专利名称：超氧化物歧化酶在昆虫病毒杀虫中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶类即超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)的用途，尤其涉及到在昆虫病毒杀虫中的用途。
背景技术：
1.超氧化物歧化酶的性质超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)简称SOD，1969年McCord和Fridovich根据血铜蛋白、肝铜蛋白和脑铜蛋白都有O2-歧化活性，而将这种酶命名为超氧化歧化酶。根据结合金属离子的不同分为3类，即Cu/Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD。
近年来对SOD的物化特性的系统研究结果表明SOD属酸性蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。将三类SOD的主要物化特性列于下表。Joan等人指出不同来源的Cu/Zn-SOD具有较高的同源性，它们的物化特性也很相似，据推测它们可能由同一原始酶进化而来。不同来源的Mn-SOD和Fe-SOD也具有相似的物理性质和较高的同源性，它们可能由另一原始酶进化而成。
三类SOD分子结构均为二聚体或四聚体，其活性中心都含有金属离子，金属离子的存在与否直接影响酶活，如采用物理或化学方法除去，则酶活丧失；如重新加上金属离子，则酶活又恢复。SOD是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，它的作用底物是氧自由基O2-，催化其发生歧化反应，从而清除氧自由基。其催化机理是
总反应式为2.昆虫病毒杀虫剂的应用现状减少农作物虫害是提高粮食产量的主要措施之一。国内外对害虫的防治主要依靠化学农药，但是近年来因为化学农药大量不规范使用，致使害虫的抗药性逐渐增强，同时农药残留对环境产生了负面影响，严重威胁了人类的健康和生存环境。
近几十年，随着人们对环境保护意识的增强，农药的研制和发展面临着强劲的挑战。世界各国开始采取措施，促进农药向安全、高效、与环境相容的方向发展欧美等国家对蔬菜等残留有害物质含量都有严格要求，我国城乡居民对农产品特别是蔬菜的安全性问题也愈来愈重视。因此减少使用高毒农药并积极推广无公害种植技术就显得十分迫切，这就为采用生物技术防治农作物病虫害提供了快速发展的可能性。
昆虫病毒作为农业、林业和卫生害虫的控制手段，具有一些独特的优点宿主特异性高，不影响害虫的天敌；引起害虫再猖獗的可能性小；不会污染环境，对人畜安全。因为昆虫病毒是自然界本来存在的，特别是杆状病毒对两栖类、鱼类、鸟类及哺乳动物无任何毒性、致病性。而且昆虫病毒使用后作用明显，不仅病虫本身就是病毒生产的“小工厂”，在田间自动扩大传播面，而且病毒还可以垂直传播，杀灭次代害虫，这是化学农药所无法相比的；昆虫病毒制剂生产工艺不复杂，使用方便，成本低廉，适于推广，在害虫生物防治方面越来越受到重视。迄今为止发现的昆虫病毒已超过1000多株，涉及11个目900多种昆虫，已有20多个国家对30多种病毒杀虫剂进行了登记、注册、生产和应用。随着人类生活水平的不断提高，昆虫病毒杀虫剂将成为国内外害虫防治的主要手段之一。
由于昆虫病毒在害虫体内有一个增值的过程，杀虫时间较慢，并且对高龄的害虫幼虫毒性较低，这就限制了它在更大范围内的应用。随着分子生物学和基因工程技术的发展，科学家们正在利用基因工程手段昆虫病毒进行改良，并已取得一定的进展。室内生物活性测定和田间试验结果表明，重组昆虫病毒的杀虫速度和应用效果比野生型病毒有明显提高。目前各种重组昆虫病毒正在中请商业化生产的临时登记阶段，估计不久就有商品化产品问世。
然而，无论野生型还是重组昆虫病毒，其田间效果都不如实验室生测效果显著，主要原因是病毒在野外环境中残留时间过短。紫外线照射、露水、pH值、农作物本身都是影响病毒粒子存活的因素。为了使昆虫病毒杀虫剂最大限度地发挥效果，人们使用了各种光保护剂、病毒悬浮剂和增效剂。现已有多种技术手段应用到病毒杀虫剂的实际生产中。
1998年美国的Hoover等人发现，在棉花、番茄等作物上昆虫病毒的效果相对弱于其它作物，而这种现象与氧自由基的存在有关；一些植物，如棉花、番茄等，叶表存在某种腺体，能分泌多酚类物质，产生氧自由基，使昆虫病毒粒子表面的多角体或其它保护结构丧失功能。Hoover等人利用能产生氧自由基的过氧化物酶(Peroxide，POD)进行生测实验，证明氧自由基能使病毒粒子很快失活，因而部分抑制某种害虫的病毒病发生。
发明内容
本发明的目的在于提供超氧化物歧化酶SOD的新用途，即超氧化物歧化酶在昆虫病毒杀虫中的新应用。实际上提供一种新型增效剂即超氧化物歧化酶SOD，该物质能增强昆虫病毒杀虫剂在田间的杀虫效果。
本发明还涉及一种超氧化物歧化酶与昆虫病毒混合后作为杀虫剂在防治棉铃虫中的应用。
本发明还涉及一种利用病毒携带超氧化物歧化酶基因构建重组病毒作为重组病毒杀虫剂在防治害虫中的应用。
本发明还涉及利用棉铃虫病毒携带超氧化物歧化酶基因构建重组棉铃虫病毒在棉花田间防治棉铃虫的应用。
为了达到上述目的，利用能消除自由基的超氧化物歧化酶进行了棉铃虫杆状病毒的生测实验，结果证明SOD能增强棉铃虫病毒在棉花叶片上对棉铃虫的感染率。
在实际应用中，将SOD酶以某种浓度(例如，在杆状病毒HaSNPV中，添加0.25单位/μL的SOD)添加到昆虫病毒杀虫剂中；或者从减少成本的角度出发、利用分子生物学技术构建可以表达SOD酶的重组病毒，直接在田间使用，具有比野生型病毒杀虫剂更长的存活时间，因而具有更好的杀虫效果。
本发明与现有的技术相比，具有以下优点和效果用一定量单位的SOD酶与昆虫病毒混和后感染取食棉花叶片的害虫幼虫，其杀虫率高于无SOD酶混和的昆虫病毒。该物质可用于增强昆虫病毒杀虫剂在田间的杀虫效果。实验证明SOD可以增加棉铃虫病毒对饲养在棉叶上的棉铃虫幼虫感染活性。SOD可以直接作为增效剂添加到昆虫病毒杀虫剂中使用，也可以通过分子生物学方法构建超量表达SOD酶的重组病毒，该重组病毒作为杀虫剂效果好子于一般昆虫病毒杀虫剂。
图1为一种棉铃虫死亡率的示意图。
SOD增加HaSNPV对棉铃虫2龄幼虫的感染能力。HaSNPV浓度为1×105PIB/mL。
具体实施例方式
实施例1连续三天分别用0.025单位/μL及0.25单位/μL的超氧化物歧化酶SOD与1×105PIB/mL的棉铃虫单核衣壳多角体病毒(Helicoverpa armigera single-nucleocapsid polyhedrovirus，HaSNPV)混合，滴加10μL于新鲜棉花叶片上，或用1×105PIB/mL的HaSNPV单独滴加；取72只(符合统计标准)二龄棉铃虫幼虫到叶片上，让其取食，28℃培养。第四天转移至新鲜的人工饲料上(保证其化蛹所需营养)，培养至化蛹，每天记录死亡率。设立对照组；数据用统计学方法进行方差分析。实验重复3次。结果表明0.025单位/μL及0.25单位/μL的SOD分别增加了HaSNPV对棉铃虫的感染性24.5％和43.1％(商品化SOD来自Roche公司，从小牛血清中提取，为Cu/Zn-SOD)。
实施例2棉铃虫单核衣壳多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid polyhedrovirus，HaSNPV)是一种对棉铃虫专一性的昆虫病毒。其基因组内含sod基因，大小480bp，编码Cu/Zn-SOD；利用多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增sod基因两端约1k的核苷酸序列作为同源臂，和标记基因LacZ共同克隆到pBlueScript ii plus载体上，插入sod基因和HaSNPV内源启动子p10，然后该载体与HaSNPV野生型共转染真核细胞HzAM1，经过空斑挑选、纯化，得到超表达SOD酶的重细病毒。该病毒在田间存活时间会长于野生型病毒，用该病毒制作的昆虫病毒杀虫剂的田间效果会强于野生型病毒杀虫剂。
权利要求
1.一种超氧化物歧化酶在昆虫病毒杀虫中的应用。
2.一种超氧化物歧化酶与昆虫病毒混合后作为杀虫剂在防治棉铃虫中的应用。
3.一种利用病毒携带超氧化物歧化酶基因构建重组病毒作为重组病毒杀虫剂在防治害虫中的应用。
4.一种利用棉铃虫病毒携带超氧化物歧化酶基因构建重组棉铃虫病毒在棉花田间防治棉铃虫的应用。
全文摘要
本发明公开了一种超氧化物歧化酶在昆虫病毒杀虫中的应用，超氧化物歧化酶可以增强棉铃虫病毒在棉花叶片上的感染力。该物质可用于增强昆虫病毒杀虫剂在田间的杀虫效果。实验证明SOD可以增加棉铃虫病毒对饲养在棉叶上的棉铃虫幼虫感染活性。SOD可以直接作为增效剂添加到昆虫病毒杀虫剂中使用，也可以通过分子生物学方法构建超量表达SOD酶的重组病毒，该重组病毒作为杀虫剂效果好于一般昆虫病毒杀虫剂。
文档编号A01N63/00GK1423945SQ0215412
公开日2003年6月18日 申请日期2002年12月24日 优先权日2002年12月24日
发明者孙修炼, 周明哲, 胡志红 申请人:中国科学院武汉病毒研究所