专利名称：新的植物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及具有改变植物中正常淀粉合成途径的基因组物质的转基因植物或突变植物。更确切地说，本发明涉及具有产生大量新型淀粉之基因型的植物。具体地说，本发明涉及具有两个或多个野生型基因的杂合基因型(例如Aa/Bb)之胚和具有所述基因的杂合基因型(例如AAa/BBb或AAa/bbB或aaA/Bbb或aaA/bbB)之胚乳的谷类及其生产的淀粉。
本发明的谷类通过传授了另一种植物花粉的一种植物产生，其中所述的一种植物为对于至少一种基因为纯合隐性基因型，而另一基因为野生型(例如aa/BB)，所述另一种植物为至少另一基因是纯合隐性基因型而其中其它的基因为野生型(例如AA/bb)。
背景技术：
许多植物都产生并贮存淀粉。这些植物具有产生淀粉的合成途径。淀粉的产量随植物的类型不同而变化。谷物是公知的产淀粉植物。所述谷物包括稻、玉米、高粱、大麦、小麦、黑麦和燕麦。此外，已知包括甘薯在内的马铃薯科植物和某些水果(如香蕉)也产淀粉。
淀粉是叶子光合作用中重要的碳固定终产物，是种子和水果中的重要贮存产物。从经济学角度看，由小麦、稻和玉米三中谷类作物的可食用部分产生的淀粉可以提供以热量计的全球性约2/3食物。
植物淀粉可以多种方式加以利用。例如，可以经过提取而用于烹饪和食品加工。淀粉可以留在谷物或植物中供动物和人类使用。还可以将淀粉用于制酒的蒸馏加工，例如，淀粉可转化为乙醇。此外，淀粉可转化为高果糖糖浆和其它的工业用组分。
在字典中，淀粉被定义为其化学本质是复合糖的粒状固体，可用于粘合剂、浆糊、食品、化妆品、药品等产品中。较笼统地说，淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉和支链淀粉在质体室(光合细胞的叶绿体或非光合细胞的淀粉质体)中合成。不同的植物产生不同比例的支链淀粉和直链淀粉。而且，支链淀粉的不同分支样式和直链淀粉及支链淀粉的不同链长将产生不同的淀粉特性。因此，不同植物中直链淀粉和支链淀粉的精细结构不同，以致分支链型和链长有很大的变化，从而产生适于不同用途的新特性。迄今为止，已有四条制备具有特殊性质淀粉的途径(i)利用从不同种植物中提取的淀粉；(ii)利用从特定植物的突变品系中提取的淀粉；(iii)利用经化学修饰的天然和突变淀粉和(iv)利用经物理修饰的天然和突变淀粉。上述所有情况下的新型淀粉都因新的淀粉类型所提供的特性而有价值。
已知植物中的突变基因影响淀粉的性质。已经在玉米中鉴定了与各种淀粉相关的突变基因，其中的一些还被克隆。根据玉米谷粒的物理表观(表型)或其淀粉的特性对这些突变基因命名。这些隐性的突变基因包括蜡状的(Waxy)(WX)、含糖(Su)(包括但不限于糖-1(Sul)、糖-2(Su2)、糖-3(Su3)和糖-4(Su4)]、暗淡的(du)、直链淀粉增补剂(extender)(ae)、角状(h)和皱缩状(sh)[包括但不限于皱缩状-1(sh-1)和皱缩状-2(sh-2)。其中的一些隐性基因突变体产生淀粉合成途径中已知酶的同型酶。这些基因的隐性突变等位基因当在植物中为纯合性或在转基因植物中被以足量表达时，导致合成途径中某种酶的特定同型酶活性的完全或几乎完全降低(下文定义为同酶型活性完全降低)。淀粉合成途径中的这种变化致使形成具有不同特性的淀粉。
已知一些种类的作物产生不同类型的淀粉。淀粉品质类型的不同使之适用于一定目的，包括特定的加工方法或特定的最终用途。天然存在的玉米突变体产生不同精细结构的淀粉，适用于各种食品和其它目的。尽管已知的突变体产生已改变的淀粉，但其中一些品系不适于作物育种和/或农民使用。例如，产量很低，和/或难以加工，和/或不易凝胶化。
为了生产不同的淀粉，人们已经培育了单突变和双突变植物。单突变植物对于一种隐性突变基因是纯合的。例如，蜡状玉米、蜡状稻、蜡状大麦和蜡状高粱具有纯合的、突变的蜡状(WX)基因。蜡状基因型的Whilst淀粉只有极少或不含直链淀粉，而另一种称为直链淀粉增补剂(ae)的突变产生富含直链淀粉的淀粉。双突变是两种隐性突变基因纯合(或完全表达)的单植物。例如，US4,789,738中描述了Wxf11双突变。许多其它的新型淀粉已在其它有关淀粉的专利中提供，这些专利中都产生了双突变体或三突变体(例如US4,789,557、US4,790,997、US4,774,328、US4,770,71O、US4,798,735、US4,767,849、US4,801,470、US4,789,738、US4,792,458和US5,009,911描述了天然存在的玉米突变体，能产生适用于不同食品的不同精细结构的淀粉)。根据所述专利申请的描述本发明是非常出人意料的，因为本发明产生了改变的淀粉而不需要双突变体或三突变体。
正常的淀粉被定义为未经人为化学修饰或由具有调节淀粉合成途径的预期基因(野生型)的植物产生的淀粉。为了易于阅读，两个小写字母(例如aa)表示纯合的隐性突变基因，两个大写字母(例如AA)表示纯合的非突变基因(野生型)，而一个大写字母和一个小写字母(例如Aa)则表示一个突变的和一个未突变的一套非纯合基因。相同大小的不同字母表示不同的基因；“aa/bb”为双突变体，“aa/bB”为植物基因组中的单纯合突变基因和杂合突变基因。对于本申请而言，斜线一侧的任何三字母顺序都可以互换，而且并不限定提供该基因的亲本。例如，AAa/bbB定义为等同于aAA/bBb、AaA/Bbb、AaA/bBb、aAA/Bbb等。
尽管玉米植物及其胚为二倍体，但玉米胚乳却为三倍体。胚乳的基因型具有自雌性植物部分遗传而来的两个基因量和自花粉或雄性植物部分遗传而来的一个基因量。因此，如果单突变植物“aa”被用作雌性，并与非突变植物“AA”雄性杂交，则该雌性植物谷粒的胚乳为“aaA”。如果未突变的植物“AA”与突变植物“aa”杂交，以未突变体作为雌性，则雌性植物谷粒的胚乳为“Aaa”，因为两个基因量来自雌性而一个基因量来自雄性。传统的教材认为突变基因为隐性，非突变基因为显性；因此，由胚乳具有“aaA”或“AAA”或“AAa”的基因量的植物产生的淀粉导致预期量的正常淀粉。然而，作为雌性的纯合突变植物“aa”的胚乳与作为雄性植物的纯合突变植物“aa”杂交，产生具有“aaa”基因量的胚乳。该胚乳产生具有不同于正常淀粉之特性的淀粉。同样地，由胚乳为“aaa/bbb”的双突体产生的淀粉也表现出不同于正常淀粉的特性。这些淀粉特性的差别可用于替代经化学修饰的淀粉，或与食品一起应用或用于食品，或用作制酒中的谷物，或在一般淀粉工业中应用。
很清楚，生产具有不同物理特性之淀粉的谷物需要两种突变植物杂交，以产生对于两种基因为纯合隐性的谷物。突变植物比标准植物具有更小可预测性。
有关从双突变杂种和/或近亲繁殖体以及一些单突变体中生产谷物和提取淀粉，存在一个经常出现的问题。所产淀粉的量通常少于非突变植物所产淀粉的量，而且在淀粉颗粒大小和/或淀粉颗粒的完整性方面也有损失。已知能产生结构发生了改变的淀粉的双突变体在其作物中所产淀粉量相对较低的问题能够导致种子的发芽能力差。而且，种子的淀粉产量降低似乎是不可避免的，因为突变致使细胞的正常淀粉合成功能受到破坏。这就需要有一种生产具有淀粉结构发生了改变或性质发生了改变但不明显减少产率或降低淀粉颗粒大小或完整性之谷物的途径。
发明概述本发明的目的是提供开发改变了谷物的复合糖含量但不需要双突变体近亲杂交的杂种植物的方法。
本发明的目的还在于提供生产改变了淀粉特性之谷物的植物。
本发明的目的还在于提供生产改变了淀粉特性的谷物的转基因植物。
本发明的目的还在于提供相对于有关的突变植物而言产生改变了的淀粉和更大量淀粉的玉米植物。
本发明的目的还在于提供新植物，含有使植物淀粉合成途径中特定酶的至少两个同型酶活性不完全降低的基因。
本发明的目的还在于提供胚乳的基因型为“AAa/BBb或AAa/bbB或aaA/BBb或aaA/bbB”的玉米植物。
本发明的目的还在于提供产生基因型为“wxwxWX/AeAeae”之胚乳的植物。
本发明的目的还在于提供经改变的淀粉，其由具有“AAa/BBb或AAa/bbB或aaA/BBb或aaA/bbB”基因型的植物产生。
本发明的目的还在于提供由本发明玉米植物所得淀粉的新用途。
本发明广泛地覆盖了一般性地产生胚乳基因型为AAa/bbB的中间突变体和包括胚乳为蜡状，蜡状(wxwxWX/AEAEae)的某些中间突变体的方法。
生产具有改变了淀粉量的谷物的方法包括种植能够开花并充当雌性亲本的植物。雌性亲本对于淀粉合成途径中至少一种特定的同型酶活性已基本上完全降低。这可以是纯合隐性突变的结果，或者是因为通过采用通常称为反义或共抑制或有义向下(Sense-down)调节的技术，利用克隆的基因对野生型基因进行部分下调的结果。此外，该雌性植物对于淀粉合成途径中至少一种特定的同型酶已不完全降低。这可以是因为杂合的隐性突变基因或部分下调作用。无论雌性植物是如何产生的，它只能充当雌性部分。为了保证于此，需要采用一个消除第一亲本产生花粉能力的步骤。该方法包括用充当雄性亲本植物的花粉传授给充当雌性亲本的植物，其中雄性亲本为非突变亲本。收集由所述的第一亲本产生的谷粒。此外，该方法可包括从谷粒中提取淀粉。
本发明还包括具有使植物淀粉合成途径中至少两种特定的同型酶不完全降低之基因的植物。本发明还包括由所述植物产生的淀粉，与所述的类似，但含有不形成植物淀粉合成途径中酶的同型物之基因组物质植物形成的淀粉相比，它改变了结构。
植物在谷物(如谷类中)形成所述淀粉。由例如具有蜡状基因型(WxWx)的雌性植物与例如具有直链淀粉增补剂基因型(aeae)的雄性植物杂交产生谷物，其中谷物胚乳的基因型为wxwxWX/AeAeae。
换言之，本发明涉及产淀粉植物，它含有包括使所述植物淀粉合成途径中至少两种特定同型酶活性不完全降低的基因的基因组物质，藉此，所述植物相对于如果含有使淀粉合成途径中相同的两种特定同型酶活性完全降低的基因的植物而言，能产生多得多的淀粉。
本发明谷物的胚乳具有两种基因，含有一个基因量的隐性突变基因和两个基因量的野生型基因；和含有两个基因量的隐性突变基因和一个基因量的野生型基因。在本发明的描述中所包括的谷物，其胚乳的基因型为wxwxWX/AeAeae或aeaeAe/WxWxwx，或wxwxWx/DuDudu，或duduDu/WxWxwx，或aeaeAe/DuDudu.
或duduDu/AeAeae，或wxwxWx/SuSusu，或susuSu/WxWxwx，或aeaeAe/SuSusu，或susuSu/AeAeae，或duduDu/SuSusu，或susuSu/DuDudu本发明的淀粉得自基因型为wxwxWX/AeAeae的谷物。本发明的淀粉也得自基因型为Aeaeae/WxWxwx的谷物。
本发明的雌性植物具有aa/BB的二倍体基因型和aaA/BBb的三倍体基因型，其中a是隐性突变基因，A是野生型基因；b是隐性突变基因，B是野生型基因，于是所述淀粉是由正常淀粉改变而来，其中a和b可选自ae、wx、sh、bt、h、su、fl、op，而A和B可选自Ae、Wx、Sh、Bt、H、Su、Fl、Op。
根据本发明获得的淀粉可产生有强力弹性的凝胶，可极迅速的自口中清除。本发明的淀粉与常规淀粉相比，可形成具有独特质地的凝胶。这个独特质地使得本发明的淀粉适合作为常规胶化树胶(如天然树胶和明胶)在整个或部分食品配方中的替代物。还发现本发明的淀粉比通常的淀粉能产生更大弹性的凝胶。而且发现，由玉米产生的玉米淀粉所形成的凝胶比由普通淀粉形成的凝胶其透明度得到了改善。这一改善的透明度对于人眼是可见的，并有助于提供更开胃的食料。
附图的简要说明本发明通过说明的方式，通过下文参照附图的描述和实施例得以阐明。
图1是单突变体不同基因量的酶活性图。
图2a是蜡状、直链淀粉增补剂和普通淀粉的DSC扫描图。
图2b是双突变体(aeaeae/wxwxwx)的DSC扫描图。
图2c是来自中间突变体(aeaeAe/wxwxwx)的淀粉DSC扫描图。
图2d是来自另一中间突变体(wxwxWx/AeAeae)的淀粉DSC扫描图。
图3a是普通淀粉在各种pH中的Brabender数据图。
图3b是蜡状淀粉在各种pH中的Brabender数据图。
图3c是70％直链淀粉在各种pH中的Brabender数据图。
图3d是双突变体淀粉在各种pH中的Brabender数据图。
图3e是第一中间突变体淀粉在各种pH中的Brabender数据图。
图3f是第二中间突变体淀粉在各种pH中的Brabender数据图。
图4a是图解说明用于改变分支酶I基因表达水平的植物转化载体的设计和限制性酶切位点。
图4b图解说明用于改变分支酶II基因表达水平的植物转化载体的设计和限制性酶切位点。
图4c图解说明用于改变结合的淀粉合成酶(蜡状)基因表达水平的植物转化载体的设计及限制性酶切位点。
图4d图解说明用于改变可溶性淀粉合成酶的基因表达水平的植物转化载体的设计及限制性酶切位点。
图5是在本发明淀粉制得的凝胶与由aewx淀粉制得的凝胶与由蜡状(wx)淀粉制得的凝胶比较过程中的弹性模数(G′)图。
图6是针对本发明淀粉和aewx淀粉的品系绘制的弹性模数(G′)图。
本发明的详细描述广义地讲，本发明涉及改良的作物品系，该作物品系已操纵了至少两种淀粉合成酶的表达，所述的酶可以改变淀粉的产量和类型，继而改变由所述植物产生的谷物。
已经发现，含有至少两种部分下调或降低淀粉合成途径中特定同型酶活性的基因的植物将意外地在谷粒中产生有大量的淀粉，并产生改变了的淀粉类型。
特产玉米或突变植物不同于“正常”玉米是因为其已改变的胚乳。该变化的胚乳产生高度的淀粉分支，或改变的糖成分，或不同的谷粒结构。胚乳由精子和卵形成，而且对双亲的选择将影响胚乳的构成。
本发明由两个主要方法构成。利用突变体育种可在所选择的作物品种范围内形成本发明。利用基因转化植物可以在各种植物中形成本发明，其中所述基因可以部分下调淀粉合成途径中的两种或多种酶。更确切地说，将淀粉合成途径中的同型酶之一的活性下调为正常酶活性的大约1/3，而另一同型酶是正常酶活性的2/3，或者将淀粉合成途径中的两种同型酶都下调至正常酶活性的大约2/3。每种方法都有其自身的优点。
首先，利用突变体在谷类作物中开发出独特谷物和淀粉是广为人知的。然而，本发明之所以极具特色和出人意外是因为预计本发明产生具有正常淀粉特性的谷粒。下表将说明本发明是如何出人预料。
表1亲本的基因型 胚乳的 淀粉的类型(首先为雌性) 基因型 淀粉产量野生型AA*AA AAA 正常正常基因量AA*aa AAa 正常正常aa*AA aaA 正常正常单突变aa*aa aaa 改变降低-双突变aa/bb*aa/bb aaa/bbb 改变降低本发明的预期结果中间突变体aa/BB*AA/bb aaA/BBb 正常正常AA/BB*aa/bb AAa/BBb 正常正常aa/bb*AA/BB aaA/bbB 正常正常aa/bb*aa/BB aaa/bbB 正常正常aa/BB*aa/bb aaa/BBb 正常正常本发明的实际结果中间突变体 aa/BB*AA/bbaaA/BBbAltered Medium toAA/BB*aa/bbAAa/BBbAltered high-70％aa/bb*AA/BBaaA/bbBAltered of normalaa/bb*aa/BBaaa/bbBAlteredaa/BB*aa/bbaaa/BBbAlteredaa＝突变基因(纯合的)AA＝野生型(或未突变纯合基因)*＝表示两个品种间的传粉杂交aa/bb＝两个突变基因(均为纯合的)
很显然，因为表中所示本发明胚乳的基因型不具有完全隐性的基因，预计淀粉的产量和结构将是正常的。实际上，根据本发明并未表明谷物具有正常的淀粉结构。从历史上讲，当有改变了的淀粉产生时，通常产生的只是极少量的。本发明改变的淀粉出人意外地高于预期量。此外，该淀粉的生产比双突变体作物的生产要简单地多。以前，只有单突变体杂种被广泛用于淀粉的大规模生产。而且，为了开发双突变体，两个亲本都必须带有突变，后者需要进行有意义的研究和开发性的尝试，结果淀粉产量不高，种子凝胶化力不良。因此，只有小规模生产双突变体是可能的。
本发明包括生产具有改变了淀粉品质之谷物的方法，包括种植能够开花的亲本，该亲本已基本上完全降低了淀粉合成途径中至少一种特定同型酶(A)的活性，而没有降低淀粉合成途径中至少另一种特定同型酶(B)的活性。另一亲本未降低淀粉合成途径中一种同型酶(A)的活性，而基本上完全降低了至少一种其它特定同型酶(B)的活性。然后，必须消除所述第一亲本产花粉的能力，使得传粉作用由所述第二突变体亲本进行，最后收集由所述第一亲本产生的谷粒。此外，本发明的方法可以包括从谷粒中提取淀粉，并将所述淀粉作为特产淀粉用于能显示其价值的各种用途中。
为了制备本发明的溶胶，可以制备含有水和有效量的本发明淀粉的浆，并将溶胶进行烧煮以形成浆糊。总的说来，烧煮使得浆的温度升至大约淀粉的胶化温度以上，并使淀粉进行足够的剪切，以致颗粒裂开，浆糊形成。不必使所有的颗粒都裂开。优选地是，溶胶含有的本发明淀粉的量是溶胶总重量的大约1-20％。浆在约90℃以上烧煮，以在加入食料前提供增稠特性。烧煮时间约为1O分钟。如果淀粉已经加工，使之在冷水中可膨胀，则本发明的溶胶不需烧煮。烧煮步骤一般包括将本发明淀粉的水浆温度升至所述淀粉的胶化温度，并将淀粉进行剪切，使颗粒裂开，浆糊形成。
将本发明淀粉的溶胶或增稠剂组合物以常规方式加入食料中，为食料提供本发明淀粉的优点。
为了制备增稠的食料，将根据本发明制备的溶胶与食料结合，再将该组合物烧煮至所需程度以提供增稠食料。进行常规的混合使溶胶与食料结合。烧煮溶胶与食料的组合物也可以常规方式进行。
可以选择地是，将本发明的淀粉与食料混合，或将含有本发明淀粉和水的浆与食料混合，再将所得混合物烧煮至所需程度，得到增稠的食料。当将淀粉本身或含淀粉本身的浆与食料混合时，必须烧煮所得的混合物，以提供增稠的食料。以常规方式完成混合及烧煮。烧煮在大约90℃以上进行。烧煮时间约为10分钟，但可以根据烧煮过程中进行混合时所存在的食料的量和剪切量的不同而变化。
这类增稠剂组合物能够为用户提供极大的经济优势。那些熟悉现有技术的人长期利用各种胶化树胶完全断裂的质地(clean breakingtexture)。本发明的应用包括但不限于树胶糖果、胶化甜点。糖皮和涂抹食品，并能够替代传统的胶化树胶，如κ角叉藻、琼脂、果胶或明胶。然而，这些常规胶化树胶可以是非常昂贵的，并存在包括走味、缺乏热或酸稳定性、有限的可得性或缺乏犹太教规的批准等其它不利之处。已经发现本发明的淀粉能够替代全部或部分所说的常规胶化树胶。
为了替代食品配方中的胶化树胶，可以使用的本发明淀粉与胶化树胶的重量比为大约1∶1。可用更大或更小量的本发明淀粉替代胶化树胶。这类胶化树胶包括明胶、果胶、角叉藻、阿拉伯胶、黄蓍胶、瓜耳胶、刺槐豆胶、Zanthan、琼脂、藻酸铵和羟甲基纤维素。
自然情况下，本发明的淀粉可用于任何食品配方，只要需要提供凝胶特征并从口中彻底碎裂例如，本发明淀粉可用于在此之前使用普通淀粉的食品配方中，藉此提供具有改良特性的食品，即与利用普通淀粉的相同食品配方相比可以彻底碎裂(clean break)。
用本发明淀粉制备的凝胶的彻底断裂适用于各种食品。淀粉凝胶的彻底断裂在各种焙烤食品的应用中都有价值，例如用于馅饼的奶油或水果填充物(如柠檬、香蕉脂或巴伐利亚脂)，以及用于小甜饼的低脂高固水果心。本发明的淀粉还可以改善奶油冻、牛奶蛋冻、果酱饼例如无花果条形饼(fig bar)和肉冻的质地。
在本说明书和权利要求中所用的术语淀粉表示的不仅仅是从含淀粉植物中提取的基本纯的淀粉颗粒，而且也包括淀粉颗粒的谷类产品，如面粉、去壳谷类、玉米片和粗粉。
下面给出的本发明的实施例只是为了达到举例说明的目的。这些实施例无意限制本发明的类型或用途。本发明或其谷物或其淀粉或其糖可用于但不限于食料、纸、塑料、粘合剂、涂料的制备以及酒精和玉米糖浆产品的生产。实施例1本发明各种实施方案的物理性质(相似的基因型来自不同的玉米杂交)。所示各表显示了本领域技术人员熟知的评价新型淀粉的数据。有关水分、油、蛋白质、可溶物和淀粉百分比数据用于评价产率和碾磨潜力。淀粉DSC(示差扫描量热法)数据在评价淀粉的烹饪和胶化特性方面有用。淀粉颗粒大小的数据用于决定淀粉的碾磨和分离特性。Brabender和淀粉糊数据对于评价新型淀粉在改善非常需要特定的淀粉增稠、糊化和胶化特性的食品应用中的能力是极重要的。这类数据在被解释为所收集的完整信息时能够使得本领域的技术人员决定，是否需要对淀粉的特性和潜力进行更深入的详细试验
表2-Com DataS93 ％ ％ ％ ％ ％Entry 背景 Row 水分淀粉 蛋白质 油 可溶物1aeaewx 46609.1564.8014.584.477.642aeaesu 46369.2766.2514.774.547.403aeaedu 46129.2466.0114.654.737.804wxwxae 46009.0765.7213.914.388.145wxwxsu 46489.0666.0314.794.087.836wxwxdu 46248.7765.3215.624.278.237susuae 45948.8564.8313.114.718.498susudu 46728.7365.3913.205.018.359susudu 46188.7765.1514.524.358.2610 single ae 45829.1460.5215.195.959.2911 single wx 46548.8365.4414.044.779.4312 single su 46307.7554.9814.256.509.7813 duduae 45888.9769.2612.304.896.8514 duduwx 46668.8870.4311.254.406.9615 dudusu 46429.4870.4313.484.676.9216 single du 46068.5065.5412.026.039.33-Starch DataS93 ％ ％ ％ ％ ％Entry背景Row 水分淀粉 蛋白质 油 直链淀粉 L-max1aeaewx46603.8286.44 1.680.1831.60597.12aeaesu46366.5186.95 1.560.2031.74603.93aeaedu46125.2286.44 1.700.1133.38598.84wxwxae46007.3387.89 0.390.0921.10601.15wxwxsu46487.2785.87 1.320.0924.68591.76wxwxdu46247.3186.07 1.120.1024.57595.27susuae45948.1986.32 0.930.0729.00604.58susudu46728.0987.16 0.520.0827.86599.69susudu46187.6784.20 0.600.1230.82601.110 single ae 45827.1683.31 1.370.1565.55602.111 single wx 46548.3085.16 0.510.140.43 xx12 single su 46306.8280.92 5.08xx 29.32598.413 duduse45886.5884.31 0.620.1729.86xx14 duduwx466611.08 84.77 0.480.1628.74xx15 dudusu46428.4887.34 0.620.1626.07xx16 single du 46068.3680.70 0.460.0837.88608.9
表2-(淀粉)％ ％ ％ ％ ％Entry基因型水分淀粉蛋白质油直链淀粉 L-max1ae ae/wx9.5683.840.630.0529.44593.12ae ae/wx7.9685.940.700.0527.89596.63ae ae/wx 11.7182.540.820.0542.54595.14ae ae/ae6.0984.171.240.1463.60602.45su1 su1/wx 4.3790.000.560.0928.36600.06du du/wx5.9588.500.610.0927.98596.97du du/su1 6.9382.660.690.1029.98600.88fl fl/O 9.2482.720.930.1429.29596.89su1 su1/du 9.0184.820.710.0229.57600.810 su1 su1/ae 7.7884.810.630.0329.90600.811 su1 su1/su2 7.6185.020.490.0229.68602.312 White waxy 18.34 94.94db 0.770.09 2.74526.9-Starch DSC Data基因型 PeakDelta H Peek II Onset EndsetEntry℃ J/g ℃ ℃ ℃1 ae ae/wx 67.711.67 100.062.676.62 ae ae/wx 66.510.3396.861.974.83 ae ae/wx 74.610.00 100.868.883.44 ae ae/ae 81.011.83xx 66.0 107.45 su1 su1/wx69.712.0098.364.277.76 du du/wx 72.211.5099.566.682.37 du du/su1 70.2 9.6798.465.778.38 fl fl/O 71.412.33 100.967.180.79 su1 su1/du68.8 7.8399.563.279.110 su1 su1/ac68.110.3399.861.978.311 su1 su1/su2 67.412.0096.161.379.512 White waxy72.715.33xx 66.182.6-Starch DSC Data背景S93 Peak Delta H Peek II Onset EndsetEntryRow ℃ J/g ℃ ℃ ℃1aeaewx466073.811.1799.467.782.82aeaewx463673.011.50 101.066.683.43aeaewx461273.310.8398.666.783.04wxwsae460072.912.8399.967.481.75wxwssu464873.712.1798.268.281.66wxwsdu462473.611.3399.669.380.57susuae459472.010.3397.767.279.78susudu467271.9 9.8398.967.079.19susudu461872.510.3397.068.479.810 single ae 458284.615.67xx 68.7 106.911 single wx 465472.516.17xx 68.181.412 single su 463070.915.50 100.863.677.213 duduae458871.813.50 100.567.181.114 duduwx466671.910.1798.867.279.515 dudusu464271.710.1797.266.879.016 single du 460671.6 9.50 100.165.879.8
表2-Brabender DataS93 IR HP HF CP CFEntry Background RowBrabender℃ BU BU BU BU1aeaewx 4660 460g/5.5％65.03152859409402aeaewx 4636 460g/5.5％81.52252254704303aeaewx 4612 460g/5.5％84.51801804103804wxwsae 4600 460g/5.5％74.03603555904605wxwssu 4648 460g/5.5％74.03253255404706wxwsdu 4624 460g/5.5％80.03152704804257susuae 4594 460g/5.5％77.02702706105858susudu 4672 460g/5.5％77.02952957856109susudu 4618 460g/5.5％77.029529562062010 single ae 4582 460g/12％ 90.517017024024011 single wx 4654 460g/5.5％68.075036041540512 single su 4630 90g/5.5％ 93.535 35 40 4013 duduae 4588 460g/5.5％83.022522554552014 duduwx 4666 460g/5.5％86.024524560055015 dudusu 4642 460g/5.5％84.527027062058516 single du 4606 460g/5.5％89.070 70 160160IR＝initial riseCP＝cooling peakCF＝cooling final-Brabender DataIRHP HF CPCFEntryGenotype Brabender℃BU BU BUBU1 ae ae/wx 460g/5.5％ 83.0 220220520 4602 ae ae/wx 460g/5.5％ 89.0 220220540 5103 ae ae/wx 460g/5.5％ 84.5 270270510 4504 ae ae/ae 460g/12％90.5 4904901220 8455 su1 su1/wx460g/5.5％ 80.0 250240595 5356 du du/wx 460g/5.5％ 83.0 280250560 4707 du du/su1 460g/5.5％ 50.0/83.0 230230575 5358 fl fl/O 460g/5.5％ 81.5 280255630 5609 su1 su1/du460g/5.5％ 84.5 200200500 46010 su1 su1/ae460g/5.5％ 86.0 205205455 41511 su1 su1/su2 460g/5.5％ 84.5 180180420 38512 White waxy90g/5.5％68.0 830220310 270
表2-Starch Particle Size Data(Volurne Distribution)S93 ％StarchEntry Background Row Mode um Mean um Median um Recovery1aeaewx 466016.9012.5716.04 45.92aeaewx 463616.6311.8215.23 57.93aeaewx 461216.3611.4815.20 52.44wxwsae 460017.4311.6216.53 41.55wxwssu 464817.7212.4316.59 58.86wxwsdu 462417.4812.2216.26 54.17susuae 459416.3611.9615.66 55.58susudu 467216.65 9.8315.29 58.79susudu 461816.3611.8215.61 55.910 single ae 458213.09 9.0712.35 64.011 single wx 465418.0311.9916.85 55.712 single su 4630 7.43 5.16 7.95 5.613 duduae 458816.9011.0115.37 50.914 duduwx 466617.1911.8516.21 52.515 dudusu 464217.1712.2216.01 44.916 single du 460614.419.77 13.19 58.9-Starch Particle Size Data(Volurne Distribution)％StarchEntry Genotype Mode um Mean um Median um Recovery1ae ae/wx 16.6310.9015.70 51.42ae ae/wx 16.1210.4414.92 52.83ae ae/wx 15.6010.5514.60 59.44ae ae/ae 11.53 8.4011.30 63.75su1 su1/wx 14.8810.2414.21 52.56du du/wx 16.3810.7315.12 52.07du du/su1 15.8711.0314.98 53.28fl fl/O16.1210.7315.35 69.39su1 su1/du 15.8710.7314.92 53.710 su1 su1/ae 15.11 7.8514.35 48.511 su1 su1/su215.8510.3314.20 58.412 White waxy 17.19 8.4514.81 71.5
表2-Starch Paste DataBrookfield FreezeViscosityGel-24hr ThawEntry Genorype CPS.20 rpm (grams) Cvcles1ae ae/wx6,200 166.6 02ae ae/wx6,700 227.2 03ae ae/wx8,000 256.3 04ae ae/ae14,250111.1 05su1 su1/wx 6,800 173.4 06du du/wx6,000 141.4 07du du/su1 7,100 215.4 08fl fl/O 7,500 209.4 09su1 su1/du 6,300 219.7 010 su1 su1/ae 6,000 172.2 011 su1 su1/su2 5,500 158.8 012 White waxy 1,900 15.33-Starch Paste DataBrookfieldFreezeS93 Viscosity ThawEntry Genotype Row CPS.20rpm Gel-24hr Cvcles1ae ae/wx 466025,000 151.8 02ae ae/wx 46366,500 240.1 03ae ae/wx 46123,150 216.6 04ae ae/ae 46005,600 159.5 05su1 su1/wx 46486,100 126.4 06du du/wx 46245,700 114.4 07du du/su145948,700 254.8 08fl fl/O 467212,000 272.8 09su1 su1/du 461810,250 233.6 010 su1 su1/ae 45822,500 53.7*011 su1 su1/su2 46543,100 13.3 012 White waxy 4630275 29.0 313 duduae 45887,200 226.5 014 duduwx 46667,300 233.4 015 dudusu 46425,100 332.9 016 single du46061,650 99.3 0*came out as a plug定义示差扫描量热法(DSC)IR表示初始上升HR表示加热峰HF表示加热终点CP表示冷却峰CF表示冷却终点Brookfield粘度计Brookfield粘度计检测淀粉糊的剪切强度(以厘泊cP表示)和稳定性。Brabender淀粉粘性测定仪数据糊化温度表示淀粉糊形成的温度。
峰粘度表示提供可用之淀粉糊所需的温度。
95C的粘度表示易于烹饪淀粉。
50C的粘度表示热淀粉糊冷却过程中粘度倒退。
1小时后50C的粘度表示已烹饪淀粉糊的稳定性。
玉米中的蛋白质、淀粉、油和水分百分比玉米中油、淀粉和蛋白质的百分比反映了对淀粉可回收产量的测定。淀粉中的蛋白质、淀粉、油和水分百分比淀粉中油、淀粉和蛋白质的百分比反映了对淀粉纯度程度的测定，并表明了可碾磨性(millability)。直链淀粉和L-MAX的百分比这些数据提供了对淀粉中表观直链淀粉水平的检测结果。淀粉颗粒大小数据淀粉颗粒大小表明了经碾磨加工后的淀粉产率和回收能力。速记记录文字表2中的aeaewx表示aeaeAE/wxWxWx，同样地duduwx表示duduDU/wxWxWx。整个表中都没有列出野生型。
图1是直链淀粉增补剂和暗淡的性状的单突变体突变的等位基因之各基因量(例如MMM、mMM、mmM、mmm)的酶活性图。这些数据显示了下列酶的活性蔗糖合成酶(ss)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDPG-PP)、葡萄糖激酶(GK)、果糖激酶(FK)、葡萄糖磷酸变位酶(PGM)、磷酸葡糖异构酶(PGI)、ATP依赖性磷酸果糖激酶(PFK)、PPi依赖性磷酸果糖激酶(PFP)、ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPG-PP)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、分支酶(BE)和结合性淀粉合成酶(BSS)。酶活性是以相对于野生型对照(MMM)的百分比表示的。在完全突变体的情况下(mmm)，对淀粉合成途径中各种酶的表达水平存在显著的影响。而在部分突变体的情况下(mMM和mmM)，对表达水平几乎没有产生可检测到的变化。这些数据表明，用单突变体所观察到的淀粉品质的改变是数种酶过表达以及消除突变的等位基因编码的酶的结果。通过将两个突变量(例如wxwxWx)和另一突变的其它量(例如AeAeae)相结合，将在其余途径中看不到过度表达的情况下部分地降低两种酶的活性。
图2是淀粉的DSC扫描图，这些淀粉是从得自蜡状、直链淀粉增补剂和普通(野生型)玉米的谷粒中提取的。这类DSC扫描结果能为本领域的技术人员提供大量数据(参见本文表中所示的有关峰值温度、ΔH、峰II温度、起始温度和最终温度的数据)。特别值得注意的是，直链淀粉含量高的淀粉图不同于普通淀粉和蜡状淀粉。
图2b是从得自双突变体(aeaeae/wxwxwx)玉米的谷粒中提取的淀粉的DSC扫描图。这类DSC扫描结果能够为本领域技术人员提供大量数据(参见本文表中所示的有关峰值温度、ΔH、峰II温度、起始温度和最终温度的数据)。特别值得注意的是，双突变体的图不同于图2a中有关普通淀粉和单突变体、蜡状及高直链淀粉的淀粉所提供的。
图2c是从得自中间突变体(aeaeAe/WxWxwx)玉米的谷粒中提取的淀粉的DSC扫描图，这类扫描结果能够为本领域技术人员提供大量数据(参见本文表中所示的有关峰值温度、ΔH、峰II温度、起始温度和最终温度的数据)。特别值得注意的是，中间突变体淀粉的扫描图不同于双突变体淀粉的，但似与蜡状淀粉的类似。
图2d是从得自中间突变体(wxwxWx/AeAeae)玉米的谷粒提取的淀粉的DSC扫描图。这类扫描结果能够为本领域技术人员提供大量数据(参见本文表中所示的有关峰值温度、ΔH、峰II温度、起始温度和最终温度的数据)。特别值得注意的是，该中间突变体淀粉的扫描图不同于双突变体淀粉的，但似与蜡状淀粉的相类似。
图3a是在中性或酸性条件下得自普通淀粉的Brabender数据图。普通玉米淀粉显示在所利用的酸性条件下粘度基本被破坏。
图3b是在中性或酸性条件下得自蜡状玉米的Brabender数据图。在中性条件下，蜡状突变最特别地影响淀粉的粘度。
图3c是在中性或酸性条件下得自直链淀粉增补剂(70％直链淀粉)淀粉的Brabender数据图。在酸性或中性条件下，含直链淀粉多的淀粉增加了粘度。
图3d是在中性条件下得自双突变体(aeaeae/wxwxwx)淀粉的Brabender数据图。双突变体淀粉尽管是纯合的蜡状突变，但仍维持原来的粘度。
图3e是中性条件下得自中间突变体(aeaeAe/WxWxWx)淀粉的Brabender数据图。由这些数据应特别值得注意的是，新的中间突变体淀粉虽然所含表观直链淀粉的量并没有增加，但却提供了类似于用高直链淀粉突变体所见的粘度强度增加。
图3f是中性条件下得自中间突变体(wxwxWx/AeAeae)淀粉的Brabender数据图。由此特别值得注意的是，该新的中间突变体淀粉虽然所含表观直链淀粉的量并未增加，但却提供了类似于用高直链淀粉突变体所见的粘度强度增加。实施例2本实施例说明具有本发明淀粉之玉米谷物的生产。利用传统的育种和/或回交技术，或者利用如经化学物质处理花粉的诱变方法，可将各种遗传背景的玉米植物转变成突变体基因型。另一种选择是，也可以从大量供应商和基金种子公司购买蜡状近亲繁殖品系和杂种。可以使用任何具有良好农艺学特性和较高产量的玉米品系。在本发明中，通过化学诱变及从分离的后代中精心选择突变的谷物类型，可以将正常的近亲繁殖品系转变为突变品系。所述方法是本领域技术人员所熟知的(参见例如Neuffer，M.G.and Chang，M.T.1989.生物学及农艺学研究中的诱导突变Vortr.Pfalzenzuchtg.16，165-178)。任何有商业价值的近亲杂交品系都可用于该方法。通过等位性试验证实所述品系载有所感兴趣的突变，在所述等位性试验中该品系可与已知的突变品系杂交，该方法是本领域技术人员熟知的。而且，该品系的谷粒应具有典型的所选突变的外观和碘染特性，该方法是本领域技术人员已知的。为了从植物中获得最高产量，最好是接下来进行两个近亲杂交品种间的杂种杂交，所述的两个近亲杂交品种带有相同的突变(例如均为蜡状或直链淀粉增补剂型)。优选产生两个杂种，一个为雄性，并且对于一种突变是纯合的，另一个为雌性，并且对于另外的突变是纯合的。雌性和雌性杂种可以构成相同或不同的遗传背景，具有相似的田间成熟度(即从凝胶化至长须和花粉散布需要相似的热单位)对于所述两品系是十分重要的。为了使得田间的中间突变体进行杂交，需要从雌性植物消除花粉的产生。这可经多种方法进行，包括但不限于人工传粉作用、人工和机械去雄，将遗传性或胞质性雄性不育渗入雌性植物、通过遗传转化导入雄性不育和使用化学去雄剂。该杂交谷物含有本发明之基因型为aaA/BBb的胚乳，得自该基因型的淀粉称之为中间突变体淀粉。对于最优淀粉品质而言，尽可能地完善其遗传背景这一点是本领域技术人员熟知的。实施例3可以使用多种不同的方法将淀粉从谷物中提取出来。最通用的方法包括为世界范围公知公用的“湿度”法。其基本原理包括浸泡和淀粉分离。该方法的关键步骤在于在浸渍液罐中软化谷物，该过程已经最优化设计，以使达到玉米谷粒成分的最适分离。利用该方法从实施例2开发的中间突变体谷物中提取淀粉(wxwxWx/AeAeae)。胚芽很容易完整地脱离出来，并且不含胚乳和外壳。在水中浸软胚乳，其淀粉易于以白色凝块分离出来，谷蛋白以黄色凝块获得。将谷物置于通常容纳50-90公吨谷物的罐中于48-52℃浸渍30-40小时。浸渍水含0.2％二氧化硫(SO2气以气泡充入)，因此呈微酸性(pH4.0)。二氧化硫有助于分解蛋白质基质，使得胚乳基质裂解为颗粒。浸渍后，将谷物粗略地研磨或捣成浆状。富含油类的胚芽浮至表面，密集淀粉的胚乳则下沉。通过水力旋流器(连续分离法)完成分离。在通过“称为Entoleter粉碎机的冲击研磨机”进行碾磨后，淀粉得以进一步纯化，所述粉碎机通过逆转式开槽的硬化钢合金板商速破碎浆，随后以外冲击环冲击。通过离心形成两个部分，即蛋白质(70％蛋白质)和淀粉(2％蛋白质)而使脱须根的淀粉与谷蛋白分开，加工温度维持在45℃以上，以防止微生物繁殖。通过注入加热至200-260°F气流的急骤干燥法干燥淀粉。
各种中间突变体谷物具有以所述方式纯化和制备的淀粉，适用于各种食品、饲料和工业用途。其可以未修饰的玉米淀粉直接应用。也可以通过保留颗粒结构的化学或物理处理进行修饰，可以洗涤颗粒以除去残余的反应剂，有时使用漂白步骤以产生超白淀粉。这种淀粉可经高温处理而凝胶化，直接作为凝胶化淀粉出售。这类淀粉可以是经化学修饰并且是干燥的。聚合物本身可以被部分或完全水解，产生麦芽糊精或葡萄糖。这类产物可以通过发酵而进一步改性，以产生汽油工业所用的酒精，或者将葡萄糖转变成用于甜味剂工业的高粱糖玉米糖浆。实施例4称为皱缩-2(sh2)、脆-2(bt2)、暗淡的(du)、糖(su)、蜡状(wx)和直链淀粉增补剂(ae)的突变编码下列酶的同型酶ADP葡萄糖焦磷酸化酶、脱支酶、可溶性淀粉合成酶、结合性淀粉合成酶和分支酶。
皱缩-2编码-单位ADP葡萄糖焦磷酸化酶。
脆-2编码-单位ADP葡萄糖焦磷酸化酶。
蜡状的编码颗粒结合的淀粉合成酶。
直链淀粉增补剂编码同型分支酶。
暗淡的可改变同型不溶性淀粉合成酶和分支酶的表达。
含糖的改变不溶性淀粉合成酶和脱支酶的表达及活性。
利用已知的突变体和基因剂量杂交方案，我们检测了被改变基因的表达对谷物中淀粉贮存的影响(参见附图)。利用bt2突变体，我们观察到可检测的ADP葡萄糖焦磷酸化酶活性呈渐进性丧失，其与谷物中淀粉合成的减少有很好的相关性。由这些数据不能定量该酶所产生的流向淀粉的控制强度。事实上，我们的研究表明，该酶是淀粉合成过程中主要的决定因素之一，并且几乎不能控制淀粉合成的速度。该突变设有明显地改变淀粉结构。当具有含糖的、暗淡的、蜡状的和直链淀粉增补剂的基因型突变时，我们目前的确检测到了淀粉精细结构的改变(分支的链长改变以及直链淀粉与支链淀粉比例的变化)。在这类情况下，对于流向淀粉的控制更小(除用用于制备甜玉米基因型的含糖突变体以外)。在所有的这些情况下，淀粉合成酶和分支酶的比例都发生改变，从而导致淀粉精细结构的变化。在这些研究中所得到意外新的结果是发现了不仅突变可以降低关键酶的表达，而且还可以诱导合成途径中其它酶的过度表达。另外，仅在完整突变体(mmm)基因型中我们观察到了淀粉精细结构的变化，这表明结构变化只发生在同型酶的丧失并伴有同型酶的过度表达的情况下。当不希望被这一提议所约束时，这些数据说明淀粉结构不仅受降低一种酶的表达(例如用反义构建体)的影响，而且还受同时增加的表达(例如用有义构建体)的影响。
用于本发明方法的植物转化载体可用标准技术构建。因为所述酶定位于细胞的淀粉质体部分，所以，基因构建体需要存在淀粉质体转移肽以保证其在淀粉质体中的正确定位。转化构建体可以部分有义方向或以反义方向携带基因。在植物中表达所述基因导致由现有技术已知为“有义共同抑制或反义(sense cosuppression or antisense)”的作用引起的酶表达的降低。当只需要降低表达时，并不需要转移肽。然而，需要酶的过度表达时，则正确的质体击靶(targeting)序列在构建体中是需要的，本发明所需的关键酶包括分支酶和可溶性及结合的淀粉合成酶。分支酶[1，4-α-D-葡聚糖1，4-α-D-葡聚糖6-α-D-(1，4-α-D-葡聚糖(glucano))转移酶]可将直链淀粉转变为支链淀粉(1，4-α-D-葡聚糖链片段转移到类似的葡聚糖链上的伯羟基)，该酶有时称为Q酶。可溶性淀粉合成酶[ADP葡萄糖1，4-α-D-葡聚糖4-α-D-葡糖基转移酶]延伸支链淀粉，可能还有直链淀粉的链长。结合的淀粉合成酶[ADP葡萄糖1，4-α-D-葡聚糖4-α-D葡糖基转移酶]延伸直链淀粉，可能还有支链淀粉的链长。
对于任何反义或有义共同抑制构建而言，只需要在转基因植物中表示部分cDNA克隆。在需要酶的过度表达时，则需要表达全长cDNA克隆。有人已研究了玉米分支酶I的序列(Baba，T.，et al.，Plant Physiology.103.565-573，1993)。Fisher，D.K.等人(Fisher，D.K.，Boyer，C.D.和Hannah，L.C.Plant Physiology.1021045-1046，1993)研究了玉米胚乳的淀粉分支酶II。另有文章报道显示了76KDa多肽与玉米(cv B73)胚乳可溶性淀粉合成酶I活性间的关系(Mu，C.，et al.，Plant Journal 6，151-159，1994)。编码UDP-葡萄糖淀粉葡糖基转移酶的玉米蜡状基因座位已在1986年克隆(Kloesgen，R.B.et al.，Mol.Gen.Genet.203，237-244)。最近，James，M和Wright，A.利用转座子诱变定位基因的方法观察到相应玉米糖基因座位的序列(The Plant Journal)。据认为，编码任何这类蛋白质的基因都涉及脱支酶，并可用于本发明的构建体。
据信，叶绿体转移肽具有类似的序列(Heijne et al.，Plant Mol BiolReporter，9(2)104-126，1991)。其它的有效转移肽包括ADPG焦磷酸转移酶(Plant Mol Biol Reporter，9104-126，1991)、小亚单位RUBISCO、乙酰乳酸合成酶、甘油醛-3P-脱氢酶和亚硝酸盐还原酶。例如，来自许多基因型的小亚单位RUBISCO转移肽的共同序列为MASSMLSSAAVATRTNPAQASM VAPFTGLKSAAFPVSRKQNLDITSIASNGGRVQC玉米的小亚单位RUBISCO转移肽具有的序列是MAPTVMMASSATATRTNPAQAS AVAPFQGLKSTASLPVARRSSRSLGNVASNGGRIRC.玉米的叶子淀粉合成酶的转移肽序列为MAALATSQLVATRAGLGVPDAS TFRRGAAQGLRGARASAAADTLSMRTASARAAPRHQQQARRGGR FPSLVVC.实施例5自1990年以来，人们一直在进行不育性转基因玉米植物的生产。尽管已知大量的DNA传递系统，但仍选择的是微粒轰击。如上所述，各种玉米突变体基因构建体可从美国和欧洲的保藏机构获得。附图4a-4d所示的是这些构建体中的一些新的例子。图4c显示了CaMv(花椰菜花叶病毒)启动子、蜡状基因，Adhl，nos(ncpoline)和用作可选择标记的pat基因和amp，图4d类似，但显示了构建体中可溶性淀粉合成酶的第一同型基因。图4a也有相同的构建体，但显示了分支酶第一同型基因。图4b显示第二分支酶第二同型基因。当然，也可以得到与玉米育种中使用的基因突变体相关的其它构建体。
本实施例参考图4c，蜡状基因构建体。本实验的目的是形成具有部分下调蜡状基因作用的近亲杂交品系。如果所选的近亲杂交品系已为ae突变体，则通过与非突变的近亲杂交品系杂交所产生的谷物将是中间突变体谷物。根据下调作用的强度不同，雌性近亲杂交谷物将与淀粉和谷物的mm*/mm*型或mm*/m*型相似。很清楚，转化作用使得产生淀粉合成活性更精确的下调作用方式，以致淀粉的改变显得更加协调。
为了保证蜡状基因下调作用的程度合理，转化作用的靶组织是未成熟的合子胚芽，还可以使用整个胚形成的愈伤组织。可以选择的A188植物未成熟合子胚芽是在用B73ae近亲杂交品系传粉12天之后。愈伤组织的培养基为6mM L-脯氨酸、2％(w/v)蔗糖、2mg/ml 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和0.3％(w/v)Gelrite(Caroline BiologicalSupply)(pH6.0)。培养愈伤组织，并开始悬浮培养。
以MS为基础的液体培养基含有100mg/l肌醇、2mg/l 2，4-D，2mg/l 1-奈乙酸(NAA)，6mM脯氨酸，200mg/l酪蛋白水解酶(DifcoLaboratories)，3％(w/v)蔗糖和5％(v/v)椰子水(DifcoLaboratories)(pH6.0)。细胞悬液在含上述培养基的125ml锥瓶中维持于28℃，在暗处以125Mom于回转摇床中摇育。
筛选图4c的转化载体，该质粒含有355-ladh-pat nos 3′可选择基因表达盒。
将细胞悬液筛分，然后悬于5ml悬浮培养基中，并置于通过真空管的滤纸上。如现有技术已知的，将构建体包入微粒中。然后轰击平板。再将细胞转入N-6培养基，并在14天后经1mg/l选择转化细胞。将细胞悬于含有6％(w/v)(Sea-Plaque；FMC)的培养基中，并置于37℃。
2-5周后，移出生长的愈伤组织，并转移至新鲜的选择培养基表面。植物在具有6％蔗糖1g/l肌醇、1mg/l NAA(34)和0.3％(w/v)Gelrite(pH6.0)的MS基培养基中再生。接下来，胚在0.25mg/l NAA和3％(w/v)蔗糖的MS培养基中于光照条件下凝胶化。植物生长，并移至温室中。然后可以评估植物中的表达水平。
植物育种，并发展为具有突变体和下调作用途径的近亲杂交品系，另外，所选择的近亲杂交后代在转化后可以具有杂交到转基因植物上的突变体，当转基因植物用作雌性时可在谷物中形成所需淀粉。实施例6本实施例说明本发明淀粉与其它淀粉相比的凝胶化温度。所述凝胶化温度列于下表3中。
表3淀粉样品直链淀粉*凝胶化温度*℃1天然普通玉米 28 712天然的AMY V57 803天然的AMY VII 73 904本发明 21 735天然的aewx 25 806天然的wxwxwx3 72*数值四舍五入到整数样品1为商业化产品(美国玉米产品公司，Hammond，Indiana)。上述样品1的直链淀粉百分比和凝胶化温度是由产品的随机抽样测得的均值。直链淀粉百分比和凝胶化温度的99％可信度分别为25.9-29.3和68.7-72.9。
AMY V和AMY VII是商售的高直链淀粉玉米淀粉(美国玉米产品公司，Aammond，Indiana)。上表3所示的直链淀粉百分比和凝胶化温度是经随机抽样测得的均值。AMY V和AMY VII直链淀粉百分比的99％可信区间分别为53.4-62.5和65.5-73.8。两者凝胶化温度的99％可信区间分别为72.8-84.4和83.1-90.8。AMY V和AMY VII都以天然玉米生长。
淀粉样品4对应于本发明，而样品5相当于US5,099,911实施例1的均值。样品6相当于商售的蜡状淀粉(美国玉米产品公司)。
测定直链淀粉百分比和凝胶化温度的方法如下用标准的量热碘法测定直链淀粉百分比，其中淀粉首先用氢氧化钠胶化，然后与碘液反应，用分光光度计在1cm池中于600nm相对2％碘液的空白检测所得样品。
按照厂商提供的相应手册上的方法，用Mettler 300型扫描量热仪用30％淀粉固体检测DSC凝胶化温度。
由上表3显而易见，本发明淀粉的凝胶化温度可与普通玉米淀粉相比。
实施例7本实施例说明由本发明玉米淀粉制备的溶胶分别由aewx玉米淀粉、普通玉米淀粉和wxwxwx淀粉制得的溶胶比较凝胶强度。试验结果列于下表4中。
表4样品强度(克)本发明 159.5普通玉米淀粉225.0aewx玉米淀粉55.0蜡状玉米淀粉16.0为了进行上表4所示的胶强度试验，通过将水与淀粉混合制得溶胶，再将浆经快速加热方式在Brabender淀粉粘度测定仪中加热至50℃。一经达到50℃，则将仪器设定为1.5℃/分的可控性加热速度，直至达到95℃。然后将样品在95℃维持30分钟。接下来，将样品以1.5℃冷却至50℃，历时30分。将这些溶胶分别加入已置入活塞的4盎司的瓶中。然后使溶胶于室温条件下静置24小时，通过测定将活塞从溶胶中取出所需的力来测量胶强度。
本实施例说明由本发明制备的溶胶胶强度可与普通玉米淀粉溶胶的相比。实施例8本实施例说明aewx淀粉与本发明淀粉间的区别，所述的aewx淀粉是一种其植物具有三倍量蜡状基因的蜡状淀粉。所有的淀粉都是玉米淀粉。
测试所有淀粉的流变特性。每种淀粉都用相同的方法经过相同的试验过程。利用带有冷却探测器向下和带有750g cm筒的Brabender淀粉粘性测定仪糊化淀粉颗粒。在Brabender杯中，将5.5％起始固体的淀粉浆迅速加热至60℃，然后糊化，同时以1.5℃/分的速度加温至95℃。淀粉糊在该温度下维持20分钟，然后立即上样至已预热到70℃的流变计的测量geometry上。进行分份流变特性鉴定。当样品从70℃冷却到25℃并维持4小时后，检测以.2赫兹和.2％张力监测结构形成(很好地落入线性粘弹性区)的凝胶固化段。还要检测的是张力的波动，这将检测淀粉糊或胶对张力水平增加的流变反应，这一过程也在0.2赫兹、25℃进行。
利用所述技术可以发现aewx淀粉和本发明淀粉间的明显区别。图5显示了胶固化分析的结果。初始模数(G′)低于aewx淀粉的本发明淀粉，更快地形成结构或胶化，这由迅速升高的G′得以证明。因此，本发明淀粉与aewx淀粉的区别在于胶形成的速度，尽管两者的表观碘结合量相似。图6显示了仅对本发明淀粉和aewx淀粉进行张力波动分析的结果。其中本发明淀粉表现了膨胀性能，这由张力水平升高时G′升高所证明。所形成的结构在所用张力水平下没有受到破坏。相反，aewx淀粉的结构在所用张力逐步超过4％时则被迅速破坏。因此，与aewx淀粉相比，本发明淀粉形成了在本试验所用张力水平下不破裂的胶。相反，aewx淀粉显示了极低的时间依赖性结构形成，并且在上述技术所用张力下的确“破裂”或被破坏了。实施例9本实施例说明本发明增稠剂组合物的制备。
将本发明的淀粉与水以一定量混合，产生具有10％淀粉重量的浆。该溶胶质脆味温。将其于约90℃烧煮10分钟时，溶胶形成增稠剂组合物，其比由普通玉米淀粉制备的类似增稠剂组合物具有更好的透明度和更脆的质地。实施例10本实施例比较由本发明淀粉制备的胶与普通淀粉制备的胶的口感。
利用Brabender淀粉粘性测定仪将普通淀粉和本发明的淀粉糊化。淀粉以5.5％固体制浆，然后以快速加热方式加热至50℃。利用可控性加热速度(1.5℃/分)将浆加热至95℃，然后在该温度维持30分钟。最终的固体为5.9％。再将淀粉糊样品倾入小果冻罐中，用玻璃纸盖上，使之在进行分析前老化24小时。然后请品味专门小组成员针对下列属性给样品评级。
首先，评判两者手感的相对硬度。
普通淀粉本发明淀粉5.1 6.6其次，评定咀嚼时样品的相对断裂程度，硬度和清除速度。
普通淀粉 本发明淀粉完全断裂程度3.2 8.5硬度4.4 4.5清除速度2.5 4.6这些结果表明这些样品的硬度相似。然而，本发明的淀粉在被咀嚼时能很彻底地断裂。
而且，本发明淀粉胶比普通淀粉胶趋于更迅速地从口中清除。专门小组成员一致认为本发明产生的胶类似于明胶或果胶，有“清洁”的口感。实施例11本实施例说明利用本发明的淀粉制备胶糖。
所用成分和方法如下表5成分％by Weight本发明(％，重量)44/62未混合的玉米糖浆56.32糖，精细颗粒 23.98水 7.73本发明淀粉 11.80
柠檬酸 0.07柠檬酸钠 0.08100.00方法混合所有的成分，然后利用常规设备(如喷射蒸煮锅)蒸煮至340°F。再将所蒸煮的浆注入糖模具中，使之固化。实施例12本实施例说明利用本发明制作巴伐利亚奶油馅饼。
所用成分及方法如下表6成分 ％ by Weight本发明(％，重量)3.5％鲜全奶 72.794糖，精细颗粒 17.586盐，粉末 0.101本发明 5.410香蕉香料 0.300新鲜蛋黄 3.809100.000方法除了蛋黄外，将所有的馅饼填充成分混合，并于195°F蒸煮3-5分钟。然后将该成分随着恒速搅拌冷却至120°F。接下来加入蛋黄，充分混匀混合物。再将混合物加入常规的馅饼坯中，在享用前使之冷却至室温。实施例13本实施例说明用本发明淀粉制作柠檬馅饼填充物。所用成分和方法如下方法将一半的水与糖合并，煮沸之。将所有剩余成分一起制浆，然后加至煮沸的糖水中。将该混合物的温度调至200°F，维持2分钟。再将混合物注入备用的馅饼坯中，使之冷却、固化。实施例14本实施例说明利用本发明淀粉制作巧克力奶油冻。表8中的配方用于制备奶油冻混合物。
表8％Frodex 24-92439.20糖(焙烤食品用的) 30.75Whiptreme 3554(Kerry成分)12.88本发明淀粉 9.80可可粉，荷兰红 7.17(Gill & Duffus Products)Leceitreme 40(Kerry成分) 0.20香料 如果需要的话100.00方法合并各成分，形成均匀的混合物。用法将200g奶油冻混合物与1杯(250克)牛奶混合。用电动混合器以低速将其混合1分钟。刮一刮钵子。高速混合3分钟，直至变得轻而膨松。用勺子舀至用餐盘中，享用前置冰箱中1小时。
为了制备奶油冻混合物，将所有的成分混合。为了制备奶油冻本身，将200g奶油冻混合物与250g牛奶合并，并低速混合。然后再高速搅拌混合物，使之轻而膨松。混合物置冰箱中1小时。用这种方法即制得轻且膨松的奶油冻。
因此，本发明以针对本发明优选实施方案的某种程度的特殊性进行描述。不过应该意识到，本发明由根据现有技进作解释的所附权利要求进行限定，因而可以在不违背其中所包含的创造性观念情况下对本发明的优选实施方案进行修饰或改变。
权利要求
1.一种植物，含有包括使所述植物的淀粉合成途径中至少两种特定同型酶活性产生不完全降低之基因的基因组物质。
2.根据权利要求1的植物，形成的淀粉具有不同于由类似于权利要求1所述植物形成的淀粉的分支结构，含有不形成所述植物的淀粉合成途径的同型酶的基因组物质。
3.根据权利要求2的植物，所述淀粉在谷物中形成。
4.由植物产生的谷物，其基因型为mm*/n**，其中m为第一突变体，n为第二突变体，*等于野生型。
5.一种产淀粉植物，含有包括使所述植物的淀粉合成途径中的至少两种特定同型酶活性不完全降低之基因的基因组物质，藉此，所述植物实质上产生的淀粉比如果所述基因使淀粉合成途径中的相同两种特定同型酶活性完全降低时所述植物将产生的淀粉要多。
6.一种谷物，具有选自下列基因型组成的胚乳基因型wxwxWx/AeAeae，aeaeAe/WxWxwx，wxwxWx/SuSusu，susuSu/wxWxwx，aeaeAe/SuSusu，susuSu/AeAeae，wxwxWx/DuDudu，aeaeAe/DuDudu，susuSu/DuDu du.
7.一种谷物，其胚乳基因型含有两个剂量的影响淀粉结构的一种基因第一突变体的等位基因和一个剂量的影响淀粉结构的第二种基因的第二突变体的等位基因，所述基因可以选自蜡状的、直链淀粉增补剂的、暗淡的、角状、含糖的、皱缩的、脆的、粉状和不透明的基因。
8.从根据权利要求7具有wxwxWx/AeAeae基因型的谷物中提取的淀粉。
9.从根据权利要求7具有Aeaeae/WxWxwx基因型的谷物中提取的淀粉。
10.一种产淀粉植物，具有aa/BB二倍体基因型和aaA/BBb三倍体胚乳基因型，其中a是隐性的突变基因，A是野生型基因，b是隐性突变基因，B是野生型基因，其淀粉已由正常淀粉发生了改变，a和b可选自ae、du、wx、sh、bt、h、su、fl、op，A和B可选自Ae、Du、Wx、Sh、Bt、H、Su、Fl、Op。
11.一种植物，具有aA/Bb/Cc二倍体基因型和aaA/BBb/CCc(和其其它组合)三倍体胚乳基因型，其中a是隐性突变基因，A是野生型基因，b是隐性突变基因，B是野生型基因，淀粉由正常淀粉发生改变，a和b可选自ae、wx、sh、bt、h、su、fl、op、du，B和A可选自Ae、Wx、Sh、Bt、H、Su、Fl、Op、Du。
12.生产具有改变了淀粉品质之谷物的方法，包括下列步骤a)种植亲本，其能开花，并完全降低了淀粉合成途径中至少一种特定同型酶的活性；b)种植第二亲本，其完全降低了淀粉合成途径中至少另一种特定同型酶的活性；c)消除所述第一亲本产花粉的能力；d)用所述第二亲本的花粉传授给所述开花的第一亲本；e)收集所述第一亲本产生的谷物。
13.根据权利要求12的方法，包括从所述谷物中提取改变的淀粉。
14.从权利要求4的谷物中提取的淀粉，其中a和b选定为相同的突变体，B和A选定为相同的野生型。
15.从谷物中提取的淀粉，所述谷物具有4剂量的突变体和2剂量的野生型，使得其基因型在每一方面(side)都有野生型。
16.从谷物中提取的淀粉，所述谷物具有3剂量的突变体和3剂量的野生型，使得其基因型在每一方面都有野生型。
17.单突变体雄性不育植物，该突变体选自ae、wx、sh、bt、h、su、fl、op、du。
18.含有水和有效量淀粉的溶胶，所述淀粉提取自具有蜡状的、蜡状的、直链淀粉增补剂(amylose extender)的基因型植物。
19.根据权利要求18的溶胶，其中所存在的淀粉重量百分比是大约1-20％。
20.根据权利要求18的溶胶，其中所述植物是玉米。
21.根据权利要求18的溶胶，其中所述淀粉是冷水可溶性的。
22.根据权利要求18的溶胶，其中所述淀粉是颗粒状。
23.根据权利要求21的溶胶，其中所述淀粉是从玉米中提取的。
24.一种食料，含有食料和作为必要成分的有效量淀粉，所述淀粉是从具有蜡状的、蜡状的、直链淀粉增补剂基因型的含淀粉植物中提取。
25.根据权利要求24的食料，其中所述淀粉为食料重量的大约0.1-10％。
26.根据权利要求24的食料，其中所述淀粉是从玉米中提取的。
27.含淀粉溶胶的制备方法，包括下列步骤形成含有水和有效量淀粉的浆，所述淀粉从具有蜡状的、蜡状的、直链淀粉基因型的含淀粉植物中提取，蒸煮所述淀粉，使之凝胶化。
28.根据权利要求27的方法，其中所述有效量浆重量的约1-20％。
29.根据权利要求27的方法，其中所述淀粉是从玉米中提取的。
30.食料增稠的方法，包括下列步骤将食料与有效量的淀粉混合，所述淀粉从具有蜡状的、蜡状的、直链淀粉增补剂基因型的含淀粉植物中提取，蒸煮所述食料，使之增稠。
31.根据权利要求30的方法，其中所述淀粉从玉米中提取。
32.根据权利要求30的方法，其中所述淀粉的量为所述食料重量的大约0.1-10％。
33.制作含有明胶之食料的改进方法，所述的改进包括用权利要求18的溶胶替代至少一部分所述食料中的明胶。
34.制作含有天然树胶食料的改进方法，所述的改进包括用权利要求18的溶胶替代至少一部分天然树胶。
35.根据权利要求34的方法，其中所述食料为树胶糖果、胶状甜点、糖皮或涂味品。
全文摘要
本发明涉及具有改变植物中正常淀粉合成途径的基因组物质的转基因植物或突变植物。更确切地说，本发明涉及具有产生大量新型淀粉之基因型的植物。具体地说，本发明涉及具有两个或多个野生型基因的杂合基因型(例如Aa/Bb)之胚和具有所述基因的杂合基因型(例如AAa/BBb或AAa/bbB或aaA/Bbb或aaA/bbB)之胚乳的谷类及其生产的淀粉。
文档编号A01H5/00GK1156951SQ95194690
公开日1997年8月13日 申请日期1995年6月20日 优先权日1994年6月21日
发明者P·L·基林, F·卡茨, 张铭堂, R·豪伯, R·弗里德曼 申请人:曾尼卡有限公司, 美国玉米产品公司