用于增强昆虫防治的基因修饰的昆虫病毒和化学、生物学杀虫剂的混合物的制作方法

专利名称：用于增强昆虫防治的基因修饰的昆虫病毒和化学、生物学杀虫剂的混合物的制作方法
发明的领域本发明涉及抗昆虫的杀虫剂组合物，其包含用于增强昆虫防治的基因修饰的病毒和化学、生物学杀虫剂的混合物。
发明的背景防治侵害市售谷物的害虫已是各种处理的主题。化学杀虫剂已被广泛使用，但是它们的使用上引起了各种关注。除了无益的靶昆虫类外，化学杀虫剂还可影响有益的昆虫类。昆虫有获得对这些化合物的抗性的倾向，因此需要发展新的化合物。化合物在使用后可在环境中持续一段时间。
在减少化学杀虫剂使用的一项努力中，利用昆虫特异性病毒攻击幼虫阶段的昆虫，昆虫特异性病毒包括DNA和RNA病毒。DNA病毒包括昆虫痘病毒(“EPV”)和杆状病毒科的诸如核型多角体病毒(“NPV”)、颗粒体病毒(“GV”)和杆状病毒亚科(Baculovirinae)的无包含体杆状病毒(“NOB”)等。
RNA病毒包括披膜病毒、黄病毒、微小核糖核酸病毒、胞浆多角体病毒(“CPV”)等。双链DNA病毒的亚科真杆状病毒亚科(Eubaculovirinae)，包括两属，NPV和GV，它们对于生物学控制特别有用，因为它们在其生活周期中产生包含体(“OB”)。
NPV的例子包括舞毒蛾NPV(吉普赛蛾NPV)、苜蓿银纹夜蛾MNPV、Syngrapha falcifera NPV(芹菜尺蠖NPV)、海灰翅夜蛾(Spodoptera litturalis)NPV、草地夜蛾NPV、甜菜夜蛾NPV、棉铃虫NPV、甘蓝夜蛾NPV、枞色卷叶蛾NPV、粉纹夜蛾NPV、Helicoverpa zea NPV，等等。GV的例子包括苹果小卷蛾GV(苹果蛾GV)、大菜粉蝶GV、粉纹夜蛾GV，等等。NOB的例子为Orcytes rhinoceros NOB和玉米夜蛾NOB。昆虫痘病毒的例子包括西方五月鳃角金黾子EPV、桑红缘灯蛾EPV、飞蝗EPV、迁徒蚱蜢EPV、沙漠蝗EPV、埃及伊蚊EPV、淡色摇蚊EPV，等等。
已有400余株杆状病毒分离株被描述存在于无脊椎动物。苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(“AcMNPV”)是杆状病毒科的原型病毒，有广泛的宿主范围。AcMNPV病毒最初分离于苜蓿银纹夜蛾(A.cal.)，一种鳞翅目的夜蛾(其成年阶段是夜蛾)，通常称作苜蓿尺蠖。这种病毒感染鳞翅目昆虫中的12个科、30余个种。但不知是否大量感染该目之外的任何种。
杆状病毒(例如AcMNPV)的生活周期包括两个阶段。生活周期的每一阶段以病毒的一种具体形态为代表无包含体的胞外病毒颗粒(“ECV”)和包含体病毒颗粒(“OV”)。胞外和包含体病毒形式有相同的基因组，但显示不同的生物学性质。病毒的每种形态的成熟均由各自的病毒基因指导，有些基因对每一形态是独特的。
人们发现，多病毒颗粒以其天然存在的昆虫感染形态包埋在称作包含体(“OB”)、也称作多角体包含体(“PIB”)的次晶蛋白质基质中。由蛋白质组成的病毒包含体称作多角体。多角体蛋白，其分子量为29KD，是主要的病毒编码的病毒包含体的结构蛋白(相类似地，GV产生OB，后者主要由颗粒体蛋白而非多角体蛋白组成)。
病毒包含体是天然杆状病毒生活周期的重要部分，它在易感性昆虫种间提供水平传递(昆虫至昆虫)方式。在环境中，易感性昆虫(通常为幼虫期)从污染的食物源(如植物)摄食病毒包含体。结晶包含体在易感性昆虫的肠中解离，释放出感染性病毒颗粒。这些多角体衍生的病毒(“PDV”)侵袭中肠组织细胞，并在其中复制。
据信，病毒颗粒通过胞吞或融合作用进入细胞，病毒DNA在核孔或核内脱壳。在6小时内检出病毒DNA复制。感染后约(“p.i.”)约10-12小时，通过胞外病毒(“ECV”)从细胞表面出芽而使继发感染曼延到其它昆虫组织。病毒的ECV形式与病毒在感染昆虫个体内细胞向细胞的扩散有关，也与细胞培养物中的传递感染有关。
在感染周期后期(感染后12小时)，在感染细胞中可检出多角体蛋白。直至感染后18-24小时，多角体蛋白才在感染细胞的核中装配，病毒颗粒则包埋在蛋白质组成的包含体中。当细胞裂解时，病毒包含体在4-5天中大量积聚。这些多角体在幼虫感染的扩散方面无活性作用。ECV散布在受感染的幼虫体内，导致幼虫死亡。
受感染的幼虫死亡时，无数多角体保留在分解的组织中，而ECV被降解。当其它幼虫暴露于多角体(如通过摄食污染的植物或其它食料)时，该周期则重复。
总之，病毒的包含体形态与昆虫通过肠的初期感染及病毒的环境稳定性有关。当PDV注射给予时基本上无传染性，而口服时则有高度传染性。病毒的非包含体形态(即ECV)与病毒的病毒血症和组织培养中细胞至细胞传染有关。ECV对于组织培养中的细胞或通过注射对昆虫体内组织有高度传染性，但口服给予时基本上无传染性。
这些昆虫病毒对脊椎动物或植物无致病性。而且，杆状病毒一般宿主谱窄，很多株限于一种或几种昆虫种。
杆状病毒用作生物杀虫剂是大有前途的。它们在农业上广泛使用的主要障碍之一是昆虫的初期感染与其死亡之间的时间滞后。这种滞后可从几天至几周。在此滞后期间，昆虫幼虫继续进食，引起对植物的进一步损害。很多研究者通过将异源基因插入病毒基因组以表达昆虫防治或修饰物质，如毒素、神经肽和激素或酶，来努力克服这一弊端。
然而，迄今尚未将作为害虫控制总计划一部分的这种基因修饰的昆虫病毒与化学杀虫剂合并使用。野生型昆虫病毒与化学杀虫剂的合用虽有报道，但由于野生型病毒(文献目录第1-5条目)的限制，其结果不是最合适的。研究者们还致力于用其它生物防治剂，如细菌(如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis))、真菌、原生动物和线虫，单独使用或与昆虫病毒或化学杀虫剂合用，但它们也未提供最适结果(2、3、5、6)。因此，有必要发展化学杀虫剂和基因修饰的昆虫病毒的联合应用，这将提供两种成分的优点，而通过基因修饰的昆虫病毒的使用来减少所用化学品的量，并减少用野生型病毒所得到的杀虫时间。
发明的概述本发明的目的是提供用于抗鳞翅目昆虫的杀虫剂组合物，其包含用于增强昆虫防治的基因修饰的病毒和化学、生物学杀虫剂的混合物。病毒的基因修饰包括插入表达昆虫防治或修饰物质如毒素、神经肽或激素、或酶的基因。病毒的基因修饰还包括基因缺失。
本发明提供杀虫剂组合物，包括(a)有效量的化学杀虫剂，选自由拟除虫菊酯、芳基吡咯、二酰肼和甲脒组成的化学品；(b)有效量的基因修饰的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(“AcMNPV”)，包括(i)表达Androctonus australis昆虫毒素(“AaIT”)的插入基因，或(ii)编码AcMNPV的脱皮甾类(ecdysteroid)UDP-葡糖基转移酶(“EGT”)的基因的缺失，其中，所述组合物用于抗鳞翅目昆虫，其条件为当昆虫为美洲棉铃虫、化学杀虫剂为甲脒时，基因修饰的AcMNPV包含表达AaIT的插入基因。
在一个实施方案中，本发明提供抗烟芽夜蛾(Heliothis virescens)昆虫的组合物，包括(a)有效量的化学杀虫剂，选自由拟除虫菊酯和芳基吡咯组成的化学品；和(b)有效量的基因修饰的AcMNPV，包括(i)表达AaIT的插入基因，或(ii)编码AcMNPV的EGT的基因的缺失。
在另一个实施方案中，本发明提供抗玉米夜蛾昆虫的杀虫剂组合物，包括(a)有效量的化学杀虫剂，选自由芳基吡咯和二酰肼组成的化学品；和(b)有效量的基因修饰的AcMNPV，包括(i)表达AaIT的插入基因，或(ii)编码AcMNPV的EGT的基因的缺失。
在另一个实施方案中，本发明提供抗玉米夜蛾昆虫的杀虫剂组合物，包括(a)有效量的化学杀虫剂，选自由甲脒组成的化学品；和(b)有效量的基因修饰的AcMNPV，包含表达AaIT的插入基因。
本发明还提供用于防治包括鳞翅目昆虫的方法，包括对所述昆虫或作物投药，其中所述昆虫喂饲上述杀虫剂组合物。
附图的简要说明


图1是下面的表13所示数据的图解说明，即除了表13中“未处理校正”数据在
图1中未绘出之外，绘出了表13所述前三种处理的一天、4天和10天的死亡百分率。
图2是下面的表14所示数据的图解说明，即除了表14中“未处理校正”数据在图2中未绘出之外，绘出了表14所述前三种处理的一天、4天和10天的死亡百分率。表14中的＂AcMNPV AaIT-ins＂与
图1中的＂rNPV＂相同。
发明的详述诸如鳞翅目昆虫在其从卵到成虫的发育过程中经历特征性很强的活动顺序。在卵孵化后，昆虫幼虫进入大量进食阶段。在此时期，它蜕皮数次以便继续生长。相继的蜕皮之间的虫期称作龄期。幼虫生长期末，幼虫化蛹和羽化成为成虫。本发明的目的是加强对幼虫期传播疾病的昆虫的防治。已知是重要的作物害虫的鳞翅目一些科包括夜蛾科、天社蛾科、灯蛾科、螟蛾科、菜蛾科、粉蝶科和尺蛾科。
两个标准被用来测定杀虫剂组合物是否提供对昆虫害虫的有效防治。一个是在一段时间内杀灭的幼虫数，指“死亡百分率”。另一个是杀灭速度。即使最后时期死亡百分率不改善，如果早期阶段有更多幼虫被杀灭，在更少进食时间因而对作物较少损害上也是有利的。因此，如果死亡百分率或杀灭速度改善，受试组合物可说是比现有组合物有改进。
基因修饰的昆虫病毒与化学或生物学杀虫剂合用，如果合用的死亡率大于单个成分分别用的总和，则称作“协同”，如果合用的死亡率等于单个成分分别用的总和，则称作“相加”，如果合用的死亡率大于单个成分分别使用，则称作“亚相加”，如果合用的死亡率小于单个成分分别使用，则称作“拮抗”。
当合用产生协同或相加时则获利。甚至当合用产生相加时，与分别使用的剂量相比，通过减少一种或两种成分的剂量，成本有所节约，对环境也有利，如减少化学杀虫剂的量，这减少存留和耐药性的发生。
杀虫剂组合物如果对敏感和/或半敏感昆虫增强防治作用，则是有益的。敏感昆虫比半敏感昆虫对昆虫或化学杀虫剂一般易感100-1,000倍。例如，烟芽夜蛾对AcMNPV敏感，而玉米夜蛾对AcMNPV半敏感。
本发明的附属优点是化学杀虫剂和昆虫病毒的合用比起各个成分单用可有更多类型昆虫被击中。化学杀虫剂和昆虫病毒均有特殊的宿主谱。合用因有两种成分的存在而可扩大宿主谱。然而，这种作用不是由于杀虫剂成分之间的任何相互作用。
很多种类的杀虫剂化合物被用来防治昆虫害虫。下面将列出很多这些种类的概括及其作用方式的描述。
拟除虫菊酯是与钠离子通道蛋白质结合的化合物，它继而引起跨轴突膜动作电位的变化，这又破坏了昆虫神经系统的正常功能。拟除虫菊酯的例子包括氯氰菊酯(α-氰基-3-苯氧基苄基-顺/反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸酯；FMC Corp.)、PERMETHRINTM(3-苯氧基苄基-顺/反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸酯；Coulston International Corp.)、氰戊菊酯(α-氰基-3-苯氧基苄基-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酯)和cyhalothrin(α-氰基-3-苯氧基苄基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-丙-1-烯基)-二甲基环丙烷羧酸酯)。
甲脒化合物有几种推定的作用方式，包括与章鱼胺(一种神经激素/神经递质)受体结合，起激动剂的作用，促进cAMP的产生，引起行为改变，或抑制单胺氧化酶的混合功能。甲脒的例子包括双虫脒(N’-(2，4-二甲基苯基)-N-[[2，4-二甲基苯基)亚氨基]甲基]-N-甲基甲烷酰亚胺酰胺；NOR-AM，Schering AG)和杀虫剂(N’-(4-氯-O-甲苯基)-N，N-二甲基甲脒)。
芳基吡咯是线粒体毒素，通过使氧化磷酸化作用解偶联而显示其致死效应。芳基吡咯的例子包括4-溴-2-对氯苯基-1-乙氧基甲基-5-三氟甲基-吡咯-3-腈(美国专利No.5,310,938)和美国专利No.5,010,098中描述的化合物。
二酰肼是非甾类昆虫生长调节剂，其主要作用方式是作为蜕皮素激动剂。二酰肼的例子包括二苄基-叔丁肼(其制备在美国专利No.5,300,688中有描述)和MIMICTM(3，5-二甲基苯甲酸1-(1，1-二甲基乙基)-2-(4-乙基苯甲酰基)酰肼；Rohm & Haas Co.)。
环二烯与GABA复合物的受体亚单位结合。环二烯的例子是硫丹(6，7，8，9，10，10-六氯-1，5，5，6，9，9-六氢-6，9-亚甲基-2，4，3-苯并二噁thiepin 3-氧化物；Hoechst)。
氨基甲酸酯起胆碱酯酶抑制剂的作用。氨基甲酸酯的例子包括thiodicarb(二甲基-N，N-(硫代双(甲基亚氨基)羰基氧)双(乙烷亚氨硫代酯)；Rhone-Poulenc)和灭多虫(N-[(甲基氨基甲酰基)氧]硫代乙酰亚氨酸S-甲酯)。
有机磷起胆碱酯酶抑制剂的作用。有机磷的例子包括丙溴磷(硫代磷酸O-4-溴-2-氯苯酯O-乙酯S-丙酯；Ciba-Geigy)、马拉松(巯基琥珀酸乙酯的二硫代磷酸O，O-二甲酯)、甲丙硫磷(二硫代磷酸O-乙酯O-[4-(甲基硫代)苯酯]S-丙酯)和乐果(S-甲基氨基甲酰基甲基)-二硫代磷酸(O，O-二甲酯)。
吡唑类化合物是线粒体呼吸抑制剂，特异性地作用于电子传递系统的复合物I。吡唑类化合物的例子包括tebufenpyrad(N-(4-叔丁基苄基)-4-氯-3-乙基-1-甲基吡唑-5-甲酰胺；Mitsubishi Kasei，美国氰胺公司)和公开的欧洲专利申请No.289,879中描述的化合物。
硝基胍通过其与乙酰胆碱受体结合而阻止乙酰胆碱与突触后膜某些乙酰胆碱受体结合。这些化合物阻断神经传递。硝基胍的例子包括吡虫啉(1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-硝基-2-咪唑烷亚胺；Bayer)及其衍生物。
Milbemycin先与GABA受体/氯离子通道复合物的一个部位结合，然后通过抑制神经肌接头的信号传递而引起昆虫麻痹和死亡。Milbemycin的一个例子是齐墩螨素(含＞80％除虫菌素Bla和＜20％除虫菌素Blb的除虫菌素混合物；Merck，Sharp & Dohme)。
苯甲酰基苯基脲是昆虫生长调节剂，它干扰壳多糖合成，从而破坏昆虫蜕皮过程中角质层形成的过程。苯甲酰基苯基脲的一个例子是除虫脲(1-(4-氯苯基)-3-(2，6-二氟苯甲酰基)脲；Uniroyal Chemical Co.，Inc.)。
脒基腙是抑制复合物II线粒体电子传递的线粒体呼吸抑制剂。脒基腙的一个例子是伏蚁腙(四氢-5，5-二甲基-2(1H)-嘧啶酮[3，-[4-(三氟甲基)苯基]-1-[2-[4-三氟甲基)苯基]乙烯基]-2-亚丙烯基]；美国氰胺公司)。
本领域技术人员会理解，上述类型的化学品的另外的例子是已知的，可购自供应商，或在专利和科学文献中被描述。
按照本发明，杀虫剂组合物包括杀虫化学品(或如下所述的生物学杀虫剂)和基因修饰的昆虫病毒。
在本发明的一个实施方案中，昆虫病毒的基因修饰包括在病毒基因组内任何适当的部位插入表达昆虫防治或修饰物质的基因。例如，该物质是毒素、神经肽或激素或酶。被这样表达的物质增强病毒的生物杀虫效应。
这样的毒素包括从蝎子Androctonus australis得到的昆虫特异性毒素AaIT(7)、从谷痒病螨虱状蒲螨(Pvemotes tritici)得到的一种毒素(8)、苏云金杆菌毒素(9、10)和从蜘蛛毒液中分离到的一种毒素(11)。这样的神经肽或激素的例子包括羽化激素(12)、促前胸腺激素(PTTH)、脂动激素、利尿激素和原肛肽(13)。这样的酶的例子是保幼激素酯化酶(JHE)(14)。
本发明以包含表达AaIT的插入基因的基因修饰的AcMNPV为例加以说明。基因修饰的起始点是称作E2的AcMNPV的野生型株(ATCC VR-1344)。插入这一病毒株的毒素是AaIT，它由南非蝎子Androctonus australis Hector的毒液制成。该毒素长度为70个氨基酸，结合于昆虫的钠通道，以ng至mg级的量引起昆虫幼虫收缩麻痹。因为AaIT不结合于哺乳动物钠通道，所以是用作生物杀虫剂来保护作物的候选者，因为它能安全地被人摄入。
AaIT基因编码区域的上游区域包括指导细胞分泌AaIT的信号序列。具体地说，该信号序列将毒素通过分泌途径导向细胞表面，在该处分泌到细胞外。在运送过程中，酶切割信号序列，留下成熟AaIT。
现已发现，在昆虫毒素如AaIT(15)的表达和分泌方面异源信号序列是有用的。较佳的异源信号序列是果蝇(Drosophila melanogaster)的表皮信号序列(对于骨胳外蛋白质)，它分泌大量相关的成熟蛋白质。
也使用编码表皮信号序列和AaIT的密码子最优化DNA序列。基因密码的简并使核苷酸序列变异，而仍产生和天然DNA序列编码的多肽具有同样氨基酸序列的多肽。称作密码子最优化的这种过程给人们提供了设计这种改变的DNA序列以反映被宿主昆虫利用的密码子频率的手段。在这一实施方案中，利用果蝇密码子表产生编码表皮信号序列和AaIT的密码子最优化的DNA序列。
改进AaIT表达的另外一个手段是利用AcMNPV DA26“早期”启动子。此启动子被插入编码表皮信号序列和AaIT的密码子最优化DNA序列的上游。按照共同转让的待批美国专利申请No.08/070,164(在此引作参考)所述的方法，构建含有DA26启动子和编码表皮信号序列和AaIT的密码子最优化DNA的基因修饰的Ac MNPV E2株的样本。所得的病毒构建物的样本称作AC1001，保藏在美国典型培养物保藏中心，被指定为ATCC No.VR-2404。本领域技术人员用常规技术可产生其它使用野生型AaIT DNA序列的构建物、其它异源信号序列和其它启动子。
用昆虫病毒的基因修饰改进昆虫病毒防治昆虫的性能也采取基因缺失的形式。一个例子是编码蜕皮甾类UDP-葡糖基转移酶(“EGT”)的基因缺失。Miller等报告了昆虫病毒这种EGT-株(16)的构建。Miller特别描述了AcMNPV EGT-株的构建。
egt基因的表达引起EGT的产生。EGT使昆虫羽化激素(蜕皮素)失活，阻止昆虫幼虫羽化或化蛹。当egt基因失活时，例如通过产生EGT-株而失活，受昆虫病毒感染的幼虫可进行羽化或化蛹。这种继续发育的昆虫继而导致诸如减少进食、减缓生长和快速死亡之类的有益的作物保护的结果。这是由于EGT-昆虫病毒不能阻断昆虫羽化和化蛹，以及准备羽化时的停止进食。结果，EGT-感染的昆虫在其感染状态试图羽化时，比野生型(EGT+)感染的昆虫更趋于早死亡。以LT50值(感染病毒后一组昆虫的一半死亡所需的时间)表示，用EGT-株感染的昆虫比用野生型病毒感染的昆虫更有效。
通过替代或在egt基因中插入另一基因如对β-半乳糖苷酶的非病毒标记基因，可使egt基因失活。任何DNA序列可用来破坏egt基因，只要它破坏egt编码序列的表达。或者，通过一个合适的编码片段的缺失或突变，可从基因组除去egt基因的全部或部分。此外，控制egt基因表达的基因组的调节部分可以改变或除去。这些修饰的结果使egt基因表达不足。通过病毒连续通过昆虫或昆虫细胞培养物，也可产生失活egt基因的缺失。所有这些插入、缺失或突变用常规手段达到。所得到的缺失的昆虫病毒其优点是不含有外来DNA，与野生型病毒的区别也仅在于缺少功能性egt基因。
Miller用称为vEGTDEL的重组体得到的AcMNPV EGT-病毒为例，其中部分egt基因缺失。Miller通过将质粒pEGTDEL(用EcoRI和XbaI切割含egt基因的质粒以切除部分基因的产物)和来自病毒vEGTZ的DNA(含有插入在带有上述egt编码序列的骨架中的lac Z基因)共转染到SF细胞中，得到了vEGTDEL。同源重组导致以来自pEGTDEL的缺失egt基因替代vEGTZ中的egt-lac Z融合基因，得到重组体病毒vEGTDEL，即EGT-。
Miller使用了一株称作L1的AcMNPV，这是最初分离的野生型株(ATCCVR-1345)的克隆分离株。后来，一株称作为V8的AcMNPV被分离和鉴定。该V8株样本保藏在美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，U.S.A.)，编号为TACC[VR 2465]。Miller文中描述的构建L1EGT-株的技术很易用来构建V8EGT-株。
用本领域技术人员已知的常规制剂技术来制备本发明的组合物。组合物的形式为可湿式粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、气溶胶溶液、毒饵和其它常规的杀虫制剂。
组合物常包括惰性载体，可以是液体如水、醇、烃类或其它有机溶剂、或矿物、动物或植物油，或粉末如滑石、粘土、硅酸盐或硅藻土。
采用本领域技术人员已知的常规技术对本发明的杀虫剂组合物加以施用。这些技术包括用吸入(通过对所述昆虫食用的谷物进行喷雾或撒粉)、摄入或直接接触使害虫暴露于组合物。
杀虫剂组合物以几种方式施用。将病毒和化学品以一种剂量形式或同时以两种剂量形式同时施用。如果使用两种剂量形式，它们单独包装，然后混合(如有必要，在稀释剂存在下)，形成最终组合物。或者，病毒或化学品之一可先施用，以使昆虫受应激，然后用另一成分。
本发明的杀虫剂组合物的施用剂量范围为2.4×108-2.4×1012PIBs/公顷基因修饰的病毒和0.001-1.0kg/公顷化学杀虫剂。这些剂量表示本领域对每一成分分别确定的剂量范围，以及通过本发明合用杀虫剂组合物而可能降低的剂量。
产生植物保护的最优化杀虫有效组合物所需的组合物每一活性成分的浓度取决于有机体、化学品和所用的昆虫病毒修饰以及组合物的制剂。这些浓度很易被本领域技术人员测定。
作为化学杀虫剂的替代物，将生物防治剂与昆虫病毒合用。生物防治剂包括例如可购自Abbott实验室、商品名为XENTARITM和DIPELTM2X的苏云金杆菌之类的细菌。其它生物防治剂包括Nosema polyvora，M.grandis和Braconmellitor之类原生动物(5)。其它生物防治剂还包括昆虫病原性真菌(5)和线虫。线虫以液体制剂或分散在凝胶中加以施用，在该制剂中它们处于休眠阶段，直接准备使用。
为了使本发明可被更好地理解，阐述如下实施例。这些实施例仅仅是为了阐述的目的，而不能看作对本发明范围的限制。
实施例实施例1 生物测定技术这些实施例中使用的生物测定技术是食物铺层法，该生物测定按如下方法进行。使用的昆虫是烟芽夜蛾和玉米夜蛾。将幼虫在黄豆/麦芽琼脂基食物(Stoneville食物)上培养，该食物得自USDA昆虫实验室，Stonevile，MS。将每个集落保持在28℃持续荧光下。所有生物测定均在Stoneville食物上用第二龄幼虫(烟芽夜蛾4日龄，玉米夜蛾3日龄)进行。
生物测定盘(C-D International，Inc.，Pitman，NJ)每个含有32个分开的场所。每个4×4cm的场所含有5ml Stoneville食物。在处理和传染后，将场所内的昆虫用清洁的带孔粘合蓬盖上。清洁的蓬可容易地评分。
对于log/PROBITTM(HRO Group，Inc.)分析，每一实验前从病毒的贮备液用丙酮2倍蒸馏水进行连续稀释。根据受试病毒种，从1×108至1×101PIB/ml进行对数稀释。需要时，通过离心来浓缩病毒贮备液。技术级杀虫剂制备成各种浓度，以杀虫剂的重量对稀释剂体积计，为份/百万(“ppm”)。
向人工饲料(已硬化)的表面滴加以下溶液的丙酮∶水(60∶40)溶液0.4ml病毒溶液；化学品溶液；病毒+化学品溶液；病毒+化学品溶液或未处理的溶液。对于病毒溶液，根据受试昆虫种以10倍稀释，稀释范围为1×108至1×101PIB/ml。根据所研究的化学品和受试昆虫种，化学品的施用范围从1000ppm至0.1ppm。每种稀释液用32条幼虫作试验，重复3-4次。通过旋转测定盘使施用平均分布，将溶液在烟罩中干燥。一旦干燥，即将一条幼虫加到每一试验区，喂养其8-10天。烟芽夜蛾喂养8天；玉米夜蛾喂养12天。整个研究期间，生物测定盘在持续荧光下保持于28℃。一天读数一次以观察感染的早期发生时间。每次读数时，如果幼虫即使在振摇食物盘时仍不显示运动或如果它变得液化了，就认为是死的。基于3-4次重复试验，计算化学品和病毒的LC20和LC50值(观察到20％或50％死亡率的浓度)。用SAS log/PROBITTM程序统计计算处理后8天或10天时的死亡率/剂量。这些PROBITM值一经计算出，即用同样的食物铺层法，以预定的LC20和LC50剂量的化学品单独LC20和LC50剂量的病毒单独和化学品/病毒的各种可能的变换进行试验。“LC20”是预期通过施用该产品引起幼虫20％死亡率的剂量，而“LC50”则是预期通过施用该产品引起幼虫50％死亡率的剂量。
结果表中指明PIB/ml的浓度，例如，“5E4”，即5×104，其中“E”表示指数。表中的术语“DAT”表示处理后天数。在这些表中，“插入AaIT的”AcMNPV是基因修饰的E2株，该E2株含有DA26启动子和编码表皮信号序列的密码子最优化DNA及AaIT。
含基因修饰的昆虫病毒和化学杀虫剂合用的组合物，当其中一个(或两者)增加死亡率或改善杀虫效果的速度时，昆虫的防治得到加强。
实施例2-5给出了用Helicoverpa zea所作的实验结果；实施例6-8给出了用烟芽夜蛾所作的实验结果。
实施例2甲脒、阿米曲士和基因修饰的昆虫病毒合用在第一个实验中，将甲脒，阿米曲士和昆虫病毒AcMNPV合用进行试验，该昆虫病毒经基因修饰成含AaIT或成为EGT-。结果在表1和表2中给出。
表1甲脒、阿米曲士对“插入AaIT”的AcMNPV-E2对第2龄Helicoverpa zea的致病力的冲击处理1幼虫平均死亡％5天8天阿米曲士100ppm 1 2“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml25 44阿米曲士100ppm+“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml5427021.在食物铺层试验中每个处理重复4次；每次重复由32条幼虫组成。
2.表示反应显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
表2甲脒、阿米曲士对“缺失EGT的”AcMNPV-V8对第2龄Helicoverpa zea的致病力的冲击处理1幼虫平均死亡％5天8天阿米曲士100ppm 1 2“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 29 56阿米曲士100ppm+“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 2224821.在食物铺层试验中每个处理重复4次；每次重复由32条幼虫组成。
2.表示反应显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
结论如下阿米曲士100ppm与“插入AaIT的”AcMNPV对H.zea幼虫的生物活性有协同作用。上述病毒的协同作用有些剂量依赖性，因为该重组病毒合用1000ppm阿米曲士对H.zea产生相加而非协同效应。
相反，阿米曲士对“缺失EGT的”AcMNPV对H.zea幼虫的生物活性无明显效应。有一数值倾向揭示H.zea对甲脒/“缺失EGT的”重组体的反应略小于相加作用。
实施例3芳基吡咯与基因修饰的昆虫病毒的合用在下一个实验中，芳基吡咯4-溴-2-(对氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈与经基因修饰成含AaIT和为EGT-的昆虫病毒AcMNPV合用，进行测试。结果在表3和表4中给出。
表3芳基吡咯4-溴-2-(对氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈对“插入AaIT的”AcMNPV-E2对第2龄Helicoverpa zea的致病力的冲击处理1幼虫平均死亡％3天 5天8天芳基吡咯1.7ppm 29 41 43“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 2 9 34芳基吡咯1.7ppm+“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml4825236331.在食物铺层试验中每个处理重复3次；每次重复由32条幼虫组成。
2.表示反应显著区别于相加作用(配对t-检验，p＜0.05)。
3.表示反应并非显著区别于相加作用(配对t-检验)。
表4芳基吡咯4-溴-2-(对氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)吡咯-3-腈对“缺失EGT的”AcMNPV-E2对第2龄Helicoverpa zea的致病力的冲击处理1幼虫平均死亡％3天 5天 8天芳基吡咯1.7ppm 29 4143“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 2 1942芳基吡咯1.7ppm+“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 4025036131.在食物铺层试验中每个处理重复3次；每次重复由32条幼虫组成。
2.表示反应显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
结论如下芳基吡咯4-溴-2-(对氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈显著加速“插入AaIT的”AcMNPV对H.zea的杀虫速度[即基于处理后3天所得数据]。然而，在处理后5天和8天，H.zea对比芳基吡咯/重组病毒联合应用的反应是相加的(或略小于相加)。
该芳基吡咯对“缺失EGT的”AcMNPV-V8产生的第2龄H.zea的平均死亡率无统计学上显著的效应。然而，有一数值倾向(处理后3天时)提示该芳基吡咯略加速“缺失EGT的”AcMNPV对H.zea幼虫的杀灭速度。
实施例4二酰肼与基因修饰的昆虫病毒合用在下一个试验中，二酰肼二苯甲酰基-叔丁基肼与基因修饰成含AaIT或为EGT-的昆虫病毒AcMNPV合用，进行测试。结果在表5和6中给出。
表5二酰肼二苯甲酰基-叔丁基肼对“插入AaIT的”AcMNPV-E2对第2龄和第3龄Helicoverpa zea混合幼虫的致病力的冲击处理1幼虫平均死亡％3天 5天8天二酰肼200ppm 11 45 82“插入AaIT的”AcMNPV 5E5 PIB/ml9 19 27二酰肼200ppm+“插入AaIT的”AcMNPV 5E5 PIB/ml4526338431.在食物铺层试验中每个处理重复3次；每次重复由32条幼虫组成。
2.表示反应显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
3.表示反应并非显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
表6二酰肼二苯甲酰基-叔丁基肼对“缺失EGT的”AcMNPV-V8对第2龄和第3龄Helicoverpa zea混合幼虫的致病力的冲击处理1幼虫平均死亡％3天 5天 8天二酰肼200ppm 11 45 82“缺失EGT的”AcMNPV 5E5 PIB/ml6 20 39二酰肼200ppm+“缺失EGT的”AcMNPV 5E5 PIB/ml2925438931.在食物铺层试验中每个处理重复3次；每次重复由32条幼虫组成。
2.表示反应显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
3.表示反应并非显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
结论如下二酰肼显著加速“插入AaIT的”AcMNPV对H.zea幼虫的杀灭速度〔即基于处理后3天收集到的数据〕。
二酰肼还显著加速“缺失EGT的”AcMNPV对H.zea幼虫的杀灭速度〔即基于处理后3天收集到的数据〕。
实施例5苯甲酰基苯基脲与基因修饰的昆虫病毒合用在下一个试验中，苯甲酰基苯基脲diflubenzuron与基因修饰成含AaIT或为EGT-的昆虫病毒AcMNPV合用，进行测试。结果在表7和8中给出。
表7苯甲酰基苯基脲diflubenzuron对“插入AaIT的”AcMNPV-E2对第2龄Helicoverpa zea的致病力的冲击处理1幼虫平均死亡％3天5天8天Diflubenzuron 25ppm9 12 16“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml7 23 36Diflubenzuron 25ppm+“插入AaIT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml632233721.在食物铺层试验中每个处理重复3次；每次重复由32条幼虫组成。
2.表示反应显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
3.表示反应并非显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
表8苯甲酰基苯基脲diflubenzuron对“缺失EGT的”AcMNPV-V8对第2龄Helicoverpa zea的致病力的冲击处理1幼虫平均死亡％3天 5天 8天Diflubenzuron 25ppm 9 12 16“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 5 13 36Diflubenzuron 25ppm+“缺失EGT的”AcMNPV 5E4 PIB/ml 1022333031.在食物铺层试验中每个处理重复3次；每次重复由32条幼虫组成。
2.表示反应显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
3.表示反应并非显著区别于相加作用(配对t-检验，p＝0.05)。
结论如下苯甲酰基苯基脲diflubenzuron不改善“插入AaIT的”AcMNPV-E2对H.zea幼虫的活性；而且，H.zea幼虫对这种联合应用的反应小于相加作用。
该苯甲酰基苯基脲也不改善“缺失EGT的”AcMNPV-E2对H.zea幼虫的活性；而且，H.zea幼虫对这种联合应用的反应小于相加作用。
实施例6拟除虫菊酯与野生型或基因修饰的昆虫病毒合用在下一个试验中(在第2龄烟芽夜蛾上)，拟除虫菊酯与野生型或基因修饰成含AaIT或为EGT-的昆虫病毒AcMNPV合用，进行测试。结果在表9-14中给出。
表9描述Cypermethrin与AcMNPV的野生型E2株的联合应用。该联合应用使用相当于每一成分单独使用预期的LC20的剂量。
表9平均死亡百分率％1天 4天10天Cypermethrin(0.5ppm) 11 19 19野生型AcMNPV(400PIB/ml) 013 27Cypermethrin(0.5ppm)+ 531 41野生型AcMNPV(400PIB/ml)未处理的对照 00 0
与各个成分相比，联合应用并未观察到如Aspirot(1)报告的协同作用。
表10描述Cypermethrin与AcMNPV的V8 EGT-株的联合应用。该联合应用使用相当于每一成分单独使用预期的LC20的剂量。
表10平均死亡百分率％1天 4天 10天Cypermethrin(0.5ppm) 11 1919缺失EGT的”AcMNPV(775PIB/ml) 0 2 3Cypermethrin(0.5ppm)+23 2734“缺失EGT的”AcMNPV(775PIB/ml)未处理的对照 0 0 0与各个成分相比，联合应用观察到协同作用。此协同作用与cypermethrin和野生型病毒合用缺乏协同作用正相反。
表11描述Cypermethrin与AcMNPV的“插入AaIT”E2株的联合应用。该联合应用使用相当于每一成分单独使用预期的LC20的剂量。
表11平均死亡百分率％1天 4天 10天Cypermethrin(0.5ppm) 11 1919“插入AaIT的”AcMNPV(1000PIB/ml) 0 6 22Cypermethrin(0.5ppm)+ 22 3844“插入AaIT的”AcMNPV(1000PIB/ml)未处理的对照 0 0 0与各个成分相比，联合应用在1和4天观察到协同作用。此早期的杀灭速度优于拟除虫菊酯和野生型病毒合用所观察到的结果。
表12描述Cypermethrin与AcMNPV的E2野生型株的联合应用。该联合应用使用相当于每一成分单独使用预期的LC50的剂量。
表12平均 死亡百分率％1天4天 10天Cypermethrin(1ppm) 39 58 58野生型AcMNPV(1200PIB/ml) 0 25 53Cypermethrin(1ppm)+48 77 91野生型AcMNPV(1200PIB/ml)未处理的对照 0 0 0除了1天外，联合应用与各个成分相比未观察到协同作用。
表13描述Cypermethrin与AcMNPV的V8 EGT-株的联合应用。该联合应用使用相当于预期的拟除虫菊酯LC20和AcMNPV V8 EGT-株LC50的剂量。
表13平均死亡百分率％1天4天 10天Cypermethrin(0.5ppm) 11 19 19“缺失EGT的”AcMNPV(1100PIB/ml) 0 0 8Cypermethrin(0.5ppm)+34 47 50“缺失EGT的”AcMNPV(1100PIB/ml)未处理的对照 0 0 0表13的结果也在
图1中绘出。与各个成分相比，联合应用观察到协同作用。此协同作用与cypermethrin和野生型病毒合用缺乏协同作用正相反，即使将小剂量cypermethrin与基因修饰的病毒合用也是如此。
表14描述cypermethrin与AcMNPV的“插入AaIT”E2株的联合应用。该联合应用使用相当于每一成分单独使用预期的LC50的剂量。
表14平均死亡百分率％1天4天 10天Cypermethrin(1ppm) 31 31 31“插入AaIT的”AcMNPV(5000PIB/ml)0 6 16Cypermethrin(1ppm)+25 63 72“插入AaIT的”AcMNPV(5000PIB/ml)未处理的对照 0 0 0
表14的结果也在图2中绘出。在4天和10天，联合应用与各个成分相比，观察到协同作用。此协同作用与cypermethrin和野生型病毒合用缺乏协同作用正相反。
因此，cypermethrin与基因修饰成含AaIT或为EGT-的病毒合用优于cypermethrin与野生型病毒合用。鉴于只使用野生型病毒和拟除虫菊酯联合应用的现有资料(1)，这些结果是不可预料的。
实施例7二酰肼与野生型或基因修饰的昆虫病毒合用在下一个试验中(在第3龄烟芽夜蛾上)，二酰肼二苯甲酰基-叔丁基肼与野生型或基因修饰成含AaIT或为EGT-的昆虫病毒AcMNPV(L1株)合用，进行测试。结果在表15-16中给出。联合应用使用低于实施例6中使用的剂量。
表15描述该二酰肼与AcMNPV的野生型L1株的联合应用。
表15死亡百分率处理/剂量 1天4天 10天野生型AcMNPV(1E2 PIB/ml) 0 025二酰肼(100ppm)0 031野生型AcMNPV(1E2 PIB/ml)+ 0 19 69二酰肼(100ppm)丙酮水对照 0 00在联合应用后4天和10天观察到协同作用。
表16描述该二酰肼和基因修饰的AcMNPV的EGT-(L1株)的联合应用。
表16死亡百分率处理/剂量 1天4天 10天重组体(1E3 PIB/ml)0 688二酰肼(100ppm)0 031重组体(1E3 PIB/ml)+ 0 13 100二酰肼(100ppm)丙酮水对照 0 00观察表明此反应略不同于合用4天时的相加作用。
实施例8芳基吡咯与野生型或基因修饰的昆虫病毒合用在下一个试验中(在第2龄烟芽夜蛾上)，芳基吡咯4-溴-2-(对氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈与野生型或基因修饰成含AaIT或为EGT-的昆虫病毒AcMNPV(L1株)合用，进行测试。结果在表17-19中给出。
表17描述该芳基吡咯与AcMNPV的野生型E2株的联合应用。该联合应用使用相当于每一成分单独使用预期的LC20的剂量。
表17平均死亡百分率1天 4天 10天芳基吡咯(1ppm) 3 8 13野生型AcMNPV(400 PIB/ml) 0 0 6芳基吡咯(1ppm)+2 1941野生型AcMNPV(400 PIB/ml)未处理的对照 0 0 0在联合应用后4天和10天观察到协同作用。
表18描述该芳基吡咯和基因修饰的AcMNPV的EGT-(V8株)的联合应用。
表18平均死亡百分率％1天 4天 10天芳基吡咯(2ppm) 205284“缺失EGT的”AcMNPV(1100 PIB/ml)0 0 3芳基吡咯(2ppm)+335072“缺失EGT的”AcMNPV(1100 PIB/ml)未处理的对照 0 0 0结果表明，合用1天时观察到比芳基吡咯和野生型病毒合用早期杀灭速度改善。
表19描述该芳基吡咯和基因修饰的AcMNPV的插入AaIT的E2株联合应用。
表19平均死亡百分率％1天4天10天芳基吡咯(2ppm) 20 52 84“插入AaIT的”AcMNPV(1000 PIBs/ml) 0 3 22芳基吡咯(2ppm) + 39 69 78“插入AaIT的”AcMNPV(1000 PIBs/ml)未处理的对照0 0 0合用1天和4天观察到协同作用，表明比芳基吡咯和野生型病毒合用早期杀灭速度改善。
因此，在总体基础上，芳基吡咯4-溴-2-(对氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈与基因修饰成含AaIT或为EGT-的病毒合用优于芳基吡咯与野生型病毒合用。
书目1.Aspirot，J.，et al.，美国专利No.4,668,511.
2.Mohamed，A.I.，et al.，Environ.Entomology，12，478-481(1983).
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16.Miller，L.K.，et al.，国际专利申请No.WO91/00014.
权利要求
1.杀虫剂组合物，包括(a)有效量的化学杀虫剂，选自由拟除虫菊酯、芳基吡咯、二酰肼和甲脒类组成的化学品；(b)有效量的基因修饰的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒“AcMNPV”，包括(i)表达Androctonus australis昆虫毒素(“AaIT”)的插入基因，或(ii)编码AcMNPV的脱皮甾类UDP-葡糖基转移酶“EGT”的基因的缺失，其中，所述组合物用于抗鳞翅目昆虫，其条件为当昆虫为玉米夜蛾、化学杀虫剂为甲脒时，基因修饰的AcMNPV包含表达AaIT的插入基因。
2.按权利要求1所述的杀虫剂组合物，其中组合物包括(a)有效量的化学杀虫剂，选自由拟除虫菊酯和芳基吡咯组成的化学品；和(b)有效量的基因修饰的AcMNPV，包括(i)表达AaIT的插入基因，或(ii)编码AcMNPV的EGT的基因的缺失，其中所述组合物用于抗烟芽夜蛾昆虫。
3.按权利要求1所述的杀虫剂组合物，其中组合物包括(a)有效量的化学杀虫剂，选自由芳基吡咯和二酰肼组成的化学品；和(b)有效量的基因修饰的AcMNPV，包括(i)表达AaIT的插入基因，或(ii)编码AcMNPV的EGT的基因的缺失，其中所述组合物用于抗玉米夜蛾昆虫。
4.按权利要求1所述的杀虫剂组合物，其中组合物包括(a)有效量的化学杀虫剂，选自由甲脒类组成的化学品；和(b)有效量的基因修饰的AcMNPV，包含表达AaIT的插入基因，其中所述组合物用于抗玉米夜蛾昆虫。
5.按权利要求2所述的杀虫剂组合物，其中化学杀虫剂选自由拟除虫菊酯组成的化学品。
6.按权利要求5所述的杀虫剂组合物，其中拟除虫菊酯为α-氰基-3-苯氧基苄基-顺/反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸。
7.按权利要求2或3所述的杀虫剂组合物，其中化学杀虫剂选自由芳基吡咯组成的化学品。
8.按权利要求7所述的杀虫剂组合物，其中芳基吡咯为4-溴-2-(对氯苯基)-1-(乙氧基甲基)-5-(三氟甲基)-吡咯-3-腈。
9.按权利要求3所述的杀虫剂组合物，其中化学杀虫剂选自由二酰肼组成的化学品。
10.按权利要求9所述的杀虫剂组合物，其中二酰肼为二苯甲氧基-叔丁基腈。
11.按权利要求4所述的杀虫剂组合物，其中甲脒为N’-(2，4-二甲基苯基)-N-〔〔(2，4-二甲基苯基)亚氨基〕甲基〕-N-甲基甲烷酰亚胺酰胺。
12.按权利要求2、3或4中任何一项所述的杀虫剂组合物，其中化学杀虫剂的有效量为0.001-1.0kg/公顷。
13.按权利要求2、3或4中任何一项所述的杀虫剂组合物，其中基因修饰的AcMNPV包含表达AaIT的插入基因。
14.按权利要求2、3或4中任何一项所述的杀虫剂组合物，其中基因修饰的AcMNPV包含编码AcMNPV的EGT的基因的缺失。
15.按权利要求2、3或4中任何一项所述的杀虫剂组合物，其中基因修饰的AcMNPV的有效量为2.4×108-2.4×1012多角体包涵体“PIB”/公顷。
16.用于防治鳞翅目昆虫的方法，其特征在于对所述昆虫或作物投药，其中所述昆虫喂饲权利要求1所述杀虫剂组合物。
全文摘要
本发明描述用于抗昆虫的杀虫剂组合物，其包含用于增强昆虫防治的基因修饰的昆虫病毒和化学及生物学杀虫剂的混合物。病毒的基因修饰包括插入基因，该基因表达昆虫防治或修饰物质，如毒素、神经肽或激素，或酶。病毒的基因修饰还包括基因的缺失。
文档编号A01N63/00GK1162906SQ95194976
公开日1997年10月22日 申请日期1995年7月27日 优先权日1995年7月27日
发明者B·C·布莱克, C·F·库克尔, M·F·特里西 申请人:美国氰胺公司