，29℃、搅拌速度60rpm发酵培养6天，制得生防制剂。生防制剂中多伦湖链霉菌M1-4孢子总数10¹⁰个/g。

多伦湖链霉菌M1-4大豆疫霉根腐病生防制剂盆栽防效试验：

考察多伦湖链霉菌M1-4生物制剂防控大豆疫霉根腐病土传病害的能力。试验设计对照(试验土壤，CK)和处理组(试验土壤+生防制剂)。大田土壤接入大豆疫霉病菌1号生理小种作为试验对照土壤。大豆疫霉菌经固体培养5d后，接入V8液体培养基中，黑暗条件下28℃培养5天，倾出液体培养基，菌丝称重，按10g/公斤土壤的量接入。处理组用接有大豆疫霉菌的土壤，按10g/公斤土壤比例接入多伦湖链霉菌M1-4生防制剂。将对照和处理分别装盆，每盆装入500g土壤，播种10粒东农42种子(1号生理小种敏感)，保苗6株，重复4次。 在盆钵中生长至35天取样统计发病程度，计算病情指数，测定植株总鲜重，根鲜重考察促生效果，见图11及图12。

盆栽施加多伦湖链霉菌M1-4处理，表现出较好的防治效果，其发病率防治效果70％以上，同时施加多伦湖链霉菌M1-4生防制剂使大豆茎叶鲜重、根鲜重分别增加了120％和184％，具有明显的促生作用，见表4。

表4温室盆栽实验各处理对大豆疫霉根腐病防治效果、大豆生长的影响

注:大豆疫霉根腐病发病程度分为6级。0级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片正常；2级为30％<根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％<根系发病率≤80％；叶片变黄，4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎，5级为整株死亡，叶片干枯。

病情指数和防治效果分别按照下列公式计算:病情指数＝[(病级株数x代表值)/(总株数x最高病级代表值)]x100。防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]x100％。

多伦湖链霉菌M1-4大豆疫霉根腐病生防制剂田间试验：

多伦湖链霉菌M1-4生防制剂田间防治试验在大豆重茬地和农科院育种基地进行，试验对照施用无生防制剂的发酵黄豆饼粉和麦麸，处理施用多伦湖链霉菌M1-4，施用量为6000kg/ha，大豆品种采用东农42，小区设5米4垄，垄宽65cm，每处理4个重复。在大豆V3、V5、R1、R3、R5和成熟期调查发病率、生物产量等数据，统计发现M1-4生防制剂可显著降低大豆疫霉病的发病率和提高大豆产量，见表5。

表5田间各处理对大豆疫霉根腐病防治效果

本发明从利用生物农药拮抗微生物开展大豆病害防治这一关键问题着手，研制出一种能显著降低大豆疫霉根腐病发生的多伦湖链霉菌M1-4生防制剂，大田防治率达60％以上。本生防制剂的作用机制在于本制剂中的拮抗放线菌具有较好的拮抗作用，产生拮抗物质，抑制大豆根际病原微生物的生长。另一方面，发酵本生防制剂的基质为麦麸、黄豆饼粉等易得且便宜的原材料，大大降低了生防制剂的成本，防效也较好。